Artykuł metodologiczny

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

DOI:

10.3791/51204

⸱

19 kwietnia 2014

 ,  ,  , 
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja białek przejściowych w roślinach za pośrednictwem Agrobacterium jest obiecującym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych w krótkim czasie. Jednak technologia ta dopiero zaczyna być stosowana w produkcji na dużą skalę, ponieważ obecnie pokonuje się wiele przeszkód technologicznych związanych z zwiększaniem skali. W tym miejscu demonstrujemy prostą i powtarzalną metodę produkcji białek przejściowych na skalę przemysłową opartą na infiltracji próżniowej roślin Nicotiana za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe. Optymalizacja hodowli Agrobacterium w pożywce AB pozwala na bezpośrednie rozcieńczenie kultury bakteryjnej w wodzie Milli-Q, upraszczając proces infiltracji. Spośród trzech badanych gatunków Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) została wybrana jako najbardziej obiecujący żywiciel ze względu na łatwość infiltracji, wysoki poziom produkcji białka reporterowego i około dwukrotnie wyższą produkcję biomasy w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Indukcja Agrobacterium zawierającego pBID4-GFP (oparty na wirusie mozaiki tytoniu) przy użyciu substancji chemicznych, takich jak acetosyringon i monosacharyd, nie miała wpływu na poziom produkcji białka. Infiltracja rośliny pod ciśnieniem od 50 do 100 mbar przez 30 lub 60 sekund spowodowała około 95% infiltracji tkanek liści roślin. Infiltracja laboratoryjnym szczepem Agrobacterium GV3101 wykazała najwyższą produkcję białka w porównaniu z laboratoryjnymi szczepami Agrobacteria LBA4404 i C58C1 oraz szczepami Agrobacteria typu dzikiego w at6, at10, at77 i A4. Jednoczesna ekspresja wirusowego supresora wyciszającego RNA, p23 lub p19, u N. benthamiana skutkowała wcześniejszą akumulacją i zwiększoną produkcją (15-25%) białka docelowego (hemaglutyniny wirusa grypy).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny są teraz uznawane za bezpieczną, niezawodną, skalowalną i tanią platformę do produkcji heterologicznych rekombinowanych biofarmaceutyków i białek przemysłowych1-3 i mają ważne zalety w porównaniu z systemami ekspresji mikroorganizmów i komórek zwierzęcych4. Rośliny są zdolne do ekspresji prawidłowo pofałdowanych białek z modyfikacjami potranslacyjnymi, w tym złożonymi przeciwciałami multimerycznymi5-7. Kilka rekombinowanych białek farmaceutycznych pochodzenia roślinnego jest obecnie poddawanych ocenie klinicznej8. Należą do nich specyficzne dla pacjenta rekombinowane szczepionki idiotypowe (scFv) stosowane w leczeniu chłoniaka nieziarniczego9, kandydaci na szczepionki przeciw grypie pandemicznej i sezonowej na bazie hemaglutyniny10,11 (Cummings i wsp., zgłoszone do szczepienia), przeciwciało antygenu powierzchniowego I/II przeciwko Streptococcus do leczenia próchnicyzębów 12 oraz insulina ludzka do leczenia cukrzycy13. Ponadto, ludzka rekombinowana glukocerebrozydaza do enzymatycznej terapii zastępczej u pacjentów z chorobą Gauchera została zatwierdzona w Izraelu i USA i jest dostarczana w ramach Programu Rozszerzonego Dostępu poza USA14,15.

Heterologiczne białka mogą być wytwarzane w stabilnie przekształconych (transgenicznych lub transplastomicznych) lub przejściowo przekształconych roślinach. Przejściowa produkcja białek ma kilka zalet w porównaniu z produkcją w roślinach transgenicznych, w tym krótki czas na osiągnięcie ekspresji i akumulacji16 i może być osiągnięta poprzez wprowadzenie bakteryjnych wektorów binarnych lub rekombinowanych roślinnych wektorów wirusowych do tkanek roślinnych4. Najbardziej zaawansowany system ekspresji stanów przejściowych opiera się na wykorzystaniu "wektorów startowych", które łączą składniki wirusów roślinnych i plazmidów binarnych i są dostarczane przez agroinfiltrację17,18. Agroinfiltracja wektora startowego opartego na wirusie mozaiki tytoniu (TMV) została z powodzeniem zastosowana na skalę laboratoryjną do produkcji antygenów szczepionkowych przeciwko patogenom, takim jak wirus brodawczaka ludzkiego19, Yersinia pestis20, wirusy grypy A21,22, Bacillus anthracis23 i wirus ospy prawdziwej24 w liściach N. benthamiana. Ekspresja przejściowa za pośrednictwem Agrobacterium jest również obiecującą metodą jednoczesnej produkcji wielu białek2,25-27. Na przykład roślinne przejściowe systemy ekspresji wykorzystano do produkcji rekombinowanych przeciwciał specyficznych dla nowotworu28,29, glikozylowanego rekombinowanego przeciwciała przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu30 oraz przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla antygenu ochronnego wąglika31,32. Jednoczesna infiltracja roślin Nicotiana benthamiana za pomocą genu docelowego i supresora wyciszania genów powoduje zwiększoną ekspresję białka docelowego33,34.

Agroinfiltracja to powszechna metoda równomiernego wprowadzania bakterii zawierających interesujący gen do tkanek roślinnych35-37. Infiltracja próżniowa Agrobacterium w celu przejściowej ekspresji genów w nienaruszonych liściach roślin jest szybką, skalowalną i użyteczną metodą produkcji obcych białek bez konieczności generowania roślin transgenicznych38-41. Podczas agroinfiltracji próżniowej rośliny są odwracane do góry nogami, a części nadziemne zanurzane w zawiesinie Agrobacterium. Następnie stosuje się próżnię, powodując ewakuację gazów z przestrzeni międzykomórkowych liści przez aparaty szparkowe. Szybki wzrost ciśnienia po uwolnieniu podciśnienia powoduje wlew zawiesiny Agrobacterium do liścia. Po infiltracji próżniowej agrobakterii rośliny są dalej uprawiane i monitorowana jest ekspresja celu. Najwyższe poziomy ekspresji docelowej obserwuje się zwykle 2-3 dni po infiltracji (dpi) w przypadku wektora binarnego i 4-7 dpi w przypadku wektora startowego, po czym poziom ekspresji zwykle spada17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens jest najczęściej stosowanym nośnikiem do dostarczania interesującego genu do rośliny w celu produkcji białka. Agroinfiltracja działa wyjątkowo dobrze w przypadku N. benthamiana, ale stosunkowo słabo w przypadku większości innych roślin, w tym Arabidopsis thaliana46.

