Artykuł metodologiczny

Wyznaczanie płaszczyzn wiązania lodu przez białka zapobiegające zamarzaniu za pomocą powinowactwa do płaszczyzny lodu opartej na fluorescencji

DOI:

10.3791/51185

⸱

15 stycznia 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Porter Neuroscience Research Center, 3Research Institute of Genome-Based Biofactory, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 4The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food and Environment, Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition, The Hebrew University of Jerusalem

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka przeciw zamarzaniu (AFP) wiążą się z określonymi płaszczyznami lodu, aby zapobiec lub spowolnić wzrost lodu. Analiza powinowactwa do płaszczyzny lodu oparta na fluorescencji (FIPA) jest modyfikacją oryginalnej metody trawienia lodu do oznaczania płaszczyzn lodu związanych z AFP. AFP są znakowane fluorescencyjnie, włączane do makroskopowych pojedynczych kryształków lodu i wizualizowane w świetle UV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka przeciw zamarzaniu (AFP) są wyrażane w różnych organizmach odpornych na zimno, aby zapobiec lub spowolnić wewnętrzny wzrost lodu. AFP wiążą się z określonymi płaszczyznami lodu poprzez ich wiążące lód powierzchnie. Analiza powinowactwa do płaszczyzny lodu na podstawie fluorescencji (FIPA) jest zmodyfikowaną techniką stosowaną do określania płaszczyzn lodu, do których wiążą się AFP. FIPA opiera się na oryginalnej metodzie trawienia lodu do określania płatów lodowych związanych z AFP. Daje wyraźniejsze obrazy w skróconym czasie eksperymentu. W analizie FIPA AFP są znakowane fluorescencyjnie znacznikiem chimerycznym lub barwnikiem kowalencyjnym, a następnie powoli włączane do makroskopowego pojedynczego kryształu lodu, który został wstępnie uformowany w półkulę i zorientowany w celu wyznaczenia osi a i c. Półkula lodowa związana z AFP jest obrazowana w świetle UV w celu wizualizacji płaszczyzn związanych z AFP za pomocą filtrów blokujących niespecyficzne światło. Etykietowanie fluorescencyjne AFP umożliwia monitorowanie adsorpcji AFP w lodzie w czasie rzeczywistym. Stwierdzono, że etykiety nie mają wpływu na płaszczyzny, do których odnoszą się AFP. Analiza FIPA wprowadza również opcję wiązania więcej niż jednego różnie oznaczonego AFP na tym samym pojedynczym kryszku lodu, aby pomóc w rozróżnieniu ich płaszczyzn wiązania. Te zastosowania FIPA pomagają nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób AFP wiążą się z lodem, aby zatrzymać jego wzrost i dlaczego wiele organizmów wytwarzających AFP wykazuje ekspresję wielu izoform AFP.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja białek zapobiegających zamarzaniu (AFP) jest ważnym mechanizmem przetrwania niektórych organizmów żyjących w środowisku pełnym lodu. Do niedawna uważano, że jedyną funkcją AFP jest zapobieganie lub spowalnianie wzrostu wewnętrznych kryształków lodu, które blokują krążenie, powodują uszkodzenie tkanek i stres osmotyczny. Organizmy, które nie tolerują żadnego stopnia zamarzania, takie jak ryby, wyrażają AFP, aby całkowicie zahamować wzrost kryształków lodu1. Inne, takie jak trawa, są odporne na zamarzanie i wyrażają AFP, aby zahamować rekrystalizację lodu, co zmniejsza tworzenie się dużych kryształków lodu w ich tkankach2. Stabilizacja membran w niskiej temperaturze to kolejna funkcja, która została zaproponowana dla AFPs3. Ostatnio zaproponowano nową rolę AFP antarktycznej bakterii Marinomonas primoryensis z pokrytych lodem słonawych jezior4. Ten AFP jest częścią znacznie większego białka adhezynowego5, które, jak się uważa, wiąże bakterię z lodem w celu uzyskania lepszego dostępu do tlenu i składników odżywczych6. Wiadomo, że inne drobnoustroje wydzielają AFP, które mogą zmieniać strukturę lodu, w którym żyją.

