Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Strategie testowania labiryntu Barnesa z małymi i dużymi modelami gryzoni

43.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51194

⸱

26 lutego 2014

 , 
1Biomedical Sciences and Bond Life Sciences Center, University of Missouri, 2Division of Neurotoxicology, National Center for Toxicological Research, Food and Drug Administration

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Labirynt Barnesa na suchym lądzie jest powszechnie używany do mierzenia zdolności nawigacji przestrzennej w odpowiedzi na łagodnie awersyjne bodźce. W ciągu kolejnych dni poprawia się wydajność (np. opóźnienie w zlokalizowaniu klatki ewakuacyjnej) osób z grupy kontrolnej, co wskazuje na normalne uczenie się i pamięć. Różnice między szczurami a myszami wymagają zmian w aparaturze i metodologii, które zostały szczegółowo opisane tutaj.

Streszczenie

Przestrzenne uczenie się i pamięć gryzoni laboratoryjnych jest często oceniane za pomocą zdolności nawigacyjnych w labiryntach, z których najpopularniejsze to labirynty wodne i suche (Barnes). Uważa się, że lepsza wydajność w porównaniu z sesjami lub próbami odzwierciedla uczenie się i zapamiętywanie lokalizacji klatki ewakuacyjnej/platformy. Uważany za mniej stresujący niż labirynty wodne, labirynt Barnesa jest stosunkowo prostą konstrukcją okrągłej platformy z kilkoma otworami równomiernie rozmieszczonymi na krawędzi obwodu. Wszystkie otwory, z wyjątkiem jednej, mają fałszywe dno lub ślepe zakończenie, podczas gdy jeden prowadzi do klatki ewakuacyjnej. Łagodnie awersyjne bodźce (np. jasne światła górne) dają motywację do zlokalizowania klatki ewakuacyjnej. Opóźnienie w zlokalizowaniu klatki ewakuacyjnej można zmierzyć podczas sesji; Jednak dodatkowe punkty końcowe zwykle wymagają nagrywania wideo. Na podstawie tych nagrań wideo użycie oprogramowania do automatycznego śledzenia może wygenerować różne punkty końcowe, które są podobne do tych wytwarzanych w labiryntach wodnych (np. przebyta odległość, prędkość/prędkość, czas spędzony w odpowiednim kwadrancie, czas spędzony w ruchu/odpoczynku oraz potwierdzenie opóźnienia). Rodzaj strategii wyszukiwania (np. losowa, seryjna lub bezpośrednia) można również skategoryzować. Budowa labiryntu Barnesa i metodologie testowania mogą się różnić w przypadku małych gryzoni, takich jak myszy, i dużych gryzoni, takich jak szczury. Na przykład, podczas gdy wskazówki poza labiryntem są skuteczne dla szczurów, mniejsze dzikie gryzonie mogą wymagać wskazówek wewnątrz labiryntu z wizualną barierą wokół labiryntu. Należy zidentyfikować odpowiednie bodźce, które motywują gryzonia do zlokalizowania klatki ucieczki. Zarówno labirynty Barnesa, jak i labirynty wodne mogą być czasochłonne, ponieważ zazwyczaj wymagane jest 4-7 prób testowych w celu wykrycia poprawy wydajności uczenia się i pamięci (np. krótsze opóźnienia lub długości ścieżek w celu zlokalizowania platformy ewakuacyjnej lub klatki) i/lub różnic między grupami eksperymentalnymi. Mimo to labirynt Barnesa jest szeroko stosowaną oceną behawioralną mierzącą zdolności nawigacji przestrzennej i ich potencjalne zakłócenie przez manipulacje genetyczne, neurobehawioralne lub ekspozycję na narkotyki / toksyny.

Wprowadzenie

Uczenie się przestrzenne i pamięć u gryzoni laboratoryjnych zostało najpierw ocenione na szczurach pozbawionych jedzenia, które poruszały się po labiryncie alejek, aby znaleźć wzmacniacz żywności1. Kilkadziesiąt lat później zaproponowano system pamięci odniesień przestrzennych2. W przeciwieństwie do pamięci roboczej, która odnosi się do pamięci w sesji testowej lub próbie, pamięć referencyjna odnosi się do pamięci w sesjach testowych lub próbach i jest ściślej związana z pamięcią długotrwałą.

Kilka typów labiryntów zostało opracowanych jako nieinwazyjne oceny tego zależnego od hipokampa przestrzennego uczenia się i pamięci u małych i dużych gryzoni (np. labirynt wodny, wielokrotny labirynt T, labirynt promienistego ramienia i labirynty na suchym lądzie)3-6. Tutaj skupiamy się na okrągłej platformie lub labiryncie Barnesa, po raz pierwszy opisanym w 1979 roku przez dr Carol Barnes7. Ten labirynt został wykorzystany do testowania uczenia się i pamięci nawigacji przestrzennej w szerokiej gamie modeli gryzoni, w tym szczurów (Rattus norvegicus), myszy (Mus musculus), myszy jeleniowatych (Peromyscus maniculatus bairdii), myszy kalifornijskich (Peromyscus californicus) i gryzoni hystrikomorfów (np. koszatniczek [Octodon degus])8-13. Inne gatunki oceniane za pomocą labiryntu Barnesa to karaluchy amerykańskie (Periplaneta americana)14, węże zbożowe (Elaphe guttata guttata)15, łuskowate (np. jaszczurki z plamami bocznymi [Uta stansburiana])16 i naczelne inne niż ludzie (np. lemury myszy [Microcebus murinus])17. W naszych laboratoriach wydajność labiryntu Barnesa została wykorzystana jako wskaźnik neurotoksyczności po rozwojowej ekspozycji na bisfenol A (BPA) lub etynyloestradiol (EE2)9-1113. Jest również powszechnie stosowany do fenotypowania zachowania różnych szczepów myszy18-21, oceny skutków starzenia7,22-28 i deficytów związanych z chorobą Alzheimera w modelach zwierzęcych3,29-33, a także skutków ćwiczeń i zmian dietetycznych, środowiskowych i metabolicznych34-42.

