Pomiar wpływu bakterii na zachowanie C. elegans za pomocą testu retencji jaj

Summary

Test EIW (egg-in-worm) jest użyteczną metodą do ilościowego określenia zachowania podczas składania jaj. Zmiany w składaniu jaj mogą być reakcją behawioralną organizmu modelowego Caenorhabditis elegans na potencjalnie szkodliwe substancje środowiskowe, takie jak te wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze.

Abstract

C. elegans składa jaja pod wpływem sygnałów środowiskowych, takich jak osmolarność¹ i wibracja². Przy całkowitym braku pożywienia C. elegans również przestają składać jaja i zatrzymują zapłodnione jaja w macicy³. Jednak wpływ różnych źródeł pożywienia, zwłaszcza bakterii chorobotwórczych, a zwłaszcza Enterococcus faecalis, na składanie jaj Zachowanie nie jest dobrze scharakteryzowane. Test jaja w robaku (EIW) jest użytecznym narzędziem do ilościowego określania wpływu różnych typów bakterii, w tym przypadku E. fekalis, na zachowania związane ze składaniem jaj.

Testy EIW polegają na zliczaniu liczby jajeczek zatrzymanych w macicy C. elegans⁴. Test EIW polega na bieleniu, etapowym, grawicznym, dorosłym C. elegans w celu usunięcia naskórka i oddzielenia zatrzymanych jaj od zwierzęcia. Przed bieleniem robaki są wystawione na działanie bakterii (lub wszelkiego rodzaju sygnałów środowiskowych) przez określony czas. Po wybieleniu bardzo łatwo jest policzyć liczbę jaj zatrzymanych w macicy robaków. W tym teście można łatwo zmierzyć ilościowy wzrost retencji jaj po ekspozycji na E. faecalis. Test EIW jest testem behawioralnym, który może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem potencjalnie chorobotwórczych bakterii lub obecności toksyn środowiskowych. Ponadto test EIW może być narzędziem do badań przesiewowych pod kątem leków, które wpływają na sygnalizację neuroprzekaźników, ponieważ zachowanie związane ze składaniem jaj jest modulowane przez neuroprzekaźniki, takie jak serotonina i acetylocholina^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, mikroskopijny, wolno żyjący glisty, jest organizmem modelowym tradycyjnie używanym do badania procesów rozwojowych i sygnalizacji komórkowej ze względu na jego przezroczystą anatomię, dobrze scharakteryzowany rozwój, w pełni zsekwencjonowany genom, krótki czas generacji i genetyczną homologię do ludzi. Ostatnio C. elegans stał się organizmem modelowym w dziedzinie toksykologii środowiskowej i odporności wrodzonej^{10, 11}.

Te samozapładniające się hermafrodytyczne robaki osiągają dojrzałość płciową w ciągu dwóch do trzech dni od wyklucia się z jaja. W trakcie swojego cyklu życia C. elegans przechodzi przez cztery stadia larwalne (L1-L4), zanim osiągnie dorosłość. Jeden izolowany hermafrodyta może wydać średnio 300 potomstwa w ciągu trzech dni od szczytu płodności. U dojrzałych reprodukcyjnie hermafrodytów C. elegans zapłodnione jaja są zatrzymywane w macicy przez kilka godzin przed złożeniem. Normalna liczba jajeczek przechowywanych w macicy w dowolnym momencie (podczas szczytu płodności) wynosi od dziesięciu do piętnastu^dwunastu. Liczba jaj w macicy jest funkcją zarówno tempa produkcji jaj, jak i tempa składania jaj. Zapłodnione jaja są wydalane z macicy przez skurcz szesnastu mięśni sromu rozmieszczonych wokół otworu sromu¹³. Neurony ruchowe specyficzne dla hermafrodyty (HSN) i neurony ruchowe VC synapsują się na mięśniach sromu, wpływając na skurcz mięśni, a tym samym na składanie jaj^5,7,13,14. Wydalenie komórek jajowych z macicy następuje w wyniku skoordynowanej aktywności neuronów i mięśni.

Laboratoryjne kultury C. elegans są zazwyczaj hodowane na diecie niepatogennej Escherichia coli OP50. W środowisku naturalnym C. elegans ma kontakt z różnymi źródłami pożywienia, takimi jak bakterie chorobotwórcze, które mogą być potencjalnie szkodliwe. Pod wpływem szkodliwych substancji w środowisku C. elegans zatrzymuje jaja do czasu, gdy środowisko stanie się bardziej sprzyjające. Przypuszczalnie to zatrzymanie jaj jest próbą ochrony ich potomstwa.

