Analiza proteomu nabłonka czuciowego ślimaka może być trudna ze względu na jego mały rozmiar oraz dlatego, że białka błonowe są trudne do wyizolowania i zidentyfikowania. Zarówno białka błonowe, jak i rozpuszczalne można zidentyfikować, łącząc wiele metod preparatywnych i technik separacji wraz ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Proteomika oddolna i proteomika typu shotgun w celu zidentyfikowania kompleksowego proteomu ślimakowego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Proteomika to powszechnie stosowane podejście, które może dostarczyć wglądu w złożone systemy biologiczne. Nabłonek czuciowy ślimaka zawiera receptory, które przekształcają energię mechaniczną dźwięku w energię elektrochemiczną przetwarzaną przez obwodowy i ośrodkowy układ nerwowy. Opracowano kilka technik proteomicznych do badania ucha wewnętrznego ślimaka, takich jak dwuwymiarowa elektroforeza żelowa różnicowa (2D-DIGE), mikromacierz przeciwciał i spektrometria mas (MS). MS jest najbardziej wszechstronnym i wszechstronnym narzędziem w proteomice, a w połączeniu z metodami separacji może zapewnić dogłębny proteom próbek biologicznych. Metody separacji w połączeniu ze stwardnieniem rozsianym mają zdolność wzbogacania próbek białek, wykrywania białek o niskiej masie cząsteczkowej i białek hydrofobowych oraz identyfikacji białek o niskiej liczebności poprzez zmniejszenie zakresu dynamiki proteomu. Do całego lizatu lub frakcjonowanego lizatu białkowego można zastosować różne strategie trawienia w celu zwiększenia pokrycia sekwencji peptydów i białek. Wykorzystanie różnych technik separacji, w tym silnej wymiany kationowej (SCX), odwróconej fazy (RP) i elektroforezy uwięzionej w żelu frakcji ciekłej (GELFrEE) może być stosowane w celu zmniejszenia złożoności próbki przed analizą MS w celu identyfikacji białka.
Wprowadzenie
Proteomika to badanie złożonych systemów biologicznych poprzez analizę ekspresji, funkcji, modyfikacji i interakcji białek1. Do analizy proteomu ucha wewnętrznego wykorzystano kilka metod, w tym mikromacierzprzeciwciał 2, dwuwymiarową elektroforezę żelową3-5 i DIGE6. Jednak tylko ograniczona liczba białek została zidentyfikowana i scharakteryzowana2,7-10, w porównaniu z ponad 10 000 genów i wyrażonych znaczników sekwencji (EST) zidentyfikowanych w uchu wewnętrznym11,12, SM jest najczęściej stosowaną i wszechstronną techniką w proteomice do charakteryzacji białek. Analiza złożonych próbek proteomicznych,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Oświadczenie etyczne
Eksperymenty z użyciem tkanek myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Florydy (Protokoły 3931R, 3482R) zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health.
1. Ekstrakcja białka
- Wyizolować nabłonek czuciowy ślimaka od 16 30-dniowych (P30) myszy CBA/J i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- W dniu eksperymentu przemyć tkankę 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować przez 3 minuty przy 1 000 x g i usunąć supernatant. Powtórz w sumie trzy prania.
- Sonikować tkankę przez 30 sekund na lo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby uzyskać jak najbardziej kompleksowy proteom nabłonka sensorycznego ślimaka, niezbędna jest szybka dyssekcja tkanki przed ekstrakcją białek i przygotowaniem próbek. Można zastosować dwie techniki proteomiczne: proteomikę typu shotgun oraz proteomikę bottom-up. W celu przygotowania próbek do proteomiki typu shotgun zastosowano procedurę trawienia FASP, zgodnie z ilustracją na Rysunku 1. Metoda FASP umożliwia zagęszczanie białek, usuwanie detergentów oraz trawienie białek przy użyciu wielu enzymów. Zast.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowymi krokami do maksymalizacji identyfikacji białek na podstawie nabłonka czuciowego ślimaka są: 1) zastosowanie wielu endoproteinaz do trawienia, 2) zastosowanie wielu technik separacji oraz 3) wykorzystanie spektrometru masowego o wysokiej rozdzielczości. Zastosowanie wielu enzymów zwiększa liczbę peptydów i poprawia pokrycie sekwencji białek, a tym samym poprawia liczbę zidentyfikowanych białek w tkance ślimaka. Trypsyna, najczęściej stosowana proteaza, zapewnia skuteczne i specyficzne rozszczepianie białek, gen.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują Dr. Kentowi Seeleyowi, dyrektorowi Centrum Odkrywania i Innowacji Leków (CDDI) Proteomics Core Facility na Uniwersytecie Południowej Florydy za korzystanie z tego obiektu. Prace te były wspierane przez grant NIH/NIDCD R01 DC004295 dla B.H.A.S.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wkład 8% z octanu tris | Protein Discovery | 42103 | |
| Aceton | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| Acetonitryl | Honeywell | 015-1L | |
| AEBSF | Calbiochem | 101500 | |
| Mrówczan amonu | Fisher Scientific | AC16861 | |
| Aprotinin | Calbiochem | 616370 | |
| ASB-14 | Calbiochem | 182750-5GM | |
| Albumina surowicy bydlęcej | BioRad | 500-0112 | |
| C18 kolumna | Nowy cel | A25112 | 75 μ m x 10 cm |
| Test białka DC | BioRad | 500-0116 | Protokół testu mikropłytek |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Endoproteinaza Lys-C | Sigma-Aldrich | P3428 | |
| FASP Zestaw do trawienia białek | Protein Discovery | 44250 | |
| Kwas mrówkowy | Fluka | 94318 | |
| System frakcjonowania GELFrEE | Odkrycie białka | 42001 | GELFrEE 8100 |
| Leupeptyna | Calbiochem | 108975 | |
| Kolumna makrospinowa | Grupa Nest | SMM SS18V | Krzemionka C18 |
| Mikrocystyna | Calbiochem | 475815 | |
| Pepstatyna | Sigma-Aldrich | P5318 | |
| Kolumna polisulfoetylu A | Grupa Nest | 202SE0503 | |
| Dodecylosiarczan sodu (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Rozszyfrowywanie soniczne | Thermo Fisher | 15-338-53 | Model 100 |
| Trypsyna | Sigma-Aldrich | T6567 | Klasa proteomiczna |
Bibliografia
- Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
- Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
