Proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego

Podsumowanie

Analiza proteomu nabłonka czuciowego ślimaka może być trudna ze względu na jego mały rozmiar oraz dlatego, że białka błonowe są trudne do wyizolowania i zidentyfikowania. Zarówno białka błonowe, jak i rozpuszczalne można zidentyfikować, łącząc wiele metod preparatywnych i technik separacji wraz ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.

Streszczenie

Proteomika to powszechnie stosowane podejście, które może dostarczyć wglądu w złożone systemy biologiczne. Nabłonek czuciowy ślimaka zawiera receptory, które przekształcają energię mechaniczną dźwięku w energię elektrochemiczną przetwarzaną przez obwodowy i ośrodkowy układ nerwowy. Opracowano kilka technik proteomicznych do badania ucha wewnętrznego ślimaka, takich jak dwuwymiarowa elektroforeza żelowa różnicowa (2D-DIGE), mikromacierz przeciwciał i spektrometria mas (MS). MS jest najbardziej wszechstronnym i wszechstronnym narzędziem w proteomice, a w połączeniu z metodami separacji może zapewnić dogłębny proteom próbek biologicznych. Metody separacji w połączeniu ze stwardnieniem rozsianym mają zdolność wzbogacania próbek białek, wykrywania białek o niskiej masie cząsteczkowej i białek hydrofobowych oraz identyfikacji białek o niskiej liczebności poprzez zmniejszenie zakresu dynamiki proteomu. Do całego lizatu lub frakcjonowanego lizatu białkowego można zastosować różne strategie trawienia w celu zwiększenia pokrycia sekwencji peptydów i białek. Wykorzystanie różnych technik separacji, w tym silnej wymiany kationowej (SCX), odwróconej fazy (RP) i elektroforezy uwięzionej w żelu frakcji ciekłej (GELFrEE) może być stosowane w celu zmniejszenia złożoności próbki przed analizą MS w celu identyfikacji białka.

Wprowadzenie

Proteomika to badanie złożonych systemów biologicznych poprzez analizę ekspresji, funkcji, modyfikacji i interakcji białek¹. Do analizy proteomu ucha wewnętrznego wykorzystano kilka metod, w tym mikromacierz^{przeciwciał 2}, dwuwymiarową elektroforezę żelową^3-5 i DIGE⁶. Jednak tylko ograniczona liczba białek została zidentyfikowana i scharakteryzowana^2,7-10, w porównaniu z ponad 10 000 genów i wyrażonych znaczników sekwencji (EST) zidentyfikowanych w uchu wewnętrznym^11,12, SM jest najczęściej stosowaną i wszechstronną techniką w proteomice do charakteryzacji białek. Analiza złożonych próbek proteomicznych, takich jak ślimak, może być trudna. Jednak połączenie wielu technik separacji ze stwardnieniem rozsianym umożliwia identyfikację większej liczby peptydów i białek, ze względu na zwiększony zakres stężeń dynamicznych i pojemność szczytową¹³. Chromatografia wielowymiarowa redukuje wysoce złożone mieszaniny białek, umożliwiając zastosowanie różnych mechanizmów adsorpcji. Istnieją dwa powszechnie stosowane podejścia do analizy proteomu stwardnienia rozsianego: proteomika typu shotgun i proteomika oddolna. W proteomice typu shotgun mieszanina nienaruszonych białek jest trawiona enzymatycznie i rozdzielana za pomocą chromatografii wielowymiarowej z silną chromatografią kationowymienną (SCX), a następnie chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami (RPLC)^14,15. Rozdzielone peptydy poddaje się tandemowemu przeszukiwaniu MS i baz danych¹⁵. Główną zaletą tej techniki jest to, że w jednej analizie można zidentyfikować tysiące białek, a technika ta jest lepiej dostosowana do białek błonowych.

