Komórki DNabT są rzadkie wśród obwodowych limfocytów T, jednak są obfite w niektórych tkankach nielimfatycznych. Trudność w wyizolowaniu limfocytów DN T z tkanki nielimfatycznej utrudnia ich analizę funkcjonalną pomimo rosnącego rozpoznanego znaczenia patofizjologicznego. Opisujemy nowy protokół izolacji wysoce oczyszczonych limfocytów T DN z mysiej nerki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja podwójnie ujemnych limfocytów T αβ z nerki
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Obecnie nie ma standardowego protokołu izolacji limfocytów T DN z tkanek nielimfatycznych, pomimo ich coraz częściej zgłaszanego udziału w różnych odpowiedziach immunologicznych. Limfocyty T DN są unikalnym typem komórek odpornościowych, który bierze udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej i autoimmunologicznej oraz tolerancji na allotransplantacje1-6. Limfocyty T DN są jednak rzadkie we krwi obwodowej i wtórnych narządach limfatycznych (śledziona i węzły chłonne), ale są głównymi mieszkańcami normalnej nerki. Bardzo niewiele wiadomo na temat ich funkcji patofizjologicznej7 ze względu na ich niedostatek na peryferiach. Niedawno opisaliśmy kompleksową analizę fenotypową i funkcjonalną tej populacji w nerkach8 w stanie stacjonarnym i podczas uszkodzenia reperfuzyjnego niedokrwiennego. Analiza funkcji limfocytów T DN zostanie znacznie ulepszona dzięki opracowaniu protokołu ich izolacji od nerki.
Tutaj opisujemy nowatorski protokół, który pozwala na izolację wysoce czystych limfocytów T ab CD4+ CD8+ i limfocytów T DN z mysiej nerki. Krótko mówiąc, trawimy tkankę nerkową za pomocą kolagenazy i izolujemy jednojądrzaste komórki nerkowe (KMNC) za pomocą gradientu gęstości. Następnie następują dwa etapy w celu wzbogacenia hematopoetycznych limfocytów T z 3% do 70% z KMNC. Pierwszy etap polega na pozytywnej selekcji komórek krwiotwórczych za pomocą zestawu do izolacji CD45+. W drugim etapie limfocyty T DN są izolowane ujemnie przez usunięcie niepożądanych komórek przy użyciu przeciwciał monoklonalnych CD4, CD8 i MHC klasy II oraz tetrameru CD1d α-galcer. Ta strategia prowadzi do populacji ponad 90% czystych limfocytów T DN. W celu potwierdzenia czystości stosuje się barwienie powierzchni wyżej wymienionymi przeciwciałami, a następnie analizę FAC.
Wprowadzenie
Obwodowe αβTCR+CD3+CD4-CD8-podwójnie ujemne (DN) limfocyty T dzielą się na różne podzbiory, które mają różne fenotypy i funkcje1-4. Limfocyty T DN są słabo poznane, ale coraz częściej biorą udział w patofizjologicznych odpowiedziach immunologicznych w różnych modelach choroby4-6.
DN Limfocyty T to unikalny typ komórek odpornościowych, który jest coraz częściej zaangażowany w regulację różnych odpowiedzi immunologicznych i autoimmunologicznych oraz modulację tolerancji allotransplantu. 4-6,9 Rzadko występują we krwi obwodowej i wtórnych narządach limfatycznych (śledziona i węzły chłonne). Są jednak głównymi mieszkańcami prawidłowego nabłonka nerek i jelit10-12. Bardzo niewiele wiadomo na temat ich funkcji7 w nerkach w stanie stacjonarnym i w stanach patologicznych, takich jak ostre uszkodzenie nerek (AKI) związane z przeszczepem nerki.