W tym badaniu opracowaliśmy prostą, efektywną i ekonomiczną metodę przejściowej produkcji białka u 5-6 tygodniowego N. benthamiana za pomocą infiltracji A. tumefaciens. Główną wadą przemysłowego skalowania techniki agroinfiltracji jest odwirowanie zebranych bakterii i ponowne zawieszenie osadu bakteryjnego w pożywce zawierającej 4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenon (acetosyringon), monosacharydy i bufor kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego (MES) do indukcji genów wirusa. Udało nam się przezwyciężyć te problemy poprzez optymalizację wzrostu Agrobacterium w pożywce AB (pożywka minimalna), a następnie bezpośrednie rozcieńczenie w wodzie Milli-Q oraz kontrolowanie czasu i warunków infiltracji. Porównaliśmy również docelową produkcję białka w gatunkach żywicieli tytoniu typu dzikiego N. benthamiana i N. excelsior, a także w hybrydach N. excelsiana.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uprawa roślin

Do późniejszej agroinfiltracji oceniliśmy dwa dzikie gatunki Nicotiana (N. benthamiana i N. excelsior) oraz hybrydę (N. excelsiana) uprawianą hydroponicznie na wełnie mineralnej w pomieszczeniach zamkniętych.

  1. Namocz płyty z wełny mineralnej w roztworze nawozu roślinnego.
  2. Wysiewaj nasiona N. benthamiana, N. excelsior i N. excelsiana typu dzikiego (hybryda N. benthamiana × N. excelsior) na nasączonej składnikami odżywczymi powierzchni wełny mineralnej.
  3. Rośliny z nasion należy uprawiać w kontrolowanych warunkach (24 °C i 40-65% wilgotności względnej) i fotoperiodzie długiego dnia (14 godzin światła i 10 godzin ciemności, przy oświetleniu 130-150 μE m-2 sec-1) przez 4-5 tygodni dla N. benthamiana i N. excelsiana oraz 5-6 tygodni dla N. excelsior.

2. Budowa wektorów do agroinfiltracji

  1. Wprowadzić syntetyczny gen reporterowy (białko zielonej fluorescencyjnej [GFP]), hemaglutyninę (HA) o pełnej długości ze szczepu wirusa grypy A/California/04/2009 (HAC1) i zmodyfikowany enzym porchanazy (LicKM)18 oddzielnie do wektora startowego pBID418 (wektor oparty na TMV) w celu uzyskania pBID4-GFP, pBID4-HAC1 i pBID4-LicKM, odpowiednio18,32,41,47.
  2. Wprowadzić 10-50 ng pBID4 przenoszącego GFP lub HAC1 do elektrokompetentnych komórek szczepu A. tumefaciens GV3101 i LicKM do elektrokompetentnych komórek szczepów A. tumefaciens GV3101, C58C1, GLA4404, At06, At10, At77 i A4 za pomocą elektroporatora genu MicroPulser.
  3. Użyj przekształconych agrobakterii do eksperymentów infiltracyjnych, chyba że zaznaczono inaczej.

3. Próżniowa infiltracja Agrobacterium do roślin Nicotiana

  1. Szczepy A. tumefaciens należy uprawiać przez noc (O/N) na pożywce LB, pożywce YEB lub pożywce AB uzupełnionej 50 mg/l kanamycyny w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200-250 obr./min.
  2. Rozcieńczyć agrobakterie w wodzie Milli-Q do gęstości optycznej przy 600 nm (A600) 0,5 lub odwirować komórki Agrobacterium wyhodowane w LB lub YEB lub AB w temperaturze 4 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w pożywce indukcyjnej (1x sól MS, 10 mM MES, 200 μM acetosyringon, 2% sacharozy [MMA]) do A600 0,5, i mieszać w temperaturze pokojowej przez 1-3 godziny, chyba że zaznaczono inaczej.
  3. Naciekać rośliny w komorze próżniowej, zanurzając tkanki powietrzne rośliny Nicotiana w zawiesinie Agrobacterium i stosując próżnię 50-400 mbar na 30 lub 60 sekund. Optymalna infiltracja jest rutynowo stosowana przy ciśnieniu 50-100 mbar przez 60 sekund.
  4. Po przerwaniu próżni usuń rośliny z komory próżniowej, spłucz w wodzie i rosnąć przez 5-7 dni w tych samych warunkach wzrostu, które są używane do wzrostu przed infiltracją.
  5. W celu zbadania skuteczności substancji chemicznych indukujących gen Agrobacterium vir, do agrobakterii zawieszonych w buforze infiltracyjnym dodano różne stężenia acetosyringonu (0, 100, 200 lub 400 μM) (1x MS, 10 mM MES, 2% glukozy). Ze względu na wpływ monosacharydu na indukcję genu vir, różne procenty glukozy (0, 1, 2 lub 4%) dodawano do agrobakterii zawieszonych w buforze naciekowym (1x MS, 10 mM MES, 200 μM acetosyringonu). Rośliny N. benthamiana zostały zinfiltrowane, jak wspomniano powyżej w krokach 3.3 i 3.4).
  6. Szczepy laboratoryjne Agrobacterium GV3101, C58C1 i LBA4404 oraz szczepy typu dzikiego A4, At06, At10 i At77 zawierające wektor pBID4-LicKM rozcieńczono w wodzie Milli-Q do A600 0,5. Rośliny N. benthamiana zostały przesiąknięte każdym konkretnym szczepem, jak wspomniano powyżej w krokach 3.3 i 3.4.

4. Procedura ko-agroinfiltracji dla supresora wyciszającego wirusa

  1. Wymieszać rozcieńczone wodą kultury Milli-Q Agrobacterium GV3101 zawierające gen GFP i supresor wyciszający p19 wirusa krzaczastego karłowatości pomidora (TBSV) w proporcjach 1:1, 2:1, 3:1 i 4:1. Naciekać rośliny N. benthamiana zgodnie z powyższym opisem.
  2. Naciekać rośliny N. benthamiana mieszaniną dwóch rozcieńczonych wodą kultur Agrobacterium GV3101 rozcieńczonych w wodzie Milli-Q: pierwsza przenosząca plazmid pBID4-HAC1, a druga przenosząca jeden z supresorów wyciszających – p19 TBSV lub p23 wirusa Citrus tristeza, odpowiednio w plazmidzie pCassp (pCassp19) i w plazmidzie binarnym pGR pod promotorem 35S (pGR-P23), w stosunku 4:1.