Główną zaletą korzystania z labiryntu Barnesa jest to, że wywołuje on mniejszy stres u badanych w stosunku do labiryntów wodnych, takich jak labirynt wodnyMorrisa 43, chociaż oba mogą powodować ostry wzrost stężenia kortykosteronu w osoczu u myszy44. Jako labirynt na suchym lądzie, labirynt Barnesa może być bardziej etologicznie istotny dla gryzoni lądowych45. Chociaż wykazano, że działanie labiryntu wodnego jest bardziej wrażliwe na zmiany genetyczne u myszy3,46,47, działanie labiryntu Barnesa jest bardziej wrażliwe na niektóre inne zmiany48,49. W modelach gryzoni, w których korzystanie z labiryntu wodnego nie jest możliwe, labirynt Barnesa może zapewnić precyzyjnie dostrojoną ocenę zapamiętywania pamięci przestrzennej31. Łagodnie awersyjne bodźce zwykle używane w labiryncie Barnesa (tj. jasne światła) mogą jednak nie stanowić wystarczającej motywacji dla gryzonia do zlokalizowania klatki ewakuacyjnej45. Co więcej, gryzonie mogą się nauczyć, że żadna kara nie zostanie wymierzona, jeśli nie wejdą do klatki ewakuacyjnej. W ten sposób, zamiast aktywnie szukać klatki ewakuacyjnej, niektóre gryzonie aktywnie eksplorują labirynt przez długi czas każdej próby. Jak przeanalizowali Kennard i Woodruff-Pak24, ta zwiększona eksploracja wydłuży opóźnienie w zlokalizowaniu klatki ewakuacyjnej, długości ścieżki i zwiększy liczbę błędów. W związku z tym pomiar wielu parametrów, w tym opóźnienia, współczynnika błędów, czasu spędzonego w prawidłowych i nieprawidłowych kwadrantach, prędkości, czasu ruchu, czasu odpoczynku i strategii wyszukiwania, może łącznie zapewnić lepszy wskaźnik uczenia się nawigacji przestrzennej i zdolności zapamiętywania każdego badanego8-10. Ponadto wydajność można mierzyć jako opóźnienie do pierwszego zlokalizowania klatki ewakuacyjnej (miara podstawowa) lub opóźnienie wejścia do klatki ewakuacyjnej (miara całkowita). Niektórzy twierdzą, że podstawowe miary wydajności są dokładniejszym odzwierciedleniem uczenia się przestrzennego niż miary całkowite50. W większości badań, w tym w opisanych tutaj przykładach, wykorzystuje się opóźnienie do wejścia do klatki ucieczki w celu określenia współczynnika błędów i strategii wyszukiwania. Co więcej, niektóre systemy oprogramowania śledzącego mają trzypunktowy system wykrywania ciała, który może mierzyć częstotliwości wąchania prawidłowych i nieprawidłowych otworów. Na koniec labirynt musi zostać dokładnie oczyszczony etanolem między próbami, aby usunąć sygnały węchowe, które mogłyby dostarczyć wskazówek lub rozpraszać kolejne zwierzęta.

Projekty labiryntów Barnesa różnią się, ale zazwyczaj każdy z nich ma 12 lub 20 potencjalnych otworów ewakuacyjnych, z których tylko jeden prowadzi do domu lub klatki ewakuacyjnej. Klatka ewakuacyjna może być umieszczona bezpośrednio pod otworem ewakuacyjnym na szczycie labiryntu (w przypadku labiryntów bez ścian) lub wbudowana w otaczającą ścianę labiryntu. Wskazówki mogą mieć różny rozmiar, od około 16,5 cm wysokości lub szerokości (w labiryncie) do poziomej linii o szerokości 21,6 cm umieszczonej od podłogi do sufitu ściany pokoju na zewnątrz labiryntu. Rysunki 1-5 pokazują przykłady projektów labiryntów Barnesa dla gatunków Peromyscus (ryc. 1) i szczurów (ryc. 2-5). Zatyczki lub fałszywe dna muszą zakrywać otwory nieuciekające, aby zwierzę nie wypadło z labiryntu. Wielkość pomieszczenia testowego może się różnić (~20 m2), ale musi być wystarczająco duża, aby zapewnić wystarczająco dużo miejsca na labirynt, przyzwyczajenie zwierząt do pomieszczenia, umieszczenie komputera z zestawem wideo (jeśli jest używane) oraz miejsce dla eksperymentatora do siedzenia w odległości (co najmniej ~122 cm) od aparatury labiryntowej, tak aby ich obecność nie przeszkadzała w wykonywaniu pracy zwierzęcia. Przydział lokalizacji klatki ewakuacyjnej powinien być zrównoważony w zależności od grup leczonych i płci. Chociaż konkretne procedury opisane tutaj nie obejmują obracania labiryntu między próbami, aby zniechęcić do korzystania ze wskazówek zapachowych wewnątrz labiryntu, niektóre badania obejmują tę procedurę50. W naszych procedurach labirynt jest czyszczony etanolem między próbami, aby wyeliminować oznaki zapachu.

Podczas lokalizowania klatki ewakuacyjnej zdefiniowano trzy rodzaje strategii poszukiwań (pierwotnie nazwanych przez Barnesa7 "wzorcami"): 1) losowe, operacyjnie zdefiniowane jako zlokalizowane przeszukiwanie oddzielonych ścieżkami przecinającymi środek labiryntu, 2) szeregowe, zdefiniowane jako systematyczne przeszukiwanie kolejnych w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, oraz 3) bezpośrednie lub przestrzenne, zdefiniowany jako nawigacja bezpośrednio do właściwej ćwiartki bez przekraczania środka labiryntu więcej niż raz i z trzema lub mniej błędami. Ogólnie rzecz biorąc, przy wielokrotnych testach, gryzonie zazwyczaj przechodzą przez strategie wyszukiwania w podanej kolejności (losowo, seryjnie i bezpośrednio)51. Próba sondy bez klatki ewakuacyjnej może być również wykorzystana jako dalsza miara pamięci50.