AFP zostały znalezione u niektórych ryb, owadów, roślin, glonów, bakterii, okrzemek i grzybów. Mają niezwykle rozbieżne sekwencje i struktury zgodne z ich ewolucją od różnych przodków przy różnych okazjach; A jednak wszystkie one wiążą się z lodem i hamują jego wzrost poprzez mechanizm hamowania adsorpcji8. Każdy AFP ma określoną powierzchnię, która działa jako miejsce wiązania lodu (IBS). Zazwyczaj identyfikowano je za pomocą ukierunkowanej na miejsce mutagenezy pozostałościpowierzchniowych 9-11. Przypuszcza się, że IBS układa cząsteczki wody w wzór podobny do lodu, który pasuje do określonych płaszczyzn lodu. W ten sposób AFP tworzy swój ligand przed związaniem się z nim5, 12. Płaszczyzny lodu mogą być definiowane przez ich indeksy Millera, a różne AFP mogą wiązać się z różnymi płaszczyznami. Tak więc AFP typu I z flądry zimowej wiąże się z 20-21 płaszczyznami piramidalnymi13, AFP typu III wiąże zarówno pryzmat pierwotny, jak i płaszczyzny piramidalne za pomocą złożonej powierzchni wiążącej lód11,14, podczas gdy AFP pączków świerkowych, nadaktywny AFP, wiąże się jednocześnie zarówno z płaszczyzną pierwotną, jak i podstawną15,16. Inne nadpobudliwe AFP, takie jak MpAFP, wiążą się z wieloma płaszczyznami lodu, o czym świadczy ich pełne pokrycie półkul pojedynczych kryształów lodu5,17. Przypuszcza się, że zdolność nadpobudliwych AFP do wiązania płaszczyzny podstawnej, jak również innych płaszczyzn, może odpowiadać za ich 10-krotnie wyższą aktywność w porównaniu z umiarkowanie aktywnymi AFP18. Chociaż skuteczność nadpobudliwych AFP jest dobrze udokumentowana, ich zdolność do wiązania się z wieloma płaszczyznami lodu nadal nie jest poznana.

Oryginalna metoda wyznaczania płaszczyzn lodu związanych z AFP została opracowana przez Charlesa Knighta13,19. W tej metodzie makroskopowy pojedynczy kryształ lodu jest montowany na wydrążonym metalowym pręcie (zimny palec) i formowany w półkulę poprzez zanurzenie go w półkulistym kubku wypełnionym odgazowaną wodą. Następnie półkula jest zanurzana w rozcieńczonym roztworze AFP, a warstwa lodu jest wyrastana z roztworu AFP na półkulę kryształków lodu przez kilka godzin, kontrolowana przez temperaturę glikolu etylenowego krążącego w zimnym palcu. Kryształki lodu wyjmuje się z roztworu, odłącza od zimnego palca i umieszcza w zamrażarce o temperaturze od -10 do -15 °C. Powierzchnię zeskrobuje się ostrym ostrzem w celu usunięcia zamrożonej warstwy powierzchniowej roztworu białka zapobiegającego zamarzaniu, a kryształ lodu pozostawia się do sublimacji przez co najmniej 3 godziny. Po sublimacji płaszczyzny lodu związane AFP mogą być widoczne jako białe wytrawione wzory pochodzące z resztkowego białka. Półkula lodowa może być zorientowana zgodnie z osiami c i a, aby zlokalizować płaszczyzny podstawy i pryzmatu lodu oraz określić wskaźniki Millera wytrawionych plam.