W podejściu oddolnym, mieszanina białek jest rozdzielana, zwykle przez jedno- lub dwuwymiarową elektroforezę, a poszczególne pasma białkowe lub plamki są wycinane i trawione za pomocą enzymu takiego jak trypsyna, co zwykle prowadzi do powstania wielu peptydów. Jednak innym, nowszym podejściem elektroforetycznym, stosowanym w proteomice oddolnej, jest GELFrEE. Technika ta frakcjonuje próbki białek w fazie ciekłej i sprawia, że są one mniej złożone przed analizą. Technika ta jest powtarzalna, zapewnia wysoki odzysk białka i zmniejsza dystrybucję białek o dużej obfitości w złożonych próbkach białek¹⁶. Peptydy, powstałe z oddzielonych białek, są analizowane przez MS za pomocą odcisków palców masy peptydowej lub tandemu MS (MS/MS), w celu stworzenia znaczników sekwencji do przeszukiwania bazy danych^17-19. Niektóre z głównych zalet stosowania podejścia oddolnego to możliwość uzyskania separacji w wysokiej rozdzielczości i kompleksowe pokrycie białkami. Proteomika oddolna jest najczęściej stosowaną techniką w proteomice²⁰, stąd dostępnych jest kilka narzędzi bioinformatycznych. Ponadto białka można rozdzielić w złożonej mieszaninie przed trawieniem, dzięki czemu istnieje większa szansa na identyfikację.

Jednym z głównych wyzwań związanych z używaniem ucha wewnętrznego do analizy proteomicznej jest jego mały rozmiar, ograniczona dostępność i różnorodność typów komórek²¹. Ponadto kluczowymi białkami, które wyróżniają jego funkcjonalność, takimi jak kanały jonowe, transportery i receptory, są białka błonowe, które mogą być trudne do wyizolowania²². W związku z tym przygotowanie próbki wspomagane filtrem (FASP) jest korzystne w analizach proteomicznych tkanek, które są ograniczone do ekstrakcji białek i które wymagają detergentów do rozpuszczania błon²³. Filtrowanie to pozwala na analizę MS białek błonowych i rozpuszczalnych oraz na zdolność do izolowania peptydów z zanieczyszczeń o niskiej masie cząsteczkowej^23,24.

Obecny protokół opisuje powszechnie stosowane podejścia proteomiczne, które są łączone i modyfikowane w celu analizy białek rozpuszczalnych i błonowych oraz maksymalizacji liczby identyfikatorów białek z nabłonka czuciowego ślimaka. Opiszemy stosowanie proteomiki typu shotgun z wielotrawieniem FASP, chromatografią jonowymienną, MS o wysokiej rozdzielczości i analizą danych. Ponadto opiszemy proteomikę oddolną z GELFrEE, multi-digestionem FASP, stwardnieniem rozsianym o wysokiej rozdzielczości i analizą danych.

Protokół

Oświadczenie etyczne

Eksperymenty z użyciem tkanek myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Florydy (Protokoły 3931R, 3482R) zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health.

1. Ekstrakcja białka

1. Wyizolować nabłonek czuciowy ślimaka od 16 30-dniowych (P30) myszy CBA/J i przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. W dniu eksperymentu przemyć tkankę 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować przez 3 minuty przy 1 000 x g i usunąć supernatant. Powtórz w sumie trzy prania.
3. Sonikować tkankę przez 30 sekund na lodzie w 100 μl buforu do lizy zawierającego 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 120 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 500 μg/ml AEBSF, 10 μg/ml leupeptyny, 100 μg/ml pepstatyny, 2 μg/ml aprotyniny i 0,5 μg/ml mikrocystyny za pomocą dysmembratora sonicznego (Model 100; Thermo Fisher). Schłodzić lizat na lodzie przez 1 minutę między każdą sonikacją. Sonikuj w sumie 3x.
4. Odwirować ekstrakt w temperaturze 750 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty i usunąć supernatant do nowej mikroprobówki. Wyekstrahować osad w 50 μl buforu do lizy, sonikując przez 30 sekund na lodzie. Odwirować ekstrakt w temperaturze 750 x g w temperaturze 4 °C przez 2 min. Połączyć oba lizaty i odwirować w temperaturze 28 600 x g w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Usunąć supernatant do nowej mikroprobówki i dodać 20 μl buforu do lizy zawierającego 0,1% ASB-14 do osadu. Wirować przez 1 minutę i inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C.
5. Podgrzewać próbkę w temperaturze 95 °C przez 5 minut, następnie schładzać w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Następnie odwirowywać w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 25 °C przez 10 minut. Zebrać supernatant i przenieść do nowej probówki.
6. Odwirować zawiesinę o sile 16 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i zachować supernatant do roztrawienia.