Protokół i reprezentatywne wyniki tutaj zostały opracowane dla dwóch typów gryzoni (gatunki Peromyscus - inaczej nazywane małymi gryzoniami) i szczurów. Chociaż te ogólne procedury mogą również dotyczyć myszy wsobnych i/lub niekrewniaczych (Mus musculus), należy skonsultować się z innymi badaniami dotyczącymi potencjalnych różnic metodologicznych dla tych ostatnich gatunków18-21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Procedura labiryntu Barnesa dla małych gryzoni

  1. Włącz górne światła nad labiryntem i umieść znaki "Nie wchodzić" na zewnątrz drzwi laboratorium.
  2. Przynieś myszy w ich normalnych klatkach domowych do pokoju testowego około 30 minut przed rozpoczęciem pierwszej próby, aby umożliwić przyzwyczajenie. Jeśli w pomieszczeniu panuje cisza, włączenie białego szumu może nie być konieczne, w przeciwnym razie można rozważyć ten środek ostrożności.
  3. Skonfiguruj program śledzenia.
  4. Delikatnie wyjmij pierwszą mysz z domowej klatki i umieść ją w wysokim, zakrytym plastikowym pudełku. Umieść jego ewakuacyjną (czysty dom) klatkę polipropylenową (29 cm x 19 cm x 13 cm) pod wyznaczonym otworem ewakuacyjnym.
    1. Upewnij się, że papier blokujący rurkę został usunięty z tego otworu wylotowego, a wszystkie inne otwory są zatkane.
    2. Zaciągnij zasłonę wokół labiryntu.
  5. Umieść plastikowe pudełko z myszką w środku labiryntu, a około 8 sekund później delikatnie wyjmij zwierzę z klatki i umieść je na labiryncie.
    1. Po umieszczeniu zwierzęcia w środku labiryntu, spokojnie przenieś się do obszaru komputera (~150 cm od labiryntu).
    2. Uruchom odpowiednie oprogramowanie śledzące, które powinno być już otwarte, aby zapewnić minimalny czas (w ciągu kilku sekund) od momentu umieszczenia zwierzęcia w labiryncie do momentu, gdy program zacznie dokumentować jego działanie.
  6. Obserwuj wyniki zwierzęcia z monitora komputerowego i zapisuj numer dołka, numer próby, strategię wyszukiwania i liczbę popełnionych błędów. Błąd jest definiowany jako podsłuchiwanie nieprawidłowego otworu. Ocena strategii wyszukiwania może być dokonywana na żywo lub później w oparciu o wzorzec śledzenia.
    1. Strategia wyszukiwania jest skategoryzowana jako bezpośrednia (wchodzenie bezpośrednio do klatki ewakuacyjnej z 3 lub mniej błędami),
    2. Szeregowy (poruszający się wzdłuż obwodu labiryntu do momentu zlokalizowania klatki ewakuacyjnej) lub
    3. Losowe (wielokrotne przekraczanie środka labiryntu w celu sprawdzenia różnych).
  7. Zatrzymaj program śledzenia, gdy zwierzę znajdzie się we wszystkich czterech łapach w klatce ewakuacyjnej.
  8. Jeśli mysz nie wejdzie do klatki ewakuacyjnej w ciągu 5 minut, delikatnie poprowadź ją we właściwe miejsce i do klatki ewakuacyjnej. Pozostaw mysz w klatce ewakuacyjnej na 2 minuty.
  9. Wyjmij mysz z klatki ewakuacyjnej i umieść ją w klatce domowej.
  10. Spryskaj wierzch labiryntu i klatkę ewakuacyjną 70% etanolem i wytrzyj do sucha. Odłóż pierwszą klatkę/mysz na bok na 30 minut przed uruchomieniem drugiej próby.
  11. Przed uruchomieniem następnej myszy zatkaj poprzednio prawidłowy otwór ewakuacyjny i wyjmij papierową zaślepkę blokującą otwór z wyznaczonego otworu ewakuacyjnego dla tego następnego obiektu.
  12. Każda mysz jest testowana przez 2 próby dziennie w odstępach między próbami wynoszącymi około 30 minut.
  13. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie myszy będą testowane przez siedem kolejnych dni, co może zwiększyć prawdopodobieństwo zaobserwowania poprawy wydajności i/lub różnic między grupami leczenia, w porównaniu z danymi z zaledwie czterech dni.

2. Testowanie labiryntu Barnesa na szczurach, gdy program śledzący nie jest dostępny

  1. Upewnij się, że labirynt znajduje się we właściwym miejscu (bezpośrednio wyśrodkowany pod światłami), fałszywe dno, które blokuje otwory nieucieczkowe i zapobiega wypadnięciu zwierzęcia, jest bezpiecznie w labiryncie, a klatka ewakuacyjna znajduje się w miejscu wyznaczonym dla pierwszego obiektu. Górne światła nad labiryntem powinny być włączone.
  2. Upewnij się, że komputer i kamera są gotowe, a stoper jest dostępny.
  3. Włącz biały szum, aby wyciszyć wszelkie dźwięki z innych pobliskich lokalizacji. Fotel testera znajduje się około 122 cm od najbliższej krawędzi wierzchołka labiryntu i pozostaje w tym samym miejscu przez cały czas trwania testu.
  4. Licznik czasu (ustawiony na 2 minuty) powinien być dostępny (potrzebny tylko w pierwszym dniu testów). Timer nie powinien wydawać sygnału dźwiękowego ani w inny sposób hałasować. Drzwi prowadzące do sali testowej powinny być oznaczone napisem "Nie wchodzić" na zewnątrz.
  5. Arkusz zleceń testowych dla badanych będzie zawierał listę kolejności testowania obiektu, numer sesji, numer otworu, lokalizację klatki ewakuacyjnej dla każdego uczestnika oraz obszary do rejestrowania opóźnienia i pory dnia dla każdego badanego, a także obszar na wszelkie niezbędne notatki (Rysunek 6).
  6. Od 30 do 60 minut przed badaniem pierwszego szczura, należy przynieść zwierzęta w ich domowych klatkach do pomieszczenia testowego, aby umożliwić przyzwyczajenie się.
  7. Środkowa rurka, w której umieszcza się szczura na początku próby, jest umieszczona w środku labiryntu. Umieść na wierzchu kartonowy arkusz z pierwszym identyfikatorem zwierzęcia. Dzięki temu nagranie wideo może uchwycić identyfikator zwierzęcia w celu łatwej identyfikacji każdego obiektu poprzez obserwację pierwszych kilku sekund filmu.