Ze względu na skomplikowane role różnych komórek odpornościowych w regulacji odpowiedzi immunologicznych, w tym alloodpowiedzi, zdefiniowanie roli każdego gracza jest kluczowe dla zrozumienia aloodpowiedzi i projektowania nowych terapii. Biorąc pod uwagę znaczną liczbę limfocytów T DN obecnych w nerkach w warunkach fizjologicznych i różnych warunkach chorobowych, limfocyty T DN prawdopodobnie będą odgrywać kluczową rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej i autoimmunologicznej u myszy i ludzi oraz alloodpowiedzi u biorców przeszczepów. Gromadzące, choć wciąż rozproszone dowody wskazują na to, że limfocyty DN T pełnią zarówno funkcje patogenne, jak i immunosupresyjne, ale nie wiadomo, dlaczego i w jaki sposób wykazują one określoną szkodliwą lub supresyjną funkcję oraz jak wpływa na nie środowisko.
Ze względu na ich niską liczebność w nerkach, konieczne są ulepszone metody izolacji.
Obecnie nie ma standardowego protokołu izolacji limfocytów T DN z tkanek nielimfatycznych. Nasz protokół opisuje nowatorską metodę izolacji limfocytów T DN z nerki; Jednak metoda ta może być również stosowana w przypadku różnych tkanek nielimfatycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i odczynników
- Instrumenty: Przygotuj odczynniki w sterylnych warunkach i używaj pod kapturem z przepływem laminarnym.
- Przygotuj 1 l pożywki do hodowli tkankowych RPMI, dodaj 5% płodowej surowicy bydlęcej, 2,1 g wodorowęglanu, 10 ml glutaminianu 100x, 10 mg HEPES, 1 mg pirogronianu sodu i 10 ml 100x penicyliny/streptomycyny.
Uwaga: zalecana pożywka do hodowli tkankowych, RPMI, jest wymienna z DMEM. - Przygotować 5% roztwór kolagenazy "D" (5 ml kolagenazy "D" na 9 ml pożywki do hodowli tkankowych).
- Przygotuj roztwór Percollu w trzech różnych stężeniach: 100%, 80% i 40%. Następujące stężenia oblicza się dla 1 próbki. Roztwory należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Roztwór Percollu: dodać 9 ml nierozcieńczonego Percollu (z roztworu podstawowego); dodać 1 ml PBS 10x.
- Roztwór Percollu: dodać 8 ml Percoll 100%; dodać 2 ml PBS 1x.
- Roztwór Percollu: dodać 4 ml Percoll 80%; dodać 4 ml PBS 1x.
- Przygotować 1 l buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS), dodać 5 ml 10% BSA (0,1% BSA), 1 ml 10% azydku sodu (0,1%), 2 ml środka EDTA, uzupełnić do 1 000 ml 1x PBS.
2. Przygotowanie trawienia nerek
- Po uzyskaniu niezbędnej zgody instytucjonalnej, należy złożyć myszy w stan ośmiercenia i wykrwawić je standardowymi metodami oraz zgodnie z obowiązującymi przepisami i wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
- Znieczulić mysz pentobarbitalem (0,07 mg/kg).
- Przejdź do wykrwawienia.
- Umieść mysz w pozycji leżącej na stole operacyjnym.
- Spryskaj okolice brzucha 70% etanolem.
- Dodać 10 ml roztworu kolagenazy D na szalkę Petriego.
- Usuń i odkapsułkuj obie nerki od każdej myszy.
- Otwórz jamę brzuszną, wykonując nacięcie w linii środkowej przez skórę brzucha i otrzewną od mostka do łona.
- Odsłoń lewą nerkę, przesuwając jelito na bok.
- Ostrożnie oddzielić lewą kapsułkę za pomocą kleszczyków.
Uwaga: Kapsułka ma postać przezroczystej warstwy otaczającej nerkę i częściowo pokrytej tkanką tłuszczową okołonerkową. - Usuń lewą nerkę, przecinając naczynia szypułkowe za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- Powtórz tę samą procedurę dla prawej nerki.