5. Analiza Western Blot

  1. Zbierz losowe próbki liści z roślin N. benthamiana, N. excelsior lub N. excelsiana w temperaturze 4-7 dpi i sproszkowaj w ciekłym azocie na drobny proszek.
  2. Do każdej próbki dodać trzy objętości buforu 1x PBS zawierającego 0,5% Triton X-100.
  3. Delikatnie wstrząsać wyekstrahowanymi próbkami przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Wiruj ekstrakt przez 5 minut i zbierz całkowite rozpuszczalne białko do czystej probówki Eppendorfa.
  5. Rozcieńczyć ekstrakty do odpowiedniego rozcieńczenia (1:50 1:100) w 1x buforze ekstrakcyjnym PBS i dodać 5× buforu próbki (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% błękitu bromofenolowego, 50% glicerolu v/v i 500 mM DTT) do końcowego stężenia 1×.
  6. Gotuj próbki przez 5 minut.
  7. Oddziel białka przez 10% SDS-PAGE, przenieś na błonę transferową Immobilon-P i zablokuj 0,5% I-blokiem.
  8. Wykryć GFP za pomocą króliczej poliklonalnej surowicy anty-GFP w stosunku 1:5 000 i HAC1 za pomocą mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-polihistydyny w stosunku 1:1 000 w roztworze blokującym przez 1 godzinę.
  9. Po znakowaniu przeciwciałami pierwotnymi przemyć błony trzy razy przez 10 minut każdą 1× PBST-20 i inkubować z przeciwciałem antykróliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w stosunku 1:5 000 lub przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z HRP w stosunku 1:10 000 przez 1 godzinę, odpowiednio w celu wykrycia GFP i HAC1.
  10. Przetwarzaj Western blot przy użyciu substratu chemiluminescencyjnego SuperSignal West Pico.
  11. Użyj oprogramowania GeneTools, aby przeanalizować intensywność pasma białka i uzyskać skalibrowaną ilość prążka.

Produkcja białka: (Skalibrowana ilość x rozcieńczenie próbki)/ilość załadowanej próbki) x 4 = mg/kg.
Równanie: produkcja białka (P), skalibrowana ilość (C), rozcieńczenie próbki (D) i ilość załadowanej próbki (S).

6. Test Zymogramu

  1. Zbierz losowe próbki tkanek N. benthamiana infiltrowane pBID4-LicKM.
  2. Ekstrahuj białka przy użyciu tych samych metod, które opisano powyżej, do analizy Western blot, a następnie analizuj za pomocą 10% SDS-PAGE z 0,1% porostem zawartym w żelach.
  3. Po elektroforezie przemyć żele dwa razy przez 10 minut każdy w buforze do przemywania (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] i 0,1% Triton X-100), a następnie inkubować w buforze do przemywania w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę.
  4. Po inkubacji wyrzucić bufor do przemywania i zabarwić żele 0,5% czerwienią Kongo przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Opłucz żele w wodzie Milli-Q trzy razy przez 10 minut każdy i dodaj 1 M NaCl, aby uwidocznić aktywność liczenanazy. Oczyszczone białko porazazy bakteryjnej zastosowano jako pozytywną kontrolę aktywności enzymu.

7. Obrazowanie GFP

  1. Wykonaj wizualną detekcję fluorescencji GFP w całych przejściowo przekształconych roślinach za pomocą ręcznej lampy UV o długiej fali.
  2. Fotografuj przejściowo przekształcone rośliny aparatem cyfrowym przez filtr Yellow 8, ES 52 (czas naświetlania, 15 sekund).
  3. Uzyskaj obrazy z analiz Western blot za pomocą oprogramowania GeneSnap na GeneGnome i określ ilościowo wyniki za pomocą oprogramowania GeneTools, z krzywą kalibracyjną opartą na oczyszczonym wzorcu GFP.
  4. Określić ilościowo białko HAC1 za pomocą krzywej kalibracyjnej opartej na oczyszczonym wzorcu białka HAC ze szczepu A/Indonesia/05/05 wirusa grypy.
  5. Oblicz średnie wartości z 3–4 powtórzeń dla wszystkich eksperymentów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapotrzebowanie na składniki odżywcze dla wzrostu roślin. Zastosowanie hydroponicznego podłoża do uprawy roślin (wełna mineralna) i pożywki zapewnia równomierność wzrostu N. benthamiana i eliminuje złożoność (mechaniczną, regulacyjną i wydajnościową) związaną z wykorzystaniem gleby do uprawy roślin. Wyhodowaliśmy N. benthamiana na płytach z wełny mineralnej nasączonych dostępnymi na rynku nawozami, aby określić optymalne warunki do wzrostu roślin i akumulacji biomasy. Zaobserwowaliśmy 95-100% kiełkowanie nasion. Należy zauważyć, że włączenie fosforu ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia kiełkowania, ponieważ stwierdziliśmy, że pożywka pozbawiona fosforu nie wspiera kiełkowania i wzrostu nasion N. benthamiana (ryc. 1A).

Wpływ wzrostu i infiltracji pożywki Agrobacterium na zdrowie roślin i produkcję białka. Przetestowaliśmy kilka warunków pożywki, aby zoptymalizować wydajność techniki agroinfiltracji w produkcji na dużą skalę. Bakterie (szczep A. tumefaciens GV3101) zawierające konstrukt pBID4-GFP hodowano O/N w różnych warunkach pożywki (YEB, LB lub AB), a następnie odwirowywano i ponownie zawieszano w pożywce indukcyjnej (MMA) (zawierającej 1× mieszaniny soli bazowej Murashige & Skoog [MS], 10 mM MES pH 5,6, 20 g/l sacharozy i 200 μM acetosyringonu) lub rozcieńczono w wodzie Milli-Q do A600 0,5 przed użyciem do infiltracji roślin. Zaobserwowaliśmy, że infiltracja próżniowa roślin bakteriami rozcieńczonymi w wodzie spowodowała produkcję białka porównywalną do tej osiągniętej przy użyciu dowolnego podłoża infiltracyjnego w poprzednich raportach42,48. W przeciwieństwie do tego, infiltracja nierozcieńczonymi agrobakteriami wyhodowanymi w pożywce YEB lub LB spowodowała całkowite więdnięcie liści N. benthamiana w czasie krótszym niż 24 godziny po infiltracji, podczas gdy nierozcieńczone agrobakterie wyhodowane w pożywce AB nie miały wpływu na zdrowie infiltrowanych roślin (dane nie pokazane). Jak pokazano na rysunku 1B, rośliny infiltrowane kulturami Agrobacterium uprawiane na podłożach YEB, LB lub AB i rozcieńczane wodą Milli-Q (1:5, A600 0,6-0,8 lub 1:10, A600 0,3-0,4) nie wykazywały żadnych objawów i wykazywały średnią produkcję GFP wynoszącą odpowiednio 1645, 1520 i 1839. Agrobakterie odwirowane i ponownie zawieszone w pożywce indukcyjnej (MMA) nie wykazały żadnych objawów ani znaczącej różnicy w produkcji białka w porównaniu z agrobakteriami bezpośrednio rozcieńczonymi w wodzie Milli-Q (odpowiednio 1671 ± 102 i 1667 ± 131 mg / kg). Dlatego woda Milli-Q jest zalecana do rozcieńczania kultur Agrobacterium do infiltracji roślin i była rutynowo stosowana w naszych kolejnych eksperymentach w celu osiągnięcia A600 0,5.