2. Podwójne trawienie białka tryptycznego całego lizatu za pomocą FASP

1. Dodać 30 μl podwielokrotności (≤400 μg) ekstraktu z białka ślimaka, zawierającego 4% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 i 0,1 M ditiotreitolu (DTT) bezpośrednio do filtra wirowego 30K i wymieszać z 200 μl 8 M mocznika w Tris-HCl. Wirować przy 14 000 x g przez 15 min.
2. Rozcieńczyć koncentrat 200 μl 8 M roztworu mocznika i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut.
3. Dodać 10 μl 10x jodoacetamidu (IAA) w 8 M roztworze mocznika do koncentratu w filtrze i wirować przez 1 min. Inkubować filtr wirowy przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności, a następnie odwirować w 14 000 x g przez 10 min.
4. Dodać 100 μl 8 M roztworu mocznika do koncentratu na jednostce filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut. Powtórz ten krok 2x. Dodać 100 μl 50 mM roztworu wodorowęglanu amonu (ABC) do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 2x.
5. Dodać 0,4 μg/μl trypsyny w stosunku enzymu do białka 1:100 (w/w) i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.
6. Po inkubacji dodać 40 μl 50 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 1x.
7. Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do filtra wirowego i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy tryptyczne do świeżej mikroprobówki i zakwasić kwasem mrówkowym (FA) do 1,0%, aby zatrzymać trawienie.
8. Umyj jednostkę filtrującą 40 μl 8 M mocznika, a następnie przemyj 2x 40 μl 18 MΩ wody.
9. Umyć jednostkę filtrującą 3x 100 μl 50 mM roztworu ABC. Po ostatnim płukaniu dodać 0,4 μg/μl trypsyny w stosunku enzymu do białka 1:100 (w/w) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
10. Eluować peptydy tryptyczne z drugiego trawienia, dodając 40 μl 50 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 1x.
11. Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy tryptyczne do świeżej mikroprobówki i zakwasić FA do 1,0%.
12. Próbki można oznaczyć ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego na mikropłytkach przy użyciu BSA jako wzorca.

3. Endoproteinaza LysC i tryptyczne trawienie całego lizatu za pomocą FASP

1. Dodać 30 μl podwielokrotności (≤400 μg) ekstraktu białka ślimaka zawierającego 4% SDS, 100 mM Tris-HCl, pH 7,6 i 0,1 M DTT bezpośrednio do filtra wirowego 30K i wymieszać z 200 μl 8 M mocznika w Tris-HCl. Wirować przy 14 000 x g przez 15 min.
2. Rozcieńczyć koncentrat 200 μl 8 M roztworu mocznika i odwirować przy 14 000 x g przez 15 minut.
3. Dodać 10 μl 10x IAA w 8 M roztworze mocznika do koncentratu w filtrze i wirować przez 1 min. Inkubować filtr wirowy przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie odwirować przy 14 000 x g przez 10 min.
4. Dodać 100 μl 8 M roztworu mocznika do koncentratu na jednostce filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 15 min. Powtórzyć ten krok 2x. Dodać 100 μl 100 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 2x.
5. Dodać 0,1 μg/μl endoproteinazy LysC w stosunku 1:50 (w/w) enzymu do białka i inkubować O/N w temperaturze 30 °C.
6. Po inkubacji dodać 40 μl 100 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok 1x.
7. Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do filtra wirowego i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Przenieść filtrat zawierający peptydy LysC do świeżej mikroprobówki i zakwasić FA do 1,0%, aby zatrzymać trawienie.
8. Umyj jednostkę filtrującą 40 μl 8 M mocznika, a następnie przemyj 2x 40 μl 18 MΩ wody.
9. Umyć jednostkę filtrującą 3x 100 μl 50 mM roztworu ABC. Po ostatnim płukaniu dodać 0,4 μg/μl trypsyny w stosunku enzym do białka 1:100 i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
10. Elute peptydy tryptyczne przez dodanie 40 μl 50 mM roztworu ABC do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 1x.
11. Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do jednostki filtrującej i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy tryptyczne do świeżej mikroprobówki i zakwasić 1,0% FA.
12. Próbkę można określić ilościowo za pomocą testu kolorymetrycznego na mikropłytce z BSA jako wzorcem.