Uwaga: Prawa nerka jest bardziej czaszkowa i bliżej linii środkowej (szypułki są krótsze).
- Umieść nerkę na szalce Petriego.
- Pociąć tkankę nerkową na małe kawałki (o średnicy 1-2 mm) za pomocą zwykłego metalowego ostrza kształtującego i umieścić kawałki w roztworze kolagenazy na 30-45 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C (ryc. 1).
3. Przygotowanie komórek jednojądrzastych nerki (KMNC) z trawienia nerek
- Otrzymać zawiesinę komórkową trawienia nerkowego poprzez mechaniczne rozbicie tkanki za pomocą sitka (70 μm) i ponownie zawiesić w 25 ml pożywki do hodowli tkankowych i wymieszać.
- Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zawiesiny komórek.
- Ponownie zawiesić osad w 4 ml 40% roztworu Percoll i delikatnie nałożyć na 4 ml 80% roztworu Percollu za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia, bardzo powoli i ostrożnie. Spowoduje to powstanie dwóch faz wyraźnie oddzielonych półprzezroczystą warstwą. Na górze będzie żółta warstwa odpowiadająca lipidom.
- Wirować przy 1 500 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z wirówką w trybie wyłączenia.
- Usunąć przez aspirację żółtą i grubą warstwę wierzchnią (około 1-2 ml).
- Za pomocą pipety transferowej zebrać tylko niewielką białawą, półprzezroczystą warstwę z powierzchni styku dwóch faz. Bardzo ostrożnie przenieść tę zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pożywki do hodowli tkankowych, a następnie dodać 13 ml pożywki, aby uzyskać całkowitą objętość 15 ml.
- Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
- Zawiesić próbki w 1 ml pożywki.
- Policz liczbę KMNC za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego na hemocytometrze i wyraź wyniki jako liczby KMNC na ml na nerkę.
- Umyj raz jak wyżej.
4. Izolacja komórek krwiotwórczych (CD45+) z KMNC (Krok I)
- Ponownie zawiesić komórki do 107 w 90 μl działającego buforu.
- Dodać 10 μl mikrogranulek CD45 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Dodać 1 ml działającego buforu, aby zatrzymać reakcję. Wirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić w 500 μl bieżącego buforu.
- Przygotuj kolumnę magnetyczną, umieszczając ją na magnesie i przepłucz 3 ml bieżącego buforu.
- Przepuść zawiesinę komórek przez kolumnę magnetyczną i zbierz nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę.
- Przemyć komórki trzykrotnie 3 ml bieżącego buforu. Następnie zbierz ścieki.
- Wyjąć kolumnę z separatora i odpipetować 5 ml bieżącego buforu na kolumny i natychmiast wypłukać oznakowaną frakcję. Ta frakcja zawiera komórki CD45+. Policz komórki.
- Aby obliczyć bezwzględną liczbę różnych podzbiorów limfocytów T w nerkach, pomnóż całkowitą liczbę KMNC przez procent komórek dodatnich określony za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 2).
5. Izolacja limfocytów T DN od preparacji CD45+ przez selekcję negatywną (Krok II)
- Dodać 2,5 μl (0,5 mg/ml, 1,25 μg) każdego z następujących biotynylowanych przeciwciał: anty-CD4, anty-CD8, receptora anty-Fc (CD16/32), anty-MHC klasy II (I-A b), tetrameru anty-CD1d PBS-57 na każde 107 komórek krwiotwórczych.
- Inkubować komórki przez 30 minut w chłodni.
- Dodaj 1 ml mikrogranulek anty-biotyny.
- Inkubować przez 30 minut w chłodnym pomieszczeniu.
- Umieść rurkę w magnesie i przystąp do wyczerpania.
- Policz żywe komórki, aby określić całkowitą liczbę komórek T DN we frakcji ujemnej za pomocą hemocytometru.