Wpływ gęstości komórek zawiesiny Agrobacterium i przebiegu czasu na ekspresję celu. Następnie sprawdziliśmy, czy gęstość komórek bakteryjnych wpływa na skuteczność infiltracji i poziomy ekspresji celu. W tym celu oceniliśmy cztery różne gęstości zawiesiny komórek Agrobacterium przenoszących pBID4-GFP, A600 1,0, 0,5, 0,1 i 0,05. Po infiltracji rośliny N. benthamiana monitorowano pod kątem rozwoju widocznych objawów i przebiegu ekspresji docelowej w czasie, pobierając próbki w rozdzielczości 4, 7 i 10 dpi. Przy 4 dpi zaobserwowaliśmy zauważalne różnice we fluorescencji GFP wśród roślin naciekanych o różnej gęstości zawiesiny komórkowej Agrobacterium (nie zaobserwowano ekspresji GFP przy A600 wynoszącym 0,05). Przy 7 dpi fluorescencja GFP była podobna w roślinach infiltrowanych przy gęstości zawiesiny komórkowej A600 1,0, 0,5 i 0,1, ale była niższa w roślinach infiltrowanych przy A600 0,05. Jak pokazano na rysunku 1C, dane te zostały potwierdzone przez analizy Western blot próbek pobranych w temperaturze 4 dpi, wykazujące bardzo niską produkcję białka przy A600 wynoszącą 0,05 (5 mg/kg) i najwyższą przy A600 wynoszącą 1,0 (1739 mg/kg). Przy 7 dpi rośliny nie wykazały istotnych różnic w szacowanej produkcji GFP przy A600 wynoszącej 1,0, 0,5 i 0,1 (odpowiednio 1 662, 1 870 i 1 890), podczas gdy A600 wynoszące 0,05 wykazały niższą produkcję GFP (1 199 mg/kg). Natomiast przy 10 dpi nie zaobserwowano różnic w produkcji GFP wśród roślin naciekanych o żadnej z czterech gęstości zawiesiny komórkowej (1,218, 1,181, 1,197 i 1,304).

Infiltracja alternatywnymi szczepami Agrobacterium. Aby zwiększyć różnorodność szczepów Agrobacterium dostępnych do przejściowej produkcji białka, przetestowaliśmy izolaty typu dzikiego. Szczepy te, wyizolowane z żółci korony naturalnych żywicieli, zostały dzięki uprzejmości dr Gelvina (Purdue University, West Lafayette, Indiana). Aby zbadać ich przydatność w przejściowej produkcji białek, przebadaliśmy N. benthamiana następującymi szczepami przenoszącymi pBID4-LicKM18: A. rhizogenes (A4) i A. tumefaciens dzikie szczepy Nester A348, A208 i A281 (nazwane odpowiednio At6, At10 i At77), a także zmodyfikowanymi laboratoryjnymi szczepami A. tumefaciens GV3101, C58C1 i LBA4404. Naciekane liście zebrano w temperaturze 7 dpi, a poziom ekspresji LicKM oszacowano za pomocą testu Western blot. Jak pokazano na rysunku 2A, najwyższy poziom produkcji LicKM można osiągnąć przy użyciu szczepów GV3101, A4 i LBA4404 (odpowiednio ~1 750 ± 163, 1 650 ± 26 i 1 450 ± 117 mg/kg), z niewielkimi różnicami; najniższy poziom ekspresji (~900 ± 102 mg/kg) z C58C1; oraz produkcja pośrednia z At6, At10 i At77 (~1,250 ± 19, 1,100 ± 42 i 1,200 ± 111 mg/kg, odpowiednio). Aktywność enzymatyczną lishenazy wykazano za pomocą testu Zymogram. Rycina 2B pokazuje, że porachonaza wytwarzana w infiltrowanych tkankach roślinnych przy użyciu któregokolwiek ze szczepów Agrobacterium była aktywna enzymatycznie. Należy również zauważyć, że rośliny N. benthamiana naciekane szczepami A4 i At77 wykazywały objawy patologiczne (karłowatość, wydłużanie i zwijanie ogonków liściowych oraz zwijanie się liści), podczas gdy w przypadku szczepu At10 objawy były łagodne. Nie zaobserwowano żadnych objawów w roślinach N. benthamiana naciekanych laboratoryjnym szczepem GV3101 (Figura 2C).

Infiltracja alternatywnych gatunków Nicotiana. Porównaliśmy tempo wytwarzania biomasy i produkcji białka w dwóch dzikich gatunkach z rodzaju Nicotiana (N. benthamiana i N. excelsior) oraz w gatunku hybrydowym N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior). Spośród badanych gatunków N. benthamiana, szeroko stosowany gospodarz do przejściowej produkcji białek przy użyciu systemów ekspresji opartych na Agrobacterium lub wirusach2,34,49, osiąga gotowość infiltracyjną w ciągu 4-5 tygodni od wykiełkowania. Okres wzrostu niezbędny do wytworzenia optymalnego poziomu biomasy wynosi również 4-5 tygodni w przypadku N. excelsiana, ale jest dłuższy (6-7 tygodni) w przypadku N. excelsior. Ponadto międzywęźla roślin są stosunkowo krótkie dla N. excelsior w porównaniu z innymi gatunkami Nicotiana.

Ponadto, zaobserwowaliśmy, że infiltracja próżniowa N. benthamiana i N. excelsiana na poziomie 50-250 mbar przez 60 sekund jest wysoce skuteczna w agroinfiltracji całych liści, podczas gdy N. excelsior jest trudny do infiltracji ze względu na ich dolny baldachim i skórzaste liście, nawet gdy próżnia była stosowana trzy razy przez 1 minutę każdy w obecności niejonowych środków powierzchniowo czynnych, takich jak Sillwet-77 lub S240. Również zdolność kiełkowania nasion N. excelsiana i N. excelsior wynosiła ~40-50%; Aby zwiększyć zdolność kiełkowania do 90-100%, nasiona należy zaprawić 10% wybielaczem przez 1 godzinę przed siewem. W tych samych warunkach wzrostu największa biomasa liści, jaką można wytworzyć z N. excelsiana, jest około dwukrotnie wyższa w porównaniu z N. benthamiana (tabela 1).

Produkcja białka została zbadana u N. benthamiana, N. excelsior i N. excelsiana infiltrowanych szczepem Agrobacterium GV3101 zawierającym pBID4-GFP. Akumulację GFP oceniono na poziomie 7 dpi w całych naciekanych liściach za pomocą światła UV, a następnie przeprowadzono analizę Western blot. Rysunek 3A przedstawia równomierne rozmieszczenie GFP u N. benthamiana i N. excelsiana oraz nierównomierne rozmieszczenie u N. excelsior (ze względu na trudności w infiltracji całego obszaru liści N. excelsior). Rysunek 3B przedstawia poziom produkcji GFP oszacowany na podstawie oświetlenia światłem UV w naciekanych liściach zebranych od trzech gatunków Nicotiana w temperaturze 7 dpi. Poziom akumulacji GFP był wyższy u N. benthamiana (~2,23 g/kg) niż u N. excelsiana i N. excelsior (odpowiednio ~1,89 i 1,54 g/kg). Niski poziom produkcji białka u N. excelsior wynika z nierównomiernego naciekania i rozmieszczenia nagromadzonego GFP w zebranym liściu.