4. Odsalanie peptydów za pomocą wirujących kolumn

1. Aktywować kolumnę C₁₈ MacroSpin, dodając 500 μl acetonitrylu (ACN) i odwirować przy 1 100 x g przez 1 minutę. Po odwirowaniu odrzucić przepływ.
2. Zrównoważyć kolumnę z 500 μl 0,1% FA i odwirować przy 1,100 x g przez 1 min. Odrzucić przepływ i powtórzyć ten krok 1x.
3. Dodać do 500 μl roztworu peptydowego do kolumny i odwirować przy 1 100 x g przez 1 min. Jeżeli objętość próbki jest większa niż 500 μl, należy powtórzyć ten krok.
4. Przemyć kolumnę 500 μl 0,1% FA i odwirować przy 1,100 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ. Powtórz ten krok 1x.
5. Dodać do kolumny 250 μl ACN w stosunku 90:10 do wody i odwirować przy 1 100 x g przez 1 min. Zebrać eluent zawierający odsolone peptydy i przenieść do świeżej mikroprobówki. Powtórz ten krok 1x.
6. Wysuszyć odsoloną próbkę peptydu w wirówce próżniowej i nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia próbki.

5. Chromatografia jonowymienna

1. Wstrzyknąć 50-100 μg strawionej próbki białka do kolumny SCX (polisulfoetylo A) o wymiarach 200 x 2,1 mm i 5 μm, aby oddzielić peptydy.
2. Stosować gradient 2-40% B przez 50 minut przy natężeniu przepływu 250 μl/min. Rozpuszczalnik A to 5 mM mrówczanu amonu, pH 3,0 w 25% acetonitrylu i 75% ddH₂O. Rozpuszczalnik B to 500 mM mrówczanu amonu, pH 6,0 w 25% ACN i 75% ddH₂O.
3. Monitorować frakcje peptydowe przy 280 nm i zbierać frakcje w odstępach 2-minutowych za pomocą kolektora frakcji.
4. Wysuszyć frakcje w koncentratorze próżniowym i ponownie zawiesić w 500 μl 50% acetonitrylu w ddH₂O zawierającym 5% FA, aby pomóc w usuwaniu soli.
5. Ponownie wysuszyć frakcje i przechowywać w temperaturze -80 °C, aż będą gotowe do użycia do analizy nano LC-MS/MS.

6. Opady acetonu

Przed separacją GELFrEE supernatant białka ślimaka musi zostać odsolony. Wytrącanie acetonu może być stosowane do odsalania i zagęszczania białek.

1. Dodać trzy objętości lodowatego acetonu do supernatantu ślimaka. Delikatnie przetrząsnąć i inkubować w temperaturze -20 °C O/N.
2. Odwirować mieszaninę próbki o masie 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
3. Przemyć granulki białkowe 3x schłodzonym acetonem i odwirować w temperaturze 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
4. Wysuszyć granulat na powietrzu i rozpuścić w 112 μl wody o pojemności 18 MΩ.
5. Określić stężenie białka za pomocą testu kolorymetrycznego na mikropłytce.

7. GELFrEE Frakcjonowanie nabłonka czuciowego ślimaka

1. Dodać 30 μl 5x buforu próbki (0,25 M Tris-HCl pH 6,8, 10% (w/v) SDS, 50% glicerolu, 0,5% (w/v) błękitu bromofenolowego) do odsolonego białka zawieszonego w 112 μl 18 MΩ wody.
2. Dodać 8 μl 1M DTT i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby zredukować wiązania dwusiarczkowe białek. Po podgrzaniu pozostawić do ochłodzenia do temperatury pokojowej.
3. Dodać 8 ml buforu roboczego do zbiornika anody, 150 μl buforu roboczego do komory pobierania próbek i 6 ml buforu roboczego do zbiornika katody.
4. Usunąć za pomocą pipety bufor, który mógł przepłynąć do komory ładowania próbki.
5. Załadować 150 μl (≤1 mg) mieszaniny białek ślimaka do komory ładowania próbki za pomocą 8% wkładu z octanem trisu o zakresie masowym 3,5-150 kDa.
6. Opuść elektrody i zamknij pokrywę instrumentu, aby rozpocząć bieg.
7. Przy pierwszej przerwie w działaniu przyrządu dodać 2 ml buforu roboczego do zbiornika katodowego i wznowić pracę.
8. W każdym odstępie czasu na urządzeniu należy pobrać próbkę z komory pobierania próbek za pomocą pipety i dodać do świeżo oznakowanej mikroprobówki. Przemyć komorę zbiorczą 2x 150 μl bieżącego buforu i wyrzucić.
9. Dodać 150 μl świeżo uruchomionego buforu do komory pobierania próbki i wznowić pracę. Frakcje białkowe należy zbierać w czasie 2,6 godziny w łącznej objętości 150 μl/frakcję.