W tym teście na jajach u robaków (EIW), C. elegans są narażone na potencjalnie chorobotwórcze bakterie, Enterococcus faecalis, które znajdują się w środowisku. Narażenie na chorobotwórcze formy E. faecalis może powodować uporczywe zakażenie jelit, a nawet śmierć u C. elegans¹⁵. Wykazano, że narażenie na inne formy bakterii chorobotwórczych wpływa na retencję jaj^16,17, jednak efekt ten nie został określony ilościowo. Ponadto nie badano wpływu łagodnie patogennych szczepów E. faecalis, szczepów, które nie są natychmiast śmiertelne, na zachowanie związane ze składaniem jaj.

Testy EIW polegają na zliczaniu liczby jajeczek zatrzymanych w macicy C. elegans⁴. Mimo że C. elegans są przezroczyste, jaja gromadzące się w macicy mogą być trudne do określenia ilościowego u nienaruszonego zwierzęcia. Test EIW polega na wybielaniu ciężarnego dorosłego C. elegans, które były wystawione na działanie bakterii przez określony czas. Roztwór wybielacza rozpuszcza zewnętrzny naskórek, pozostawiając jaja. Jaja załamują się pod wpływem wybielacza ze względu na obecność ochronnej skorupki jaja. Po wybieleniu bardzo łatwo jest policzyć liczbę jaj uwolnionych z macicy robaków podczas bielenia.

Opisany test to prosta, tania i szybka metoda ilościowego określenia liczby jaj w macicy w tym samym czasie, a tym samym ilościowego określenia wpływu E. faecalis na retencję jaj. Test ten może być wykorzystany do ilościowego określenia wpływu innych rodzajów bakterii, toksyn środowiskowych lub leków na retencję jaj. Test ten może być również wykorzystany jako badanie przesiewowe pod kątem patogenności bakterii.

Protocol

1) Przygotowanie pożywki do hodowli nicieni (NGM)

1. Aby przygotować 50 płytek, dodaj 1,5 g NaCl, 8,5 g Ultrapure Agar i 1,25 g peptonu do kolby o pojemności 1 l.
2. Dodać 487,5 ml dH₂O do kolby. Delikatnie zamieszać i zakryć otwór kolby kawałkiem folii aluminiowej.
3. Wysterylizować roztwór przez autoklawowanie w standardowych warunkach (121 psi, 120 °C, 20 min).
4. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 45 °C w łaźni wodnej.
5. Do roztworu dodać kolejno: 500 μl cholesterolu z roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml (rozpuszczonego w etanolu), 500 μl 1 M CaCl₂, 500 μl 1 M_MgSO4 i 12,5 ml buforu KPO₄ (54,15 g KH₂PO₄ i 17,8 g K₂HPO₄ w 500 ml dH₂O), jak opisano w¹⁸.
6. Za pomocą sterylnych pipet dodać 10 ml roztworu agaru do każdej polistyrenowej szalki Petriego o średnicy 60 mm. Pozostawić podłoże do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez noc.

2) Przygotowanie bulionu B E. coli Media

1. Aby przygotować pięć kultur o pojemności 100 ml, dodaj 5,0 g tryptonu Bacto, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 5,0 g NaCl do zlewki.
2. Dodać sterylną, destylowaną wodę do końcowej objętości 500 ml. Podgrzej roztwór na gorącej płycie, mieszając, aż substancje rozpuszczone się rozpuszczą.
3. Wlej 100 ml bulionu B do pięciu szklanych butelek (co najmniej 200 ml objętości).
4. Wysterylizować roztwory w autoklawie w standardowych warunkach (121 psi, 120 °C, 20 min).
5. Przed użyciem pozwól bulionowi B ostygnąć do temperatury pokojowej.