Zaobserwowaliśmy, że górne liście bezpośrednio wystawione na działanie światła często wykazują najwcześniejszy i najwyższy poziom przejściowej akumulacji GFP (na poziomie 2-4 dpi) niż liście pod baldachimem. Jednak w naszych badaniach akumulacja GFP była najwyższa i wynosiła 7 dpi i była równomiernie rozłożona na większości liści, z wyjątkiem nienaciekanych nowo rosnących liści, które nie wykazują akumulacji GFP.

Wpływ podciśnienia i czasu trwania na produkcję białka przejściowego. Infiltracja próżniowa znacznie zwiększa przejściowe poziomy ekspresji w porównaniu z ciśnieniem wywieranym przez wstrzyknięcie ręczne za pomocą strzykawki bezigłowej42. Zastosowanie próżni powoduje ewakuację gazów z zanurzonych liści roślin przez aparaty szparkowe. Gdy próżnia zostaje przerwana, a ciśnienie gwałtownie wzrasta, zawiesina Agrobacterium jest wtłaczana w liście, aby zastąpić odprowadzane gazy50.

Aby przetestować wpływ podciśnienia na liście N. benthamiana, przeniknęliśmy rośliny szczepem Agrobacterium GV3101 zawierającym pBID4-GFP pod różnymi ciśnieniami (50-400 mbar) przez 30 lub 60 sekund. Wykazano, że silniejsze podciśnienie (poniżej 50 mbar) stosowane przez 30 lub 60 sekund powoduje mechaniczne uszkodzenia naciekanych liści, prowadząc do więdnięcia tkanek i obumarcia roślin wkrótce po infiltracji (24-48 godzin). Z drugiej strony, zastosowanie łagodniejszej próżni (400 mbar) powoduje infiltrację tylko 50% powierzchni liści i obniżony poziom produkcji GFP (303 ± 90 mg/kg) (ryc. 4A). Co ważne, nie zaobserwowaliśmy żadnych różnic w produkcji GFP poniżej 50, 100 i 200 mbar (odpowiednio 1 651 ± 107, 1 688 ± 40, 1 594 ± 26 mg/kg) (Rysunek 4A) oraz łagodnego lub żadnego, szkodliwego wpływu na zdrowie roślin, gdy zastosowano ciśnienie podciśnienia od 50 do 200 mbar przez 30 lub 60 sekund. Dlatego do eksperymentów infiltracyjnych zaleca się podciśnienie 50-100 mbar.

Wpływ czasu trwania próżni na ekspresję docelową został oceniony poprzez infiltrację jednego mieszkania roślin N. benthamiana co godzinę za pomocą A600 0,5 GV3101 zawierającego pBID4-GFP przez 8 godzin w tej samej kulturze Agrobacterium. Rycina 4B pokazuje, że poziom produkcji GFP był podobny we wszystkich punktach czasowych do 8 godzin, co sugeruje, że w tym okresie czasu Agrobacterium zachowuje zdolność do uruchamiania jednoniciowego DNA.

Wpływ indukcji chemicznej na produkcję białek. Niektóre roślinne metabolity fenolowe i cukry mogą indukować geny wirulencji A. tumefaciens1,52. W związku z tym doniesiono, że wiele substancji chemicznych i monosacharydów zwiększa przejściową produkcję białek u różnych gatunków roślin. Acetosyringon jest najczęściej dodawany do kultur A. tumefaciens w celu indukcji operonu wirusowego przed agroinfiltracją40,53-57.

Oceniliśmy wpływ różnych stężeń acetosyringonu (0, 100, 200 i 400 μM) i glukozy (0-4%) na przejściową produkcję białka GFP u N. benthamiana infiltrowanego szczepem Agrobacterium GV3101 zawierającym pBID4-GFP. W tym celu ponownie zawiesiliśmy komórki Agrobacterium w pożywkach indukcyjnych MMA zawierających różne stężenia acetosyringonu i glukozy na 1-3 godziny przed infiltracją. Zgodnie z wynikami zarówno obserwacji wizualnej (dane nie pokazane), jak i analizy Western blot (ryc. 4C), żadne z badanych stężeń tych związków nie wywołało znaczącego wzrostu fluorescencji GFP lub produkcji białka w porównaniu z kontrolą, w której pożywka indukcyjna nie zawierała acetosyringonu ani glukozy.

Wpływ jednoczesnej infiltracji tłumika na przejściową produkcję genów GFP i HAC1 w liściach N. benthamiana. Wcześniej wykazano, że koekspresja supresora wyciszającego (p19 wirusa krzaczastego karłowatości pomidora [TBSV]) zakłóca potranskrypcyjne wyciszanie genów (PTGS), co skutkuje zwiększoną produkcją białek reporterowych34.

Oceniliśmy efekt jednoczesnej infiltracji N. benthamiana z wektorem startowym przenoszącym gen reporterowy GFP (pBID4-GFP) i p19. Przed infiltracją A600 z 0,5 rozcieńczeniami kultur A. tumefaciens GV3101 zawierających pBID4-GFP i p19 mieszano odpowiednio w proporcjach 1:1, 2:1, 3:1 i 4:1. Ekspresja supresora wyciszającego była kontrolowana przez promotor 35S wirusa mozaiki kalafiora. Jak wskazują wyniki analizy Western blot przy 7 dpi (ryc. 5A), obecność p19 nie zwiększała ani nie zmniejszała produkcji GFP u N. benthamiana, w żadnym stosunku dwóch zawiesin Agrobacterium.

Porównaliśmy również wpływ dwóch wirusowych supresorów wyciszających geny - p23 i p19 - na zapobieganie PTGS dla HAC1. Kultury Agrobacterium niosące wektor startowy pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) i jeden z dwóch plazmidów tłumiących wirusa rozcieńczono do A600 0,5, zmieszano odpowiednio w stosunku 4:1 i współinfiltrowano z 4-5-tygodniową N. benthamiana. Zawiesinę A. tumefaciens przenoszącą sam pBID4-HAC1 infiltrowano jako kontrolę. Próbki naciekanych liści pobierano w zakresie od 3 do 8 dpi. Eksperyment powtórzono trzykrotnie, a średnie poziomy ekspresji HAC1 określono za pomocą analizy Western blot.

Jak wykazano na rysunku 5B, jednoczesna infiltracja N. benthamiana z p23 lub p19 spowodowała (odpowiednio 642 ± 157 i 764 ± 108 mg/kg) wzrost produkcji HAC1 w porównaniu z brakiem użycia tłumika (odpowiednio około 15-25%) przy 6 dpi. Sugeruje to, że p23 i p19 są wydajne w naszym systemie. Należy jednak zauważyć, że akumulacja HAC1 nastąpiła dzień wcześniej, gdy pBID4-HAC1 był infiltrowany z p19. Dlatego nasze wyniki pokazują, że wpływ supresora wyciszającego p19 na akumulację HAC1 i GFP jest różny, co sugeruje selektywne zwiększanie przejściowej ekspresji i / lub stabilności niektórych białek w N. benthamiana.