Tutaj opisujemy modyfikację oryginalnej metody wyznaczania płaszczyzn lodu związanych z AFP, metody, którą nazywamy powinowactwem do płaszczyzny lodu opartą na fluorescencji (FIPA)11. AFP są znakowane fluorescencyjnie albo znacznikiem chimerycznym, takim jak białko zielonej fluorescencji (GFP)11,16,17,20, albo barwnikiem fluorescencyjnym związanym z AFP5,21. Znakowane fluorescencyjnie AFP są adsorbowane do pojedynczego kryształu lodu i przerastane przy użyciu tej samej procedury eksperymentalnej, co oryginalne eksperymenty z trawieniem lodu. Stopień wiązania AFP z rosnącą półkulą lodową można monitorować przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą lampy ultrafioletowej (UV). Po zakończeniu eksperymentu półkula może zostać bezpośrednio zdjęta z zimnego palca i zobrazowana, bez sublimacji. Jednak w razie potrzeby półkulę można pozostawić do sublimacji, aby uwidocznić tradycyjną trawę lodu. Modyfikacje wprowadzone do metodyki FIPA skracają tradycyjny protokół trawienia lodem o kilka godzin. Ponadto istnieje możliwość jednoczesnego obrazowania kilku AFP, z których każdy ma inną etykietę fluorescencyjną, w celu wizualizacji nakładających się wzorów płaszczyzn lodu związanych z AFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uprawa pojedynczych kryształków lodu

  1. Weź czystą metalową patelnię (15 cm średnicy, 4.5 cm wysokości), która pasuje do kąpieli chłodzącej z glikolem etylenowym i może na niej unosić się.
  2. Przygotuj cylindryczne formy z polichlorku winylu (PVC) (średnica 4,5 cm, 3-4 cm wysokości, 4 mm grubości), piłując odcinki z rury.
    1. Wytnij nacięcie (1 mm szerokości, 2 mm wysokości) z jednej strony (Rysunek 1A).
    2. Przygotuj tyle foremek, ile wygodnie zmieści się na patelni (Rysunek 1B).
      Uwaga: Badanie wykazało, że alkohol poliwinylowy (PVA) może wpływać na zarodkowanie lodu22. Jednak w naszym systemie PVC z otwartą formą nie spotkaliśmy się z problemami tworzenia się nietypowego lodu.
  3. Nałóż cienką warstwę smaru próżniowego na dolny pierścień powierzchniowy każdej formy, który jest powierzchnią z wyciętym nacięciem. Uszczelnij tę natłuszczoną, karbowaną powierzchnię na metalowej patelni z nacięciami skierowanymi od środka patelni. Uważaj, aby nie wypełnić ani nie zatkać nacięć smarem.
  4. Dodaj 0,22 μm przefiltrowaną i odgazowaną/zdejonizowaną wodę na środek patelni, ale poza foremkami i pozwól, aby woda powoli wchodziła do form przez nacięcia. Uważaj, aby nie wprowadzić żadnych bąbelków. Warstwa wody powinna mieć głębokość około 5 mm.
  5. Umieścić patelnię w łaźni glikolu etylenowego o kontrolowanej temperaturze, schłodzonej do temperatury -0,5 °C. Patelnia powinna być idealnie wypoziomowana. W razie potrzeby dodaj obciążniki balastowe po bokach patelni.
  6. Gdy patelnia i woda osiągną temperaturę -0,5 °C, dodaj mały kawałek lodu na środek patelni, na zewnątrz foremek.
    1. Spowoduje to zarodkowanie wzrostu lodu w przechłodzonej wodzie przez patelnię i do form. Małe wcięcie na dnie każdej formy pozwala na rozprzestrzenianie się tylko jednego kryształu lodu, co daje pojedynczy kryształ lodu w każdej formie.
    2. Inkubuj przez noc, aby utworzyć warstwę lodu.
  7. Przez następne trzy dni dodawać 13 ml odgazowanej/dejonizowanej wody o temperaturze 4 °C do każdej formy raz dziennie i obniżać temperaturę kąpieli glikolu etylenowego po każdym dodaniu do -0,8 °C pierwszego dnia, do -1,1 °C drugiego dnia i do -1,5 °C trzeciego dnia.
    1. Inkubuj w tych temperaturach przez noc.
    2. Czwartego dnia foremki powinny być całkowicie wypełnione lodem.
  8. Zdejmij foremki z patelni, wypchnij kryształki lodu z foremek i przechowuj na czystej powierzchni, takiej jak łódka wagowa, w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez około 1 godzinę przed użyciem.
  9. Zamiast przygotowywać wiele małych pojedynczych kryształków lodu, duży pojedynczy kryształ lodu o objętości kilku litrów można przygotować w inkubatorze o stałej temperaturze, jak opisano w Knight23. Duże kryształki lodu mogą być przechowywane przez rok lub dłużej, jeśli są przechowywane pod przykryciem w zamrażarce o temperaturze od -15 do -20 °C. W razie potrzeby porcje monokryształu można wycinać z bloku lodu za pomocą piły.