Wstępny dzień testów 1:

  1. Rozpocznij nagrywanie wideo z komputera (jeśli jest używane) i dołącz około 5 sekund badania z kartą identyfikacyjną zwierzęcia w celu identyfikacji uczestnika. Nazwa pliku (lub data utworzenia) określi dzień/godzinę testowania.
  2. Wyjmij pierwsze zwierzę z jego domowej klatki (sprawdź tożsamość, jeśli w klatce znajduje się wiele zwierząt) i delikatnie umieść głowę do przodu w klatce ewakuacyjnej. Przykryj klatkę ewakuacyjną dodatkowym fałszywym dnem i uruchom 2-minutowy timer. Dzięki temu zwierzę może przyzwyczaić się do klatki ewakuacyjnej.
  3. Po upływie 2 minut delikatnie wyjmij zwierzę z klatki ewakuacyjnej (zdejmij również fałszywą dolną pokrywę i ustaw z dala od labiryntu), podnieś arkusz identyfikacyjny i natychmiast umieść szczura w środkowej rurze. Przykryj górną część środkowej rury tekturowym arkuszem identyfikacyjnym.
  4. Delikatnie i powoli podnieś środkową rurkę z tekturową osłoną i odłóż na bok. Uruchom stoper, gdy środkowa rura zostanie uniesiona nad zwierzęciem. Usiądź na krześle testera.
  5. Usiądź cicho na krześle, obserwując zarówno zwierzę, jak i stoper. Każde zwierzę ma maksymalnie 5 minut na odnalezienie klatki ewakuacyjnej.
  6. Jeśli szczur znajdzie klatkę ewakuacyjną w czasie krótszym niż 5 minut, zatrzymaj stoper i zapisz opóźnienie oraz porę dnia na karcie zlecenia testu. Wyjmij zwierzę z klatki ewakuacyjnej i umieść je z powrotem w klatce domowej.
  7. Jeśli szczur nie znajdzie klatki ewakuacyjnej w ciągu 5 minut, delikatnie poprowadź zwierzę do klatki ewakuacyjnej i odczekaj 15 sekund przed wyjęciem i powrotem do klatki domowej.
    1. Ten 15-sekundowy czas trwania można zmierzyć za pomocą zegara ze wskazówką sekundnika umieszczoną na ścianie sali testowej.
    2. Zapisać porę dnia na arkuszu zlecenia badania i odnotować, że szczur nie znalazł klatki ucieczki.
  8. Jeśli szczur spadnie/zeskoczy z labiryntu, tester powinien spojrzeć na stoper, aby sprawdzić czas. Tester powinien wtedy podjąć próbę szybkiego odzyskania zwierzęcia.
    1. Jeśli można to zrobić w ciągu 10 sekund, umieść zwierzę na środku labiryntu i zapisz czas upadku/skoku na arkuszu testowym (jeśli tester jest w stanie odróżnić upadek od skoku, należy to zaznaczyć). Kontynuuj próbę.
    2. Jeśli aportowanie zwierzęcia trwa dłużej niż 10 sekund, zatrzymaj stoper i włóż zwierzę z powrotem do klatki domowej. Zapisz czas upadku/skoku (jeśli tester jest w stanie odróżnić upadek od skoku, zanotuj to).
    3. Dane z prób, w których zwierzę upadło/skoczyło i nie można go było odzyskać w ciągu 10 sekund, są pomijane w analizach statystycznych.
  9. Zatrzymaj nagrywanie wideo na komputerze. Zapisz wszelkie komentarze dotyczące badania.
  10. Usuń mocz lub kał z wierzchu labiryntu, spryskaj 70% etanolem i dokładnie wytrzyj do sucha. Wyjmij klatkę ewakuacyjną i wyczyść 70% etanolem.
  11. Umieść czystą klatkę ewakuacyjną w wyznaczonym miejscu dla następnego tematu. Posiadanie więcej niż jednej klatki ewakuacyjnej pozwala każdej z nich wyschnąć na powietrzu, aby zmniejszyć zapach etanolu. Umieść czyste fałszywe dno w poprzednim otworze (tak, aby wszystkie otwory oprócz jednego miały fałszywe dno i aby jeden otwór zawierał klatkę ewakuacyjną).
  12. Ustaw środkową rurkę z arkuszem identyfikacyjnym dla następnego obiektu w środku labiryntu. Rozpocznij nagrywanie wideo na komputerze.
  13. Usuń następne zwierzę do testowania, umieść je w klatce ucieczkowej (jeśli Dzień/Sesja 1) i uruchom 2-minutowy timer (tylko jeśli Dzień/Sesja 1). Kontynuuj od kroku 2 powyżej. Każdy uczestnik otrzymuje 1 próbę/dzień.
  14. Po przetestowaniu wszystkich zwierząt wyczyść labirynt i klatkę ewakuacyjną, wyłącz górne światła i biały szum. Usuń znak "Nie wchodzić" z drzwi (drzwi).

Dni od 2 do 7 Testowanie

  1. Skonfiguruj pokój testowy i labirynt do testowania, jak opisano powyżej.
  2. Ustaw środkową rurkę w środku labiryntu z arkuszem identyfikacyjnym na górze. Rozpocznij nagrywanie wideo. Wyjmij pierwsze zwierzę z domowej klatki i umieść je w środkowej tubie.
  3. Ten krok odróżnia dni 2-7 od dnia 1; w szczególności w dniach 2-7 badany jest umieszczany bezpośrednio w środkowej rurze po wyjęciu z klatki domowej, a 2-minutowy okres przyzwyczajenia wewnątrz klatki ucieczki nie jest wykonywany.
  4. Powtórz procedurę, zaczynając od kroku 4 powyżej.