Zaobserwowaliśmy również, że zarówno w obecności tłumika wyciszającego, jak i przy braku tłumika, poziom produkcji białka HAC1 zaczął spadać przy 7 dpi. Wskazuje to, że czas spadku przejściowej produkcji białka w N. benthamiana infiltrowanym przez wektor startowy jest specyficzny dla celu.

Bank komórek Agrobacterium, w którym znajduje się wektor startowy, był oceniany co roku pod kątem stabilności genu docelowego, żywotności Agrobacterium i poziomu akumulacji białka. Wykazano, że zapas glicerolu w banku komórek szczepu GV3101 przekształconego za pomocą pBID4-HAC1, który był przechowywany w temperaturze -80 °C, był bardzo stabilny przez ponad trzy lata bez zmian w poziomie przejściowej produkcji białka w infiltrowanych roślinach N. benthamiana. Rysunek 5C pokazuje, że produkcja białka HAC1 oszacowana za pomocą Western blot w latach 2010, 2011, 2012 i 2013 wynosiła odpowiednio 670, 685, 566 i 683 mg/kg. Średnia produkcja HAC1 w roślinach N. benthamiana wynosiła 651 ± 49,4 mg/kg.

figure-results-1
Tabela 1. Porównanie produkcji biomasy roślinnej N. benthamiana i N. excelsiana.

figure-results-2
Rysunek 1. Analiza Western blot przejściowej ekspresji genów u N. benthamiana. (A) Sześciotygodniowy N. benthamiana 1) rośliny rosnące w roztworze nawozu zawierającym 4,8% fosforu i 2) rośliny rosnące w roztworze nawozu zawierającym 0% fosforu. Na każdy pas załadowano dwadzieścia pięć μg ekwiwalentu masy świeżych liści. (B) Porównanie produkcji GFP w roślinach infiltrowanych próżniowo z pBID4-GFP zawierającymi kultury Agrobacterium GV3101 hodowane w trzech różnych podłożach: YEB, AB i LB. Kultury GV3101 wyhodowane O/N w pożywce YEB lub LB odwirowano z niską prędkością i ponownie zawieszono w pożywce indukcyjnej (MMA) (tory: odpowiednio MMA-1 i MMA-2) lub wyhodowano O/N w YEB, Pożywki LB lub AB i bezpośrednio rozcieńczone do 1:5 lub 1:10 wodą Milli-Q (pasy: YEB/5 i YEB/10; AB/5 oraz AB/10; LB/5 i LB/10). (C) Porównanie ekspresji GFP przy 4, 7 i 10 dpi po infiltracji próżniowej o różnych stężeniach (A600 z 1,0, 0,5, 0,1 i 0,05) szczepu A. tumefaciens GV3101 przenoszącego pBID4-GFP.

figure-results-3
Rysunek 2. Porównanie przejściowej produkcji i aktywności porachnazy po infiltracji próżniowej roślin N. benthamiana różnymi szczepami Agrobacteria. Kultury szczepów Agrobacteria (GV3101, A4, At77, C58C1, At6, At10 i LBA4404) zawierających wektor startowy pBID4-LicKM infiltrowano indywidualnie do liści N. benthamiana. Naciekane liście zebrano w temperaturze 7 dpi. (A) Produkcja lichenazy określona ilościowo za pomocą Western blot. (B) Test zymogramu wykazujący wytwarzanie porachenazy poprzez aktywność enzymatyczną. (C) Wpływ infiltracji Agrobacterium (dzikiego typu A4, At10, At77 i szczepu laboratoryjnego GV3101) na zdrowie roślin N. benthamiana przy 7 dpi. Na każdy pas załadowano dwadzieścia pięć μg ekwiwalentu masy świeżych liści

.

figure-results-4
Rysunek 3. Przejściowa ekspresja GFP w liściach N. benthamiana, N. excelsiana i N. excelsior w temperaturze 7 dpi po infiltracji próżniowej A. tumefaciens zawierającym wektor startowy pBID4-GFP. (A) Wizualne badanie ekspresji GFP w świetle UV. (B) Analiza Western blot akumulacji zwykłej dobrej praktyki rolniczej.

figure-results-5
Rysunek 4. (A) Wpływ podciśnienia na przejściową ekspresję GFP i zdrowie roślin. Rośliny N. benthamiana infiltrowano pBID4-GFP pod ciśnieniem 400, 200, 100 lub 50 mbar, w czasie utrzymywania próżni wynoszącym 30 lub 60 sekund. (B) Stabilność i zakaźność A. tumefaciens w N. benthamiana infiltrowanym Agrobacterium GV3101 zawierającym pBID4-GFP uprawianym w pożywce AB i rozcieńczonym do A600 0,5. Agroinfiltrację przeprowadzono poprzez infiltrację jednego mieszkania roślin N. benthamiana co godzinę w tej samej rozcieńczonej kulturze Agrobacterium (pasy 0-8). (C) Wpływ różnych stężeń acetosyringonu i glukozy na przejściową ekspresję GFP. Szczep Agrobacterium GV3101 zawierający pBID4-GFP hodowano O/N w pożywkach YEB, odwirowywano i ponownie zawieszano do A600 0,5 albo w MMA zawierającym 2% glukozy z acetosyringonem w 0, 100, 200 lub 400 μM, albo w MMA zawierającym 200 μM acetosyringonu z glukozą w stężeniu 0, 1, 2 lub 4%. Zawiesiny Agrobacterium przechowywano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej przed infiltracją.

figure-results-6
Rysunek 5. Wpływ supresorów wyciszających na przejściową produkcję białka w liściach N. benthamiana. (A) Analiza Western blot białka GFP po jednoczesnej infiltracji pBID4-GFP i p19 w różnych proporcjach. Próbki pobrano w temperaturze 7 dpi (na pas załadowano 25 μg ekwiwalentu masy świeżych liści). (B) Kulturę Agrobacterium przenoszącą pBID4-HAC1 indywidualnie zmieszano w stosunku 4:1 z kulturą zawierającą plazmidy supresorowe p19 lub p23. Powstałe w ten sposób kombinacje kultur Agrobacterium zostały przeniknięte próżniowo do roślin. Tkanki naciekające HAC1 pobierano codziennie do 8 dpi w celu ilościowego określenia białka rekombinowanego. (C) Stabilność banku komórek Agrobacterium. Rośliny były infiltrowane co roku tą samą partią z banku komórek Agrobacterium w celu oceny akumulacji białka. Na każdą linię załadowano pięćdziesiąt μg ekwiwalentu masy świeżych liści. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu opracowaliśmy prosty protokół agroinfiltracji do rutynowej przejściowej produkcji białka w wybranych gatunkach Nicotiana przy użyciu szczepów Agrobacterium przenoszących wektor startowy. Ponadto zidentyfikowaliśmy optymalne warunki do osiągnięcia najwyższego poziomu produkcji białka rekombinowanego w naszym przejściowym systemie ekspresji roślin.