2. Określanie osobliwości i orientacji kryształu lodu

  1. Określ, czy lód wyrzucony z formy jest pojedynczym kryształem, obserwując w zamrażarce, pomiędzy dwoma skrzyżowanymi polaroidami (Rysunek 1D).
    1. Jeśli kryształ lodu jest pojedynczy, nie powinny być widoczne żadne pęknięcia ani nieciągłości, a kierunek światła w krysztale lodu nie powinien się zmieniać.
      Uwaga: Jeśli zamrażarka nie jest dostępna, można zamiast niej użyć chłodni we wszystkich wymaganych krokach, zachowując ostrożność, aby pracować szybko i oszczędnie obchodzić się z lodem.
  2. Ze względu na dwójłomność lodu można jednocześnie określić orientację osi c. Skorzystaj z następujących informacji, aby określić orientację:
    1. Gdy oś c jest dokładnie równoległa do padającego światła, teoretycznie żadne światło nie przejdzie przez skrzyżowane polaroidy. Jeśli światło padające jest skierowane nieco dalej od równolegle do osi c, jednolite wielokolorowe widmo światła jest przepuszczane przez kryształ, gdy jest on obracany między skrzyżowanymi polaroidami. Ta jednorodna transmitancja wynika z optycznej nieaktywności lodu Ih wzdłuż jego osi c 24. Płaszczyzna podstawy kryształu lodu jest normalna do osi c.
    2. Gdy oś c jest dalej równoległa do padającego światła, a kryształ lodu obraca się między skrzyżowanymi polaroidami, przechodzące światło będzie zmieniać się w zakresie 0-100% przepuszczalności na każde 90° obrotu kryształu.
    3. Najczęściej oś c będzie normalna do okrągłej płaszczyzny cylindrycznego kryształu lodu.
  3. Określ orientację osi a poprzez wżery lodowe25, które odbywa się poprzez szczelne owinięcie kryształu lodu w folię aluminiową, wbicie małego otworu igłą przez folię w lód na płaszczyźnie podstawowej (normalnej do osi c) i umieszczenie go w próżni na 20 minut.
    1. Zabieg ten spowoduje wytrawienie o sześciokątnej symetrii na płaszczyźnie podstawy, gdzie osie a przebiegają przez wierzchołki sześciobocznej gwiazdy (ryc. 2A).
    2. W razie potrzeby kryształek lodu można wyciąć piłą równoległą lub prostopadłą do jednej strony sześciokąta, aby zamontować go z płaszczyzną pryzmatu pierwotnego lub wtórnego prostopadłą odpowiednio do zimnego palca (rysunek 3).