3. Analizy statystyczne dla punktów końcowych labiryntu Barnesa

  1. Analiza danych może wymagać przeprowadzenia kilku testów statystycznych. Zmienne ciągłe, takie jak opóźnienie i współczynnik błędów, mogą być analizowane jako wykres podzielony w czasie i przestrzeni52.
  2. Jeśli niektóre zwierzęta nie zlokalizują klatki ewakuacyjnej lub domowej w maksymalnym wyznaczonym czasie, dane dotyczące opóźnienia można przypisać jako maksimum i przeanalizować za pomocą testów ProcLife w analizie oprogramowania SAS w wersji 9.2.
    1. Ta metoda statystyczna jest przydatna w przypadku danych behawioralnych, w których istnieje górna granica.
  3. Dane strategii wyszukiwania mogą być analizowane przy użyciu projektu powtarzanych pomiarów z analizą oprogramowania PROC GLIMMIX i SAS w wersji 9.2.
    1. Ta pierwsza analiza wykorzystuje skumulowane łącze logarytmiczne i rozkład wielomianowy, tak że wszystkie trzy strategie wyszukiwania (losowe, szeregowe i bezpośrednie) są uwzględnione w tej analizie.
    2. Aby ustalić, czy zwierzęta uczą się korzystać z bardziej efektywnej strategii wyszukiwania (bezpośredniego), można przeprowadzić drugą analizę strategii wyszukiwania, w której dwie mniej efektywne strategie (losowa i seryjna) są łączone i porównywane z bardziej efektywną strategią wyszukiwania bezpośredniego.
    3. Ta ostatnia metoda daje rozkład dwumianowy i wykorzystuje również PROC GLIMMIX.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