- Sprawdź czystość limfocytów T DN za pomocą cytometrii przepływowej, postępując zgodnie z tą strategią bramkowania: pierwsza bramka CD45 +, druga bramka TCRαβ +. Wyklucz komórki CD1d+. Wykreśl CD4 + w porównaniu z CD8 +, aby zidentyfikować limfocyty T DN (Rysunek 3).
- Pomnóż całkowitą liczbę przez procent określony w czystości.
Uwaga: Użycie tego protokołu powoduje populację ponad 90% czystych limfocytów T DN.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nerka myszy szczepu dzikiego C57BL/6 (B6) zawiera około 1,5-2,1 x 106 komórek jednojądrowych na jedną nerkę. Nie więcej niż około 10% stanowią komórki hematopoetyczne CD45+. W celu przygotowania jednojądrowych komórek nerki (KMNC), nerki tnie się na małe kawałki, jak pokazano na Rysunku 1, a następnie poddaje trawieniu z użyciem 5% kolagenazy.
Następnie wykonano wirowanie w gradiencie gęstości w celu zebrania warstwy KMNC (Rysunek 2, panel lewy)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Rośnie zainteresowanie limfocytami T DN, ponieważ są one zaangażowane w różne stany patologiczne, takie jak zaburzenia autoimmunologiczne, rak, tolerancja przeszczepów i pierwotne choroby nerek, w tym ostre uszkodzenie nerek (AKI), kłębuszkowe zapalenie nerek 8,13. Dlatego istnieje potrzeba lepszego zrozumienia i scharakteryzowania funkcji patofizjologicznych limfocytów T DN. Jednak obecnie brakuje zrozumienia funkcji tych komórek w porównaniu z limfocytami T CD4 i CD8. Głównym powodem je...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez NIH PBS (R21 AI095484). Dziękujemy NHI za tetramer CD1d.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Okap z przepływem laminarnym | Baker Company, Inc | Lub równoważny sprzęt | |
| Wirówka | Beckman Coulter | Lub równoważne wyposażenie | |
| Hemocytometr | Mikroskopia elektronowa Nauki | 63514-11 | |
| Inkubator sterowany atmosferą | Fisher Scientific | ( 37 &stopnie; C z 5% CO2) | |
| Analityczny cytometr przepływowy | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| Kolagenaza D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Surowica bydlęca płodu | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0,1% azydek sodu (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Bufor fosforanowy buforowany solą fizjologiczną (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| bufor EDTA | Kolumny Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS | Mikrogranulki MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| Mikrogranulki biotyny | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| anty-CD45 (klon: 30-F11) PerCP | eBioscience | G1397 | |
| anty-CD45 (klon: 30-F11) APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| anty-TCR Pacific Blue (ab-chain, klon: H57-597) | Invitrogen | HM3628 | |
| anty-CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| anty-CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| anty-CD4 biotynylowany (GK1.5) | BD | 553728 | |
| anty-CD8 biotynylowany (Klon 53-6.7) | BD | 553029 | |
| anty-MHC klasy II (I-A b) biotynylowany | BD | 553609 | |
| AutoMACS Running Buffer - Bufor separacyjny MACS | MIlteny I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J myszy | Jackson Labs | 000664 | Nerki - Węzły chłonne |
| szalka Petriego | BD Biosciences | 356517 | |
| 70 & #956; Filtr M | Tłok Fisher Scientific | 22363548 | |
| Lub równoważny sprzęt | |||
| Probówki GeneMate 50 ml | Bioexpress | C-3394-3 | Lub równoważne wyposażenie |
| Probówki GeneMate 15 ml | Bioexpress | C-3394-1 | Lub równoważne wyposażenie |
| CD1d α-galcer tetramer | NHI |
Bibliografia
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
- Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
- Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
- Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
- Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
- Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
- Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
- Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
- Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
- Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
- Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
- Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
- Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
- Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
- Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