Infiltracja próżniowa rozcieńczonego szczepu A. tumefaciens GV3101 zawierającego wektor startowy pBID4 do N. benthamiana, N. excelsiana i N. excelsior spowodowała wyższy poziom produkcji białka docelowego w granicach 7 dpi w porównaniu z innymi gatunkami roślin, takimi jak Pisum sativum infiltrowany GV3101 zawierającym wirusa mozaiki lucerny lub wirusa mozaiki ogórkawektory oparte na ekspresji genu reporterowego GFP pod promotorem 35S41 lub Lactuca sativa, Solanum lycopersicum i Arabidopsis thaliana naciekane szczepem C58C1 A. tumefaciens przenoszącym gen reporterowy beta-glukuronidazy57. N. benthamiana i N. excelsiana były łatwe do infiltracji próżniowej przy ciśnieniu 50 mbar przez 30-60 sekund, z wydajnością infiltracji 90-95%. Pozostałe 5-10% powierzchni liści nie zostało zinfiltrowane z powodu unoszenia się liści na powierzchni zawiesiny Agrobacterium podczas stosowania próżni. Ponieważ wektor startowy ma zdolność do przemieszczania się między komórkami18, przejściowa akumulacja białka występuje w całych liściach, a także ogonkach liściowych w temperaturze 7 dpi. Przy 10 dpi szacowana produkcja GFP była nieco niższa, ponieważ wektor ekspresji pBID4 jest w stanie przemieszczać się z komórki do komórki, ale nie przemieszczać się systemowo18; W związku z tym nowo wyrosłe liście nie zawierają wektora i nie przyczyniają się do produkcji celu. Ponadto degradacja rekombinowanego białka w czasie może przyczyniać się do obniżenia poziomu białka przy 10 dpi. Nasze wyniki wykazały, że infiltracja szczepu A. tumefaciens GV3101 pośredniczyła w wysokim poziomie przejściowej produkcji białka w N. benthamiana. Co więcej, białko docelowe może być zmodyfikowane jako N-końcowe, C-końcowe lub wewnętrzne fuzje z porchanazą (LicKM), β-1,3-1,4-glukanazą, która jest termostabilnym enzymem z Clostridium thermocellum i nadaje termostabilność wielu fuzjom białek docelowych18. Naciekanie N. benthamiana szczepami A. tumefaciens typu dzikiego (at6, at10 i at77) zawierającymi interesujący nas gen wywołało łagodne lub ciężkie objawy: zwijanie się liści, wydłużanie ogonków liściowych i zwijanie się. Nie zaobserwowano żadnych objawów patologicznych u N. benthamiana infiltrowanej laboratoryjnym szczepem GV3101 zawierającym pusty wektor pBID4, podczas gdy niektóre geny wprowadzone do pBID4 i przekształcone w szczepy laboratoryjne GV3101, C58C1 lub LBA4404 wywołały łagodne reakcje nekrotyczne i objawy chlorozy/żółknięcia liści w naciekanych obszarach liści. Objawy nekrotyczne wywołane przez dzikie szczepy Agrobacterium lub rozbrojone szczepy w roślinach psiankowatych zostały zgłoszone wcześniej56,57. Odpowiedź martwicza może wynikać z czynników wirulencji układu wydzielania typu III, białek bakteryjnych przenoszonych do komórki roślinnej przez system wydzielania typu IV i/lub wrażliwości na flagelinę58-60. Odkryliśmy, że przejściowa produkcja heterologicznych białek może również wywoływać patogenność i nadwrażliwość w naciekanych liściach roślin. Wielu badaczy stwierdziło, że agroinfiltracja różnych gatunków roślin za pomocą wektorów binarnych roślin wytworzyła do 5-20 razy wyższy poziom przejściowej produkcji białka w porównaniu ze stabilnie przekształconymi roślinami28,57. Nasze dane pokazują, że N. benthamiana infiltrowana przez GV3101 zawierającą pBID4-GFP przejściowo wyrażała wysokie poziomy GFP, co jest podobne do plonu GFP zgłoszonego dla N. benthamiana infiltrowanego przez Agrobacteria przenoszące wektor wirusowy pICH-GFPSYS (do 80% całkowitego rozpuszczalnego białka)44. Agroinfiltracja przy użyciu naszego wektora startowego zaowocowała wysoką produkcją termostabilnego białka LicKM, 50-krotnie wyższą niż obserwowana przy użyciu standardowego binarnego plazmidu18.

Aby przetestować zakaźność A. tumefaciens i stabilność wektora startowego, infiltrowaliśmy jedno mieszkanie N. benthamiana co godzinę przez okres do 8 godzin, używając tej samej rozcieńczonej wodą kultury Milli-Q GV3101 zawierającej plazmid pBID4-GFP. Nasze dane wykazały, że szczep GV3101 jest skutecznie zakaźny przez co najmniej 8 godzin, a pBID4 (wektor startowy) jest bardzo stabilny podczas 8-godzinnej infiltracji.

Wykazano, że zapas glicerolu szczepu GV3101 zawierający wektor startowy pBID4-HAC1 (bank komórek) przechowywany w temperaturze -80 °C jest bardzo stabilny przez trzy lata bez zmian w przejściowej produkcji białka w infiltrowanych roślinach.  

Rośliny N. benthamiana uprawiane w optymalnych warunkach i między 35 a 42 dniem po siewie były optymalne pod względem przejściowej ekspresji genów za pośrednictwem infiltracji próżniowej40. Młodsze rośliny (w wieku 3-4 tygodni) nie mogą być całkowicie infiltrowane z powodu liści unoszących się na powierzchni zawiesiny komórkowej i uszkodzenia tkanek w wyniku mechanicznych skutków zastosowania próżni. U roślin starszych niż 45 dni, w stadium kotwienia N. benthamiana , w stosowanych optymalnych warunkach oświetleniowych, poziom przejściowej ekspresji jest niski.

Wiadomo, że związki fenolowe o niskiej masie cząsteczkowej (acetosyringon) i monosacharydy (glukoza) indukują geny wiru w A. tumefaciens55,61. Ponadto wykazano, że naciekanie N. benthamiana wektorem binarnym pCAMBIA (gfp) w obecności acetosyringonu w stężeniach 50-600 μM nieznacznie zwiększa przejściową ekspresję genów40. Badaliśmy wpływ różnych stężeń acetosyringonu i glukozy w naszym systemie poprzez dodanie tych związków do kultur GV3101 zawierających pBID4-GFP w MMA przez 3 godziny i nie znaleźliśmy różnicy w ekspresji GFP. Co ciekawe, kultury GV3101 zawierające pBID4-GFP i rozcieńczone w wodzie Milli-Q do A600 0,5 i infiltrowane bez indukcji genu vir wyrażały te same ilości GFP, co te infiltrowane indukowanymi kulturami. Geny vir A. tumefaciens mogą być potencjalnie indukowane przez roślinne związki fenolowe (acetosyringon i kwas sinapinowy) oraz roślinne sacharydy proste (glukozę i fruktozę) obecne w tkance liści. Dlatego spekulujemy, że podobne poziomy ekspresji GFP w obecności lub braku egzogennych induktorów genów wirowych mogą wynikać z działania cytoplazmatycznych induktorów genów wirowych obecnych podczas replikacji wektora startowego eksprymującego GFP w komórkach roślinnych.