mature seksualnie samce myszy jeleniowych są zależne od zwiększonej zdolności do nawigacji przestrzennej w celu zlokalizowania potencjalnych partnerek do rozrodu, które są szeroko rozproszone w środowisku. Zarówno prenatalna, jak i dorosła ekspozycja na testosteron są niezbędne do organizowania i aktywowania tego późniejszego zachowania samców53. W związku z tym przypuszczano, że wczesna ekspozycja na związki zaburzające gospodarkę hormonalną może zakłócić tę cechę u samców w późniejszym wieku. Aby sprawdzić t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne etapy procedur testowania labiryntu Barnesa obejmują: 1) zapewnienie odpowiedniego, łagodnie awersyjnego bodźca, aby zmotywować zwierzę do zlokalizowania klatki ucieczki, 2) zapewnienie utrzymania jednolitych warunków we wszystkich próbach na zwierzętach (np. czas testu, personel testujący, zewnętrzna kontrola hałasu i inne bodźce, które mogą wpływać na wydajność), 3) jeśli próby są nagrywane na wideo, optymalizacja i zapewnienie prawidłowego nagrywania wideo i tworzenia kopii zapasowych plików oraz 4...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Ten dokument został sprawdzony zgodnie z polityką Amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA) i zatwierdzony do publikacji. Zatwierdzenie nie oznacza, że treść musi odzwierciedlać stanowisko lub opinie FDA, ani wzmianka o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych nie stanowi poparcia lub rekomendacji do stosowania. Ustalenia i wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy FDA. Autorzy nie mają sprzecznych interesów i nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Panu Eldinowi Jašarevićowi, Panu Scottowi Williamsowi, Panu Rogerowi W. Meissenowi, Sarah A. Johnson, Dr. R. Michaelowi Robertsowi, Dr. Markowi R. Ellersieckowi i Dr. Davidowi C. Geary'emu z University of Missouri, oraz Panu C. Delbertowi Law i personelowi opieki nad zwierzętami w National Center for Toxicological Research/FDA. Praca ta była wspierana przez NIH Challenge Grant to Grant to CSR (RC1 ES018195), Mizzou Advantage Grant dla (CSR i DCG), nagrodę wydziału University of Missouri College of Veterinary Medicine (CSR) oraz protokół E7318 w National Center for Toxicological Research/FDA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
UWAGA: Te przedmioty, które są przeznaczone tylko dla małych gryzoni, są pogrubione. Te elementy, które są przeznaczone tylko dla dużych gryzoni, są pisane kursywą. Elementy, które nie są pogrubione ani kursywą, są przeznaczone dla obu.
Platforma Barnes Maze z 12 lub 20 otworami ewakuacyjnymi co 30&. W przypadku szczurów każdy otwór ma średnicę 10,5 cm i 4 cm od górnej krawędzi labiryntu. Do użytku z automatycznymi programami śledzenia potrzebna jest góra dla białych gryzoni lub biała górna dla gryzoni pigmentowanych. W przypadku myszy i szczurów ten okrągły wierzchołek ma odpowiednio 95 i 122 cm średnicy.US Plastics Corp,, OH42625To jest wierzchołek labiryntu Barnesa i powierzchnia, na której umieszcza się gryzonia. Może być zbudowany z różnych materiałów (np. pleksi), ale do prac zaburzających gospodarkę hormonalną optymalny jest materiał polipropylenowy wolny od BPA. Jeden z otworów prowadzi do klatki ewakuacyjnej; Wszystkie inne otwory są ślepe lub z fałszywym dnem. W przypadku labiryntu dla szczurów małe zjeżdżalnie na spodzie platformy labiryntu umożliwiają wsunięcie klatki ewakuacyjnej i fałszywych dna.
< mocny>2 cala Korek do rur polipropylenowych (24)
2 cale 90° Czarne kolanko polipropylenowe (12)
2 cale x 6 cali Złączka rurowa z polipropylenu (1)		US Plastics Corp,, OH30724
32086
30712		Są one niezbędne tylko dla małego gryzonia (np. myszy) Barnes Maze. Te adaptacje to albo ślepe rurki/kolanka, albo jedna z rurek jest podłączona do złączki rurowej, która następnie prowadzi do klatki ewakuacyjnej.
Fałszywe dna dla szczura Barnes MazeZostały wykonane na zamówienie z tworzywa ABS i formowane próżniowo dla aparatu labiryntu dla szczurów.
>Okrągła aluminiowa ściana/bariera (50 cm wysokości) wokół labiryntuAce Hardware, Columbia, MOW przypadku małych gryzoni (np. , myszy) bariera ta zapobiega ich wypadnięciu z labiryntu; aparat szczura na ogół tego nie wymaga. Ściana może nie być potrzebna dla myszy laboratoryjnych, które są stosunkowo oswojone.
Stojak nośny do szczytu platformy labiryntuUS Plastics Corp,, OH42625Stojak podtrzymuje górną część platformy labiryntu tak, że jest ona uniesiona nad podłogą (zwykle 70-100 cm), aby zmotywować gryzonia do zlokalizowania klatki ewakuacyjnej. Stojak może być wykonany z dowolnego materiału.
Klimatyzator dźwięku SleepMate z białym szumem,
Marpac, Rocky Point, NC		980ASzum tła może być używany do blokowania peryferyjnych sygnałów akustycznych, które mogą zmylić testy Barnes Maze w próbach i na zwierzętach
Oprawy oświetleniowe i żarówki o mocy 300-500 W zamknięte w aluminiowych obudowach. Na przykład przenośne halogenowe lampy robocze Utilitech 500 W.Ace Hardware lub LowesJasne światła zapewniają lekko awersyjny bodziec, który motywuje gryzonia do zlokalizowania klatki ewakuacyjnej. Światła są zazwyczaj zawieszone ~150 cm nad szczytem labiryntu.
Klatka ewakuacyjna. W przypadku małych gryzoni może to być klatka polipropylenowa (27,8 cm x 7,5 cm x 13 cm).Ancare, Bellmore, NYN40 PPKlatka ucieczki dla szczurów została tutaj zbudowana na zamówienie i ma rampę prowadzącą do klatki ewakuacyjnej.
Nieprzezroczysta tuba (tylko dla szczurów) (średnica 27 cm; wysokość 23 cm) z kawałkiem grubego kartonu do przykrycia góry.Rurkę umieszcza się w środku labiryntu, a szczura umieszcza się w tubie od góry, która jest pokryta kartonem. Uchwyt na zewnątrz rurki umożliwia łatwiejsze podnoszenie rury, co następnie rozpoczyna próbę. Rura może być wykonana z dowolnego materiału, ale powinna być nieprzezroczysta.
Kamera wideo o wysokiej rozdzielczości (np. , cyfrowa kamera wideo Panasonic)Panasonic, Secaucus, NJICV19458Kamera wideo jest umieszczona nad głową i rejestruje próby do późniejszej analizy.
Wskazówki geometryczne poza labiryntem lub wewnątrz labiryntu wykonane z wysokiej jakości tektury papieru budowlanegow każdym sklepie z artykułami biurowymi, takimi jak StaplesTe wizualne wskazówki orientują zwierzę w środowisku labiryntu, dostarczając wskazówek co do przestrzennego położenia klatki ewakuacyjnej; u szczurów dobrze sprawdzają się wskazówki dotyczące dodatkowego labiryntu na ścianach, podczas gdy u małych gryzoni, które wymagają ściany wokół labiryntu, Muszą być używane wskazówki wewnątrz labiryntu.
kurtyna otaczająca labirynt (tylko małe gryzonie)każdy sklep z tkaninami i rękodziełem, taki jak Jo-Ann Fabricszasłona jest używana u małych gryzoni (zwłaszcza dzikich gatunków, np. Peromyscus), aby utrzymać uwagę w granicach labiryntu.
70% etanoluFisher ScientificBP2818-4Po każdej próbie górna część labiryntu i klatka ewakuacyjna są czyszczone w celu wyeliminowania potencjalnych sygnałów zapachowych dla kolejno badanych gryzoni.
Oprogramowanie śledzące, takie jak Ethovision, oraz komputer z odpowiednią kartą graficzną i znaczną (1 TB lub więcej) przestrzenią dysku twardego. Alternatywnie, filmy mogą być nagrywane bezpośrednio na komputer w celu późniejszej analizy za pomocą programu takiego jak Win TV (Hauppauge Computer Works, Inc.).Noldus (Leesburg, VA)Oprogramowanie śledzące jest wymagane do analizy prób pod kątem opóźnień w zlokalizowaniu klatki ewakuacyjnej, prędkości, przebytej odległości, czasu spędzonego na odpoczynku, czasu spędzonego na poruszaniu się, czasu spędzonego w prawidłowych i nieprawidłowych kwadrantach, czasu spędzonego wokół otworu ewakuacyjnego, liczby błędów lub wejść do nieprawidłowych otworów oraz ogólnej strategii wyszukiwania zastosowanej w celu znalezienia klatki ewakuacyjnej.
Zewnętrzne dyski twarde, takie jak Seagate lub WD, z co najmniej 1-2 TB pamięciKażdy sklep z artykułami biurowymi, taki jak Staples.Kopie zapasowe nagrań wideo powinny być tworzone w co najmniej jednej oddzielnej lokalizacji.
Program do nagrywania wideo, np. program WinTVHauppauge Computer Works, Inc.,
Hauppauge, NY		Jeśli oprogramowanie śledzące nie jest dostępne w czasie testów,
próby powinny zostać nagrane na wideo do późniejszej analizy