3) Siew C. elegans Płytki pielęgnacyjne

1. Po pozostawieniu płytek NGM do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej tydzień, zaszczepić jedną 100 ml kultury bulionu B kilkoma koloniami E. coli (OP50).
2. Hoduj kulturę E. coli w temperaturze 37 °C przez noc.
3. Odpipetować jedną-dwie krople (około 100 μl) kultury OP50 na środek każdej płytki NGM. Talerze są zwykle układane pokrywką do góry. Podczas pipetowania (wysiewu) należy rozpocząć od pipetowania kultury na płytkę znajdującą się na dnie stosu. Wspinaj się w górę każdego stosu. Staraj się nie przesuwać talerzy po wysianiu, ponieważ ważne jest, aby kultura nie zbliżała się zbytnio do krawędzi talerza.
4. Pozostaw talerze z nasionami do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej tydzień przed użyciem.
5. Talerze z nasionami są przechowywane (odwrócone) w szczelnych plastikowych pojemnikach w temperaturze pokojowej.

4) Utrzymanie szczepów C. elegans

1. Aby utrzymać dobrze odżywione stada C. elegans, użyj kilofa, aby co 3-4 dni przenieść trzy L4 lub gravid dorosłe osobniki na nową, wysianą płytkę NGM.
2. Przechowywać płytki (odwrócone) najlepiej w inkubatorze w temperaturze 15-22 °C. Kultury w opisanych testach przechowywano w temperaturze 20 °C. Rozwój C. elegans zależy od temperatury. Wraz ze wzrostem temperatury utrzymania skraca się czas między etapami rozwoju.

5) Przygotowanie tryptycznego agaru sojowego (TSA) E. faecalis Culture Media

1. Aby przygotować 50 talerzy, odmierz 500 ml sterylnej, destylowanej wody do kolby i doprowadź do wrzenia, mieszając, na płycie grzejnej.
2. Dodać 20 g sproszkowanego agaru TSA do kolby i pozostawić roztwór do rozpuszczenia.
3. Wysterylizować roztwory w autoklawie w standardowych warunkach (121 psi, 120 °C, 20 min).
4. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 45 °C w łaźni wodnej.
5. Za pomocą sterylnych pipet dodać 10 ml roztworu agaru do każdej polistyrenowej szalki Petriego o średnicy 60 mm. Pozostawić podłoże do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez noc.

6) Przygotowanie tryptycznego bulionu sojowego (TSB) E. faecalis Culture Media

1. Aby przygotować 250 probówek, odmierz 500 ml sterylnej, destylowanej wody do kolby i podgrzej na płycie grzejnej, mieszając.
2. Dodać 15 g proszku agarowego TSB do kolby i pozostawić proszek do rozpuszczenia.
3. Wysterylizować roztwory w autoklawie w standardowych warunkach (121 psi, 120 °C, 20 min).
4. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie odpipetować 2 ml do sterylnych probówek o pojemności 5 ml.

7) Przygotowanie pożywki do infuzji mózgu i serca (BHI) ze streptomycyną do hodowli E. faecalis

1. Odmierzyć 500 ml sterylnej, destylowanej wody do kolby i doprowadzić do wrzenia, mieszając, na płycie grzejnej.
2. Dodać 26 g pożywki BHI do kolby i pozostawić roztwór do rozpuszczenia.
3. Wysterylizować roztwory w autoklawie w standardowych warunkach (121 psi, 120 °C, 20 min).
4. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury 45 °C w łaźni wodnej.
5. Stosując sterylną technikę, dodać 0,5 ml roztworu podstawowego streptomycyny o stężeniu 10 mg/ml i zamieszać do wymieszania.
6. Dodać 10 ml roztworu do każdej polistyrenowej szalki Petriego o średnicy 60 mm.
7. Pozostaw podłoże do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez noc. Przechowywać płytki (odwrócone) w temperaturze 4 °C do kilku godzin przed użyciem.

8) Utrzymanie szczepów E. faecalis

1. Aby utrzymać zapasy E. faecalis, użyj sterylnej pętli, aby rozprowadzić poszczególne kolonie na oddzielnych płytkach z agarem sojowym tryptycznym (TSA).
2. Hoduj kultury w temperaturze 37 °C przez noc. Przechowuj talerze (odwrócone) w szczelnie zamkniętej torbie lub pudełku w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.

9) Przygotowanie płytek E. faecalis do testu EIW

1. Zaszczepić 2 ml kultury TSB kolonią E. faecalis i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Pobrać pipetą 20 μl kultury E. faecalis na środek przygotowanej płytki BHI-streptomycyny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

10) Przygotowanie płytek E. coli do testu EIW (płytki kontrolne)

1. Zaszczepić 100 ml bulionu B kolonią E. coli OP50 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C
2. Odpipetować 20 μl kultury OP50 na środek płytki NGM bez nasion i pozostawić płytki z nasionami do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.