3. Adsorpcja znakowanych fluorescencyjnie białek przeciw zamarzaniu do pojedynczego kryształu lodu

  1. Zamontuj pojedynczy kryształek lodu na zimnym palcu (Rysunek 1C), najpierw wiercąc wgłębienie w górnej części kryształu. Aby to zrobić, naprzemiennie topiąc lód za pomocą dwóch aluminiowych prętów o nieco innej średnicy, ale podobnej do średnicy zimnego palca, aby utworzyć wnękę, w której może zmieścić się zimny palec.
  2. Schłodzić zimny palec do temperatury -0,5 °C, umieścić w komorze lodowej i przytrzymać kryształek lodu na miejscu, aż przymarznie do metalu (Rysunek 2B). Unikaj pęcherzyków powietrza podczas mocowania kryształu do palca, ponieważ utrudniają one efektywne przenoszenie ciepła z palca do pręta.
  3. Napełnij półkulisty kubek o średnicy około dwukrotnie większej od średnicy kryształu lodu przefiltrowaną wodą dejonizowaną lub buforem, schłodzonym do około 4 °C. Zanurz zimny kryształek lodu oprawiony palcami w kubek i usuń nadmiar wody lub buforu tak, aby górna część kryształka lodu znajdowała się w przybliżeniu na poziomie warstwy cieczy, a lód nie dotykał ścianek kubka.
    1. Przykryj kubek izolacją i obniż temperaturę do -5 °C.
    2. Odczekaj około 1 godziny, aż kryształek lodu uformuje się w półkulę, sprawdzając jego stan mniej więcej co 20 minut (Rysunek 2C).
    3. Lód przyjmie kształt półkulistego kubka poprzez stopienie i wzrost kryształu lodu, ale nigdy nie powinien przerastać, aby dotknąć ścianek kubka. Między ścianą a półkulą powinna być co najmniej 1 cm szczelina, a zimny palec nie powinien wystawać z lodu.
  4. Wyjmij kubek z kryształki lodu i dodaj fluorescencyjny roztwór białka do końcowej objętości 25-30 ml i pożądanego stężenia analitycznego, uważając, aby całkowita objętość płynu w kubku pozostała niezmieniona. Typowe stężenie AFP wynosi 0,1 mg/ml.
    1. Ponownie zanurz kryształki lodu w kubku tak, aby górna część kryształka lodu znajdowała się na poziomie cieczy, a kryształki lodu nie dotykały ścianek kubka (Rysunek 2D).
    2. Obniż temperaturę zimnego palca do -8 °C i pozwól roztworowi białka zamarznąć w kryształkach lodu przez 2-3 godziny, często mieszając roztwór. Lód utworzony z roztworu białka powinien mieć co najmniej 5 mm przed zatrzymaniem wzrostu lodu.
  5. Wyjmij kryształki lodu z kubka, gdy są nadal przymocowane do zimnego palca. Odłącz lód od tego ostatniego, podgrzewając płyn chłodzący przez zimny palec do temperatury nieco powyżej 0 °C i poczekaj, aż kryształki lodu się stopią.
  6. Umieść kryształ płaską stroną do dołu na czystej powierzchni, takiej jak naczynie wagowe, uważając, aby nie dotknąć nowo powstałego lodu i przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 20 minut przed przekazaniem.