Bibliografia

  1. Tolman, E., Gleitman, H. Studies in spatial learning: place and response learning under different degrees of motivation. J. Exp. Psychol. 39, 653-659 (1949).
  2. Olton, D. S., Papas, B. C. Spatial memory and hippocampal function. Neuropsychologia. 17, 669-682 (1979).
  3. Stewart, S., Cacucci, F., Lever, C. Which memory task for my mouse? A systematic review of spatial memory performance in the Tg2576 Alzheimer's mouse model. J. Alzheimers Dis. 26, 105-126 (2011).
  4. Sharma, S., Rakoczy, S., Brown-Borg, H. Assessment of spatial memory in mice. Life Sci. 87, 521-536 (2010).
  5. Brown, W. The effects of intra-maze tetanizing shock upon the learning and behavior of the rat in a multiple-T maze. J. Genet. Psychol. 76, 313-322 (1950).
  6. Morris, R. Development of a water-aze procedure for studying sptial learning in the rat. J. Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).
  7. Barnes, C. A. Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat. J. Comp. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).
  8. Jasarevic, E., Williams, S. A., Roberts, R. M., Geary, D. C., Rosenfeld, C. S. Spatial navigation strategies in Peromyscus: a comparative study. Anim. Behav. 84, 1141-1149 (2012).
  9. Jasarevic, E., et al. Disruption of adult expression of sexually selected traits by developmental exposure to bisphenol A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11715-11720 (2011).
  10. Williams, S. A., et al. Effects of developmental bisphenol A exposure on reproductive-related behaviors in California mice (Peromyscus californicus): A monogamous animal model. PLoS ONE. 8, (2013).
  11. Ferguson, S. A., Law, C. D., Abshire, J. S. Developmental treatment with bisphenol A causes few alterations on measures of postweaning activity and learning. Neurotoxicol. Teratol. 34, 598-606 (2012).
  12. Popovic, N., Madrid, J. A., Rol, M. A., Caballero-Bleda, M., Popovic, M. Barnes maze performance of Octodon degus is gender dependent. Behav. Brain Res. 212, 159-167 (2010).
  13. Jasarevic, E., et al. Sex and dose-dependent effects of developmental exposure to bisphenol A on anxiety and spatial learning in deer mice (Peromyscus maniculatus bairdii) offspring. Horm. Behav. 63, 180-189 (2013).
  14. Brown, S., Strausfeld, N. The effect of age on a visual learning task in the American cockroach. Learn. Mem. 16, 210-223 (2009).
  15. Holtzman, D. A., Harris, T. W., Aranguren, G., Bostock, E. Spatial learning of an escape task by young corn snakes, Elaphe guttata guttata. Anim. Behav. 57, 51-60 (1999).
  16. Ladage, L. D., Roth, T. C., Cerjanic, A. M., Sinervo, B., Pravosudov, V. V. Spatial memory: are lizards really deficient. Biol. Lett. 8, 939-941 (2012).
  17. Languille, S., Aujard, F., Pifferi, F. Effect of dietary fish oil supplementation on the exploratory activity, emotional status and spatial memory of the aged mouse lemur, a non-human primate. Behav. Brain Res. 235, 280-286 (2012).
  18. Patil, S. S., Sunyer, B., Hoger, H., Lubec, G. Evaluation of spatial memory of C57BL/6J and CD1 mice in the Barnes maze, the Multiple T-maze and in the Morris water. Behav. Brain Res. 198, 58-68 (2009).
  19. Koopmans, G., Blokland, A., van Nieuwenhuijzen, P., Prickaerts, J. Assessment of spatial learning abilities of mice in a new circular maze. Physiol. Behav. 79, 683-693 (2003).
  20. Holmes, A., Wrenn, C. C., Harris, A. P., Thayer, K. E., Crawley, J. N. Behavioral profiles of inbred strains on novel olfactory, spatial and emotional tests for reference memory in mice. Genes Brain Behav. 1, 55-69 (2002).
  21. Youn, J., et al. Finding the right motivation: genotype-dependent differences in effective reinforcements for spatial learning. Behav. Brain Res. 226, 397-403 (2012).
  22. Barrett, G. L., Bennie, A., Trieu, J., Ping, S., Tsafoulis, C. The chronology of age-related spatial learning impairment in two rat strains, as tested by the Barnes maze. Behav. Neurosci. 123, 533-538 (2009).
  23. Prut, L., et al. Aged APP23 mice show a delay in switching to the use of a strategy in the Barnes maze. Behav. Brain Res. 179, 107-110 (2007).
  24. Kennard, J. A., Woodruff-Pak, D. S. Age sensitivity of behavioral tests and brain substrates of normal aging in mice. Front. Aging Neurosci. 3, 9 (2011).
  25. Stouffer, E. M., Yoder, J. E. Middle-aged (12 month old) male rats show selective latent learning deficit. Neurobiol. Aging. 32, 2311-2324 (2011).
  26. Barreto, G., Huang, T. T., Giffard, R. G. Age-related defects in sensorimotor activity, spatial learning, and memory in C57BL/6 mice. J. Neurosurg. Anesthesiol. 22, 214-219 (2010).
  27. Barnes, C. A., McNaughton, B. L. An age comparison of the rates of acquisition and forgetting of spatial information in relation to long-term enhancement of hippocampal synapses. Behav. Neurosci. 99, 1040-1048 (1985).
  28. Bach, M. E., et al. Age-related defects in spatial memory are correlated with defects in the late phase of hippocampal long-term potentiation in vitro and are attenuated by drugs that enhance the cAMP signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5280-5285 (1999).
  29. O'Leary, T. P., Brown, R. E. Visuo-spatial learning and memory deficits on the Barnes maze in the 16-month-old APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimer's disease. Behav. Brain Res. 201, 120-127 (2009).
  30. Reiserer, R. S., Harrison, F. E., Syverud, D. C., McDonald, M. P. Impaired spatial learning in the APPSwe + PSEN1DeltaE9 bigenic mouse model of Alzheimer's disease. Genes Brain Behav. 6, 54-65 (2007).
  31. Yassine, N., et al. Detecting spatial memory deficits beyond blindness in tg2576 Alzheimer mice. Neurobiol. Aging. 34, 716-730 (2013).
  32. Walker, J. M., et al. Spatial learning and memory impairment and increased locomotion in a transgenic amyloid precursor protein mouse model of Alzheimer's disease. Behav. Brain Res. 222, 169-175 (2011).