8. Elektroforeza żelowa 1D frakcji GELFrEE

Elektroforeza żelowa 1D może być użyta do wizualizacji wyników frakcjonowania GELFrEE przed mineralizacją enzymatyczną i analizą MS. Frakcje białkowe GELFrEE można rozdzielić na 4-15% żelu Tris-HCl.

1. Zmieszać 5 μl podwielokrotności każdej frakcji GELFrEE z 5 μl buforu rozcieńczającego próbkę (350 mM DTT w buforze próbki).
2. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 3 minuty.
3. Fajne próbki do RT.
4. Załadować 10 μl każdej frakcji GELFrEE w poszczególne pasy żelu i załadować 5 μl wzorca masy cząsteczkowej w ostatnim niewykorzystanym pasie.
5. Uruchom żel pod napięciem 125 V przez 1,5 godziny lub do momentu, gdy przód barwnika dotrze do dna żelu.
6. Ostrożnie usuń żel i zaplamić za pomocą Silver Stain Plus, aby uwidocznić separację białek.

9. Trawienie białek frakcji GELFrEE za pomocą FASP

Zmodyfikowana procedura FASP jest używana do usuwania detergentów i trawienia frakcji GELFrEE.

1. Dodać każdą pojedynczą frakcję bezpośrednio do jednostki filtrującej o temperaturze 30 K; wymieszać z 200 μl 8 M mocznika w Tris-HCl i odwirować przy 14 000 x g przez 25 minut.
2. Rozcieńczyć koncentrat 200 μl roztworu mocznika i odwirować przy 14 000 x g przez 12 minut. Powtórzyć ten krok 1x.
3. Dodać 10 μl 10x IAA w roztworze mocznika do koncentratu w każdej jednostce filtrującej, wirować przez 1 minutę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
4. Dodać 100 μl roztworu mocznika do koncentratu na jednostkach filtracyjnych i odwirować przy 14 000 x g przez 15 min. Powtórz ten krok 2x. Dodać 100 μl 100 mM roztworu ABC do jednostek filtrujących i odwirować przy 14 000 x g przez 10 min. Powtórz ten krok 2x.
5. Dodać 0,1 μg/μl LysC, aby uzyskać stosunek enzymu do białka 1:50 (w/w) do jednostek filtrujących i inkubować O/N w temperaturze 30 °C.
6. Po inkubacji dodać 40 μl 100 mM roztworu ABC do filtrów wirowych i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok 1x.
7. Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do filtrów wirowych i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy LysC z każdego filtra wirowego do świeżej mikroprobówki i zakwasić kwasem trifluorooctowym (TFA).
8. Umyj filtry wirowe 40 μl 8 M mocznika, a następnie przemyj 2x 40 μl 18 MΩ wody.
9. Umyj filtry wirowe 3x 100 μl 50 mM roztworu ABC. Po ostatnim płukaniu dodać 0,4 μg/μl trypsyny w stosunku enzym do białka 1:100 (w/w) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
10. Eluować peptydy tryptyczne z każdej jednostki filtracyjnej, dodając 40 μl 50 mM roztworu ABC i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok 1x.
11. Dodać 50 μl 0,5 M roztworu NaCl do jednostek filtrujących i odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut. Przenieść filtrat zawierający peptydy tryptyczne z każdej jednostki filtrującej do świeżej mikroprobówki i zakwasić TFA.
12. Wysuszyć wszystkie składniki mineralne w koncentratorze próżniowym.

10. Przygotowanie próbki dla LC-MS/MS

1. Rozpuścić wysuszony LysC i peptyd tryptyczny, trawić frakcje w 20 μl 0,1% FA i wirować.
2. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 10 minut i usunąć górne 95% próbki do nowej fiolki na próbkę.
3. Wstrzyknąć 5 μl każdej frakcji peptydowej do pułapki na próbki o wymiarach 100 μm x 25 mm w celu usunięcia soli i zanieczyszczeń, a następnie przeprowadzić separację chromatograficzną w kolumnie C₁₈ o wymiarach 75 μm × 10 cm.
4. Stosować gradient 2-40% B przez 100 minut przy natężeniu przepływu 200 nl/min. Rozpuszczalnik A to 95% ddH2O, a 5% acetonitryl zawiera 0,1% FA. Rozpuszczalnik B to 80% ACN, a 20% ddH2O zawiera 0,1% FA.
5. Zbierz dziesięć tandemowych widm masowych dla każdego skanu MS na spektrometrze mas o wysokiej rozdzielczości. W tym eksperymencie użyto spektrometru mas LTQ Orbitrap.