4. Wizualizacja płaszczyzn lodu związanych z białkiem zapobiegającym zamarzaniu

  1. Wizualizacja fluorescencji odbywa się w zaciemnionej zamrażarce lub chłodni, umieszczając kryształ lodu płaską stroną do dołu pod lampami z filtrami wzbudzenia specyficznymi dla długości fali, aby wzbudzić etykietę fluorescencyjną i filtry emisyjne kamery, aby zablokować wszelkie inne niespecyficzne światło. Na podstawie wzoru można oszacować płaszczyzny lodu, które są ograniczone przez AFP (rysunek 4).
  2. Jeśli światła o określonej długości fali nie są dostępne, zamiast tego można użyć kasetonu UV.
  3. Tradycyjne wytrawianie lodu można również wykonać po prostu pozwalając półkuli lodowej sublimować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 3 godziny, po czym resztki białka w proszku mogą stać się widoczne na powierzchni lodu (ryc. 5).
  4. Krok 2.3 można powtórzyć w celu określenia orientacji osi a ukończonej półkuli lodowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie i montaż pojedynczego kryształu lodu to dwa etapy procedury FIPA, w których najczęściej popełniane są błędy. Ustalenie, czy przygotowany kryształ lodu jest pojedynczy, odbywa się poprzez zbadanie go za pomocą skrzyżowanych polaroidów (rysunek 1D), jak opisano w kroku 2.1 sekcji protokołu. Jeśli do analizy FIPA zostanie użyty multikrystaliczny kryształ lodu, wynikiem będzie nieciągłe wiązanie AFP na półkuli bez spójnego wzorca wiązania (rysunek 6B). Jeśli interfejsy kryształ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowanie przez Charlesa Knighta metody trawienia lodu do wyznaczania płaszczyzn lodu związanych z AFP znacznie posunęło naprzód badania nad mechanizmem wiązania lodu przez AFP. Podczas gdy struktury AFP można było rozwiązać za pomocą krystalografii rentgenowskiej26,27 , nie było oczywistej metody dedukowania komplementarnej powierzchni na lodzie, do której wiązały się AFP. Kiedy po raz pierwszy scharakteryzowano AFP typu I z flądry zimowej, postawiono hipotezę, że wiąże się ona z pierwotnymi płaszczyznami p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLD posiada Kanadyjską Katedrę Badawczą w dziedzinie Inżynierii Białek. Praca ta została sfinansowana z grantu Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem dla PLD. Prace te były również wspierane przez dotację na badania naukowe od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) (nr 23310171) oraz przez Japońską Instytucję Rozwoju Technologii Bioorientowanych (BRAIN). Jesteśmy wdzięczni doktorom Chrisowi Marshallowi i Mike'owi Kuiperowi za pionierską pracę, która doprowadziła do powstania FIPA. Jesteśmy również wdzięczni dr Sakae Tsudzie za udostępnienie pomieszczeń do niektórych z tych prac oraz dr Laurie Graham za ustawienie filtrów wzbudzenia i emisji światła fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wanna chłodnicza/cyrkulatory NESLAB RTEThermo ScientificRTE7
Glikol etylenowy, wstępnie zmieszany płyn niezamarzający/płyn chłodzącyCertyfikowany29-3037-0Popularny samochodowy płyn niezamarzający
Zimny palecniedostępnyniedostępny Wykonanena zamówienie z mosiądzu (9 cm długości, 1,5 cm średnicy zewnętrznej)
Półkulisty kubekniedostępny niedostępnyWykonane na zamówienie z żywicy (średnica zewnętrzna 8 cm, średnica wewnętrzna 6 cm)
System oświetlenia o wysokiej podwójnej mocyBadania LightoolsLT-99D2, Illumatools DLS 120 woltów AC, LT-9470FX, LT-9549FXDodatkowe i niestandardowe filtry wzbudzenia można kupić w Lightools Aparat badawczy
Filtry emisyjne CanonEOS 50D
BadaniaLightoolsLT-9EFPVG, LT-9GFPVG, LT-9RFPVGAdapter pierścienia filtra może być wymagany do zamontowania filtra na obiektywie aparatu
, wyjściowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Devries, A. L. Antifreeze peptides and glycopeptides in cold-water fishes. Annu. Rev. Physiol. 45, 245-260 (1983).
  2. Sidebottom, C., et al. Phytochemistry - heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256-256 (2000).
  3. Tomczak, M. M., et al. A mechanism for stabilization of membranes at low temperatures by an antifreeze protein. Biophys. J. 82 (2), 874-881 (2002).
  4. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A. Hyperactive Ca-dependent antifreeze protein in an antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245 (1), 67-72 (2005).
  5. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Davies, P. L. Anchored clathrate waters bind antifreeze proteins to ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (18), 7363-7367 (2011).
  6. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a bacterial antifreeze protein as an adhesin with ice-binding activity. Plos One. 7 (11), (2012).
  7. Raymond, J. A. Algal ice-binding proteins change the structure of sea ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), (2011).