  33. Banaceur, S., Banasr, S., Sakly, M., Abdelmelek, H. Whole body exposure to 2.4 GHz WIFI signals: effects on cognitive impairment in adult triple transgenic mouse models of Alzheimer's disease (3xTg-AD). Behav. Brain Res. 240, 197-201 (2013).
  34. Fedorova, I., Hussein, N., Baumann, M. H., Di Martino, C., Salem, N. An n-3 fatty acid deficiency impairs rat spatial learning in the Barnes maze. Behav. Neurosci. 123, 196-205 (2009).
  35. King, M. R., Anderson, N. J., Guernsey, L. S., Jolivalt, C. G. Glycogen synthase kinase-3 inhibition prevents learning deficits in diabetic mice. J. Neurosci. Res. 91, 506-514 (2013).
  36. Enhamre, E., et al. The expression of growth hormone receptor gene transcript in the prefrontal cortex is affected in male mice with diabetes-induced learning impairments. Neurosci. Lett. 523, 82-86 (2012).
  37. Agrawal, R., Gomez-Pinilla, F. Metabolic syndrome' in the brain: deficiency in omega-3 fatty acid exacerbates dysfunctions in insulin receptor signalling and cognition. J. Physiol. 590, 2485-2499 (2012).
  38. Li, J., Deng, J., Sheng, W., Zuo, Z. Metformin attenuates Alzheimer's disease-like neuropathology in obese, leptin-resistant mice. Pharmacol. Biochem. Behav. 101, 564-574 (2012).
  39. Teixeira, A. M., et al. Exercise affects memory acquisition, anxiety-like symptoms and activity of membrane-bound enzyme in brain of rats fed with different dietary fats: impairments of trans fat. Neuroscience. 195, 80-88 (2011).
  40. Steinman, M. Q., Crean, K. K., Trainor, B. C. Photoperiod interacts with food restriction in performance in the Barnes maze in female California mice. Eur. J. Neurosci. 33, 361-370 (2011).
  41. Walton, J. C., et al. Photoperiod-mediated impairment of long-term potention and learning and memory in male white-footed mice. Neuroscience. 175, 127-132 (2011).
  42. Wong-Goodrich, S. J., et al. Voluntary running prevents progressive memory decline and increases adult hippocampal neurogenesis and growth factor expression after whole-brain irradiation. Cancer Res. 70, 9329-9338 (2010).
  43. Holscher, C. Stress impairs performance in spatial water maze learning tasks. Behav. Brain Res. 100, 225-235 (1999).
  44. Harrison, F. E., Hosseini, A. H., McDonald, M. P. Endogenous anxiety and stress responses in water maze and Barnes maze spatial memory tasks. Behav. Brain Res. 198, 247-251 (2009).
  45. Sunyer, B., Patil, S., Hoger, H., Lubec, G. Barnes maze, a useful task to assess spatial reference memory in mice. Nat. Protoc. , (2007).
  46. Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
  47. Mathis, C., Bott, J. B., Candusso, M. P., Simonin, F., Cassel, J. C. Impaired striatum-dependent behavior in GASP-1-knock-out mice. Genes Brain Behav. 10, 299-308 (2011).
  48. Lewejohann, L., et al. Role of a neuronal small non-messenger RNA: behavioural alterations in BC1 RNA-deleted mice. Behav. Brain Res. 154, 273-289 (2004).
  49. Raber, J., et al. Radiation-induced cognitive impairments are associated with changes in indicators of hippocampal neurogenesis. Radiat. Res. 162, 39-47 (2004).
  50. Harrison, F. E., Reiserer, R. S., Tomarken, A. J., McDonald, M. P. Spatial and nonspatial escape strategies in the Barnes maze. Learn. Mem. 13, 809-819 (2006).
  51. Vorhees, C. V. Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins. Drug Chem. Toxicol. 20, 387-399 (1997).
  52. Steel, R. G. Principles and Procedures of Statistics: A Biometrical Approach 3rd edn. , McGraw-Hill Higher Education. 400-428 (1996).
  53. Galea, L. A., Kavaliers, M., Ossenkopp, K. P. Sexually dimorphic spatial learning in meadow voles Microtus pennsylvanicus and deer mice Peromyscus maniculatus. J. Exp. Biol. 199, 195-200 (1996).
  54. Gubernick, D. J., Teferi, T. Adaptive significance of male parental care in a monogamous mammal. Proc. Biol. Sci. 267, 147-150 (2000).
  55. Gubernick, D. J., Alberts, J. R. The biparental care system of the California mouse, Peromyscus californicus. J. Comp. Psychol. 101, 169-177 (1987).
  56. Williams, M. T., et al. Long-term effects of neonatal methamphetamine exposure in rats on spatial learning in the Barnes maze and on cliff avoidance, corticosterone release, and neurotoxicity in adulthood. Brain Res. Dev. Brain Res. 147, 163-175 (2003).
  57. Inman-Wood, S. L., Williams, M. T., Morford, L. L., Vorhees, C. V. Effects of prenatal cocaine on Morris and Barnes maze tests of spatial learning and memory in the offspring of C57BL/6J mice. Neurotoxicol. Teratol. 22, 547-557 (2000).
  58. Pompl, P. N., Mullan, M. J., Bjugstad, K., Arendash, G. W. Adaptation of the circular platform spatial memory task for mice: use in detecting cognitive impairment in the APP(SW) transgenic mouse model for Alzheimer's disease. J. Neurosci. Methods. 87, 87-95 (1999).
  59. O'Leary, T. P., Brown, R. E. The effects of apparatus design and test procedure on learning and memory performance of C57BL/6J mice on the Barnes maze. J. Neurosci. Methods. 203, 315-324 (2012).
  60. O'Leary, T. P., Brown, R. E. Optimization of apparatus design and behavioral measures for the assessment of visuo-spatial learning and memory of mice on the Barnes maze. Learn. Mem. 20, 85-96 (2013).
  61. Bredy, T. W., Lee, A. W., Meaney, M. J., Brown, R. E. Effect of neonatal handling and paternal care on offspring cognitive development in the monogamous California mouse (Peromyscus californicus). Horm. Behav. 46, 30-38 (2004).
  62. Foster, D. J., Knierim, J. J. Sequence learning and the role of the hippocampus in rodent navigation. Curr. Opin. Neurobiol. 22, 294-300 (2012).
  63. Lipton, P. A., Eichenbaum, H. Complementary roles of hippocampus and medial entorhinal cortex in episodic memory. Neural. , 258-467 (2008).
  64. Wolbers, T., Hegarty, M. What determines our navigational abilities. Trends Cogn. Sci. 14, 138-146 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

uczenie przestrzenneocena pami ciklatka ucieczkowastrategia poszukiwanialedzenie wideoprotok habituacjiwskaz wki rodowiskoweefekty toksykologiczne
Strategie testowania labiryntu Barnesa z małymi i dużymi modelami gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.