11. Identyfikacja białka

1. Identyfikacja białek za pomocą mysiej bazy danych UniProt zawierającej zarówno sekwencje białek do przodu, jak i do tyłu oraz typowe zanieczyszczenia. Do przeszukiwania bazy danych białek wykorzystywane jest oprogramowanie MaxQuant z wyszukiwarką MASCOT.
2. Parametry wyszukiwania, które można zastosować, obejmują: stałą modyfikację karbamidometylu cysteiny, zmienne modyfikacje utleniania metioniny, N-końcową acetylację białek, maksymalnie 2 pominięte rozszczepienia. Minimalna długość peptydu, którą należy wziąć pod uwagę przy identyfikacji, to 6 aminokwasów. Wprowadzić błąd stężenia masowego peptydu wynoszący ±8 ppm i tolerancję masy fragmentu wynoszącą 1,2 Da (błąd masy zależy od używanego spektrometru mas).
3. W oprogramowaniu MaxQuant należy użyć 1% współczynnika fałszywych wykryć (FDR) do identyfikacji peptydów i białek. Identyfikacja białka jest podana za pomocą liczby dopasowanych peptydów, procentowego pokrycia sekwencji białka i sekwencji peptydów.

Wyniki

Aby uzyskać najbardziej wszechstronny proteom nabłonka czuciowego ślimaka, wymagana jest szybka sekcja tkanek przed ekstrakcją białka i przygotowaniem próbki. Można zastosować dwie techniki proteomiczne, proteomikę typu shotgun i proteomikę oddolną. Aby przygotować próbki do proteomiki typu shotgun, zastosowano procedurę trawienia FASP, jak pokazano na rysunku 1. Metoda FASP pozwala na koncentrację białek, usunięcie detergentów i trawienie białek przy użyciu wielu enzymów. Zastosowano dwie procedury podw...

Dyskusja

Kluczowymi krokami do maksymalizacji identyfikacji białek na podstawie nabłonka czuciowego ślimaka są: 1) zastosowanie wielu endoproteinaz do trawienia, 2) zastosowanie wielu technik separacji oraz 3) wykorzystanie spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości. Zastosowanie wielu enzymów zwiększa liczbę peptydów i poprawia pokrycie sekwencji białek, a tym samym poprawia liczbę zidentyfikowanych białek w tkance ślimaka. Trypsyna, najczęściej stosowana proteaza, zapewnia skuteczne i specyficzne rozszczepianie białek, gen...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wkład 8% z octanu tris	Protein Discovery	42103
Aceton	Sigma-Aldrich	179124
Acetonitryl	Honeywell	015-1L
AEBSF	Calbiochem	101500
Mrówczan amonu	Fisher Scientific	AC16861
Aprotinin	Calbiochem	616370
ASB-14	Calbiochem	182750-5GM
Albumina surowicy bydlęcej	BioRad	500-0112
C18 kolumna	Nowy cel	A25112	75 μ m x 10 cm
Test białka DC	BioRad	500-0116	Protokół testu mikropłytek
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Endoproteinaza Lys-C	Sigma-Aldrich	P3428
FASP Zestaw do trawienia białek	Protein Discovery	44250
Kwas mrówkowy	Fluka	94318
System frakcjonowania GELFrEE	Odkrycie białka	42001	GELFrEE 8100
Leupeptyna	Calbiochem	108975
Kolumna makrospinowa	Grupa Nest	SMM SS18V	Krzemionka C18
Mikrocystyna	Calbiochem	475815
Pepstatyna	Sigma-Aldrich	P5318
Kolumna polisulfoetylu A	Grupa Nest	202SE0503
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Rozszyfrowywanie soniczne	Thermo Fisher	15-338-53	Model 100
Trypsyna	Sigma-Aldrich	T6567	Klasa proteomiczna