  8. Raymond, J. A., Devries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (6), 2589-2593 (1977).
  9. Baardsnes, J., et al. New ice-binding face for type i antifreeze protein. FEBS Lett. 463 (1-2), 87-91 (1999).
  10. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
  11. Garnham, C. P., et al. Compound ice-binding site of an antifreeze protein revealed by mutagenesis and fluorescent tagging. Biochemistry. 49 (42), 9063-9071 (2010).
  12. Nutt, D. R., Smith, J. C. Dual function of the hydration layer around an antifreeze protein revealed by atomistic molecular dynamics simulations. J. Am. Chem. Soc. 130 (39), 13066-13073 (2008).
  13. Knight, C. A., Cheng, C. C., Devries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal-surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  14. Antson, A. A., et al. Understanding the mechanism of ice binding by type iii antifreeze proteins. J. Mol. Biol. 305 (4), 875-889 (2001).
  15. Graether, S. P., et al. Beta-helix structure and ice-binding properties of a hyperactive antifreeze protein from an insect. Nature. 406 (6793), 325-328 (2000).
  16. Pertaya, N., Marshall, C. B., Celik, Y., Davies, P. L., Braslavsky, I. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: Basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys. J. 95 (1), 333-341 (2008).
  17. Middleton, A. J., et al. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416 (5), 713-724 (2012).
  18. Scotter, A. J., et al. The basis for hyperactivity of antifreeze proteins. Cryobiology. 53 (2), 229-239 (2006).
  19. Knight, C. A., Wierzbicki, A., Laursen, R. A., Zhang, W. Adsorption of biomolecules to ice and their effects upon ice growth. 1. Measuring adsorption orientations and initial results. Crys. Growth Des. 1 (6), 429-438 (2001).
  20. Hakim, A., et al. Crystal structure of an insect antifreeze protein and its implications for ice binding. J. Biol. Chem. 288 (17), 12295-12304 (2013).
  21. Garnham, C. P., Nishimiya, Y., Tsuda, S., Davies, P. L. Engineering a naturally inactive isoform of type iii antifreeze protein into one that can stop the growth of ice. FEBS Lett. 586 (21), 3876-3881 (2012).
  22. Holt, C. B. The effect of antifreeze proteins and poly(vinyl alcohol) on the nucleation of ice: A preliminary study. Cryo Letters. 24 (5), 323-330 (2003).
  23. Knight, C. A. A simple technique for growing large, optically ''perfect'' ice crystals. J. Glac. 42 (142), 585-587 (1996).
  24. Hobbs, P. V. Ice physics. , Clarendon Press. Oxford. 200-248 (1974).
  25. Knight, C. Formation of crystallographic etch pits on ice, and its application to the study of hailstones. J. Appl. Meteorol. 5 (5), 710-714 (1966).
  26. Yang, D. S., Sax, M., Chakrabartty, A., Hew, C. L. Crystal structure of an antifreeze polypeptide and its mechanistic implications. Nature. 333 (6170), 232-237 (1988).
  27. Sicheri, F., Yang, D. S. Ice-binding structure and mechanism of an antifreeze protein from winter flounder. Nature. 375 (6530), 427-431 (1995).
  28. Devries, A. L. Role of glycopeptides and peptides in inhibition of crystallization of water in polar fishes. Philos. T Roy. Soc. B. 304 (1121), 575-588 (1984).
  29. Pertaya, N., et al. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92 (10), 3663-3673 (2007).
  30. Kondo, H., et al. Ice-binding site of snow mold fungus antifreeze protein deviates from structural regularity and high conservation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (24), 9360-9365 (2012).
  31. Mok, Y. F., et al. Structural basis for the superior activity of the large isoform of snow flea antifreeze protein. Biochemistry. 49 (11), 2593-2603 (2010).
  32. Takamichi, M., Nishimiya, Y., Miura, A., Tsuda, S. Fully active qae isoform confers thermal hysteresis activity on a defective sp isoform of type iii antifreeze protein. FEBS J. 276 (5), 1471-1479 (2009).
  33. Bar-Dolev, M., Celik, Y., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. New insights into ice growth and melting modifications by antifreeze proteins. J. R. Soc. Interface. 9 (77), 3249-3259 (2012).
  34. Celik, Y., et al. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (4), 1309-1314 (2013).
  35. Garnham, C. P., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Novel dimeric beta-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC Struct. Biol. 11, (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Antifreeze ProteinsIce Binding PlanesFluorescence based Ice Plane AffinityIce Crystal GrowthProtein LabelingIce Hemisphere FormationCold Room ImagingWavelength Specific FiltersIce Plane VisualizationProtein Solution Freezing

Powiązane artykuły