11) Jajo w teście robaków

1. Wybierz 15-20 inscenizowanych L4 C. elegans (ryc. 1) na środek trawnika bakterii na przygotowanej płytce BHI-Strep-E. faecalis. Uważaj, aby nie przenieść dużej ilości OP50 na płytę BHI. Wybierz tę samą liczbę L4 do płytki kontrolnej NGM-OP50.
2. Inkubować płytki przez 40 godzin w temperaturze 20 °C.
3. Przygotuj 20% roztwór wybielacza. Wymieszaj dostępny w handlu wybielacz (6,0% podchlorynu sodu) z odpowiednią objętością wody destylowanej.
4. Dodaj 10 μl kropli roztworu wybielacza do dziesięciu różnych miejsc na plastikowej pokrywce (na płytce robaka lub bakterii).
5. Za pomocą wykałaczki do robaków przenieś jednego robaka do każdej kropli wybielacza. Delikatnie zakręć końcówką kilofa w kropli wybielacza, aby upewnić się, że robak zmył koniec kilofa (potwierdź, oglądając kroplę pod mikroskopem preparacyjnym).
6. Pozwól naskórkowi rozpuścić się przez około 10 minut lub do momentu, gdy robaki pękną, wyrzucając jaja (ryc. 2). Uważaj, aby nie przenieść jajek z talerza.
7. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego policz jaja w każdej kropli wybielacza.

Results

Ten test pozwala określić ilościowo liczbę zatrzymanych jaj w obrębie C. elegans po ekspozycji na E. faecalis. Robaki w stadium L4 (charakteryzujące się przezroczystą otwartą przestrzenią nad sromem, ryc. 1) były narażone na E. faecalis przez całe dorosłe życie. Po czterdziestu godzinach ekspozycji na E. faecalis przeprowadzono wybielanie. Gdy naskórek rozpadał się w kropelce wybielacza, jaja stawały się bardziej widoczne (ryc. 2). Liczbę zatrzymanych ...

Discussion

Najważniejszymi krokami w pomyślnym przeprowadzeniu tego testu są: 1) użycie dobrze odżywionych stad C. elegans, 2) hodowla pojedynczych typów bakterii na płytce testowej, 3) dokładna identyfikacja zaawansowanych robaków L4 pod kątem narażenia na E. faecalis, 4) utrzymanie stałego czasu ekspozycji na E. faecalis we wszystkich próbach oraz 5) czas bielenia nie powinien przekraczać dziesięciu minut, aby zapobiec rozpadowi jaj.

Do tego testu ważne jest, aby wybrać zdrow...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar, ultraczysty	Affymetrix	10906
Pepton Bacto Becton	Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion odwodnione podłoże	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans, szczep N2	Centrum	Genetyki Caenorhabditis	http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Płytki hodowlane dla C. elegans	Tritech Research Inc.	T3308
Płytki hodowlane dla szczepów
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis			Wszystkie izolaty potwierdzono jako enterokoki
obserwując wzrost na agarze z enterokokami (BBL) i w 6% bulionie NaCl;
wszystkie szczepy rosły z prędkością 44,5 º C i były katalazoujemne i zhydrolizowane eskuliną. Uproszczony  klucz dychotomiczny oparty na reakcjach pigmentacji i fermentacji dla sześciu cukrów  (arabinoza, mannitol, metylo-&alfa;-D-glukopiranozyd (MGP), ryboza, sorboza i sorbitol)   Przypuszczalna identyfikacja wszystkich E. faecalis szczepy (Efs nie ma pigmentacji i jest arabinozą, MGP  oraz sorbozo-ujemne i sorbitolowe, mannitolowe i rybozo-dodatnie). Wszystkie przypuszczalne szczepy Efs  zostały potwierdzone przy użyciu systemu API 20 STREP (Biomerieux).
Mikroskop	Motic	SMZ 168B	każdy mikroskop z przechodzącym oświetleniem i 50-krotnym powiększeniem powinien być wystarczający
Siarczan streptomycyny	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptyczny agar sojowy (podłoże sojowo-kazeinowe trawiące agar), Difco	Becton Dickinson	236950
Tryptykaza Rosół sojowy (podłoże sojowo-kazeinowe), BBL	Becton Dickinson	211768
Ekstrakt drożdżowy	Acros	61180-1000