N. benthamiana typu dzikiego została wykorzystana jako gospodarz modelowy do przejściowej produkcji białek49. Jednak stosunkowo niski plon biomasy N. benthamiana utrudnia jego zastosowanie do produkcji białek rekombinowanych na dużą skalę. Optymalny gospodarz powinien łączyć wysoki poziom przejściowej ekspresji, łatwy wzrost w szklarni i być podatny na infiltrację Agrobacterium 2. Aby wybrać alternatywnego żywiciela, przesączyliśmy dwa różne gatunki dzikich typów Nicotiana (N. benthamiana i N. excelsior) oraz hybrydę N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) ze szczepem A. tumefaciens GV3101 zawierającym plazmid pBID4-GFP. Spośród tych trzech gatunków poziom ekspresji GFP był nieco wyższy u N. benthamiana. Rośliny N. excelsior wykazywały trudności w agroinfiltracji próżniowej ze względu na skórzaste liście, a N. excelsiana wytwarzała około dwa razy więcej biomasy w tych samych warunkach wzrostu. Przejściowa produkcja GFP przy 7 dpi jest stosunkowo podobna u N. benthamiana i N. excelsiana. Dlatego N. excelsiana może być bardziej odpowiednim gospodarzem do produkcji białek rekombinowanych.

Produkcja białek przejściowych, w której pośredniczy Agrobacterium, jest ograniczona przez PTGS26, który można przezwyciężyć poprzez koekspresję supresorów wyciszających geny pochodzenia roślinnego62. Wcześniej wykazano, że produkcja białka przejściowego jest 50-krotnie zwiększona w obecności białka p19 TBSV, które hamuje PTGS w infiltrowanych tkankach34. W naszym badaniu oceniliśmy wpływ dwóch supresorów wyciszających wirusa (p19 i p23) oddzielnie infiltrowanych z wektorem startowym pBID4-HAC1. Współinfiltracja tych supresorów wyciszających wydawała się mieć niewielki wpływ na przejściową ekspresję HAC1, z tylko niewielkim wzrostem akumulacji białka HAC1 (15-25%) w obecności współinfiltrowanego p23 lub p19. Aby pozytywnie wpłynąć na produkcję białka, może być konieczne specjalne dobranie supresorów wyciszających, aby były skuteczne dla docelowych gatunków roślin i wektora wirusowego63. Helikaza TMV ma supresor o działaniu wyciszającym RNA64,65. Nasze dane potwierdzają tę obserwację, ponieważ jednoczesna infiltracja p23 lub p19 z pBID4-HAC1 nie spowodowała wzrostu GFP lub niewielkiego wzrostu przejściowej produkcji białka HAC1.

Podsumowując, zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy warunki wzrostu roślin i Agrobacterium oraz poprawiliśmy skuteczność infiltracji próżniowej. Ta technologia pozwoliła nam wyhodować i przeniknąć do setki kilogramów materiału roślinnego w ciągu kilku godzin. Udało nam się zautomatyzować technikę roślinnej ekspresji stanów nieustalonych w celu uzyskania wysokoprzepustowej produkcji szczepionek na skalę przemysłową w obecnych warunkach Dobrej Praktyki Produkcyjnej (cGMP). Więcej informacji na temat automatyzacji i wykorzystania roślinnego systemu produkcji białek przejściowych do produkcji białek rekombinowanych, w tym kandydatów na szczepionki podjednostkowe, w warunkach cGMP, czytelnicy są odsyłani do strony internetowej www.fhcmb.org/.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. oraz Defense Advanced Research Projects Agency (grant # HDTRA1-07-C-0054). Autorzy dziękują za hojne dary od dr Stantona Gelvina z Wydziału Nauk Biologicznych, Purdue University (szczepy Agrobacterium tumefaciens) i Wayne'a Fitzmaurice'a z Large Scale Biology Corp. (nasiona N. excelsiana), a także Jennifer Nicholson z US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior nasiona). Autorzy dziękują Margaret Shillingford i Christopherowi Hullowi za dostarczenie roślin i doskonałą pomoc techniczną. Autorzy dziękują również doktorom Stephenowi Streatfieldowi i Natashy Kushnir za pomoc redakcyjną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nicotiana benthamianaKolekcja plazmy zarodkowej tytoniu, Dział Nauk o Uprawach, Uniwersytet Stanowy Karoliny PółnocnejPI 555478 Infiltracja TW16
Nicotiana excelsiorKolekcja plazmyzarodkowej tytoniu, Departament Nauk o Uprawach, Uniwersytet Stanowy Karoliny PółnocnejPI 555685 TW47Infiltracja
Nicotiana excelsianaDr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CALSBC EBA 042304.02Infiltracja
Płoza próżniowaAbbas, Ashland, MAWykonana na zamówienieinfiltracja roślin
RockwoolGrodan Inc., Ontario, KanadaAO 50/40Pożywka hydroponiczna do uprawy roślin
Kwas 2-(N-Morfolino) etanosulfonowyAcros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ172595000Bufor
Murashige & Sól Skoog (sól MS)Laboratorium fitotechnologiiM524Pożywki do hodowli tkankowych
AcetosyringoneSigma-Aldrich, St. Louis, MOD134406-5GIndukcja Agrobacterium
Membrana transferowa Immobilon-PMillipore, Billerica, MAIPVH00010Western blotting
I-blockApplied Biosystems, Foster City, CAT2015Western blotting
Surowica przeciw poliklonalnej surowicy anty-GFP królika Washington Biotechnology, Baltimore, MDWestern blotting
Mouse anti– przeciwciało monoklonalne poli-histydynyQiagen GmbH, Hilden34670Western blotting
Przeciwciało anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA111-035-003Western blotting
Przeciwciało anty-mysie sprzężone z peroksydazą chrzanowąJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115-035-003Western blotting
SuperSignal® Podłoże chemiluminescencyjne West PicoThermo Scientific Pierce, Rockford, IL34078Porosty zachodnie
1-3: 1-4-beta-D-glukan)Megazyme, Bray, Co. Wicklow, IrlandiaP-LICHNAktywność porchazy
Kongo Czerwony Sigma-Aldrich, St. Louis, MOC6277Barwienie żelem
Aparat cyfrowy Olympus, Center Valley, PAC-8080Obrazowanie chemiluminescencyjne
GeneGnomeSyngene, Frederick, MDObrazowanie chemiluminescencyjne 
Norma GFP Wykonane we własnym zakresieobrazowanie chemiluminescencyjne 
Roztwór nawozu do roślinGriffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE67-23-20Uprawa roślin
Lichenaza StandardOczyszczony we własnym zakresieWestern blotting
MicroPulserElectroporator BioRad, Hercules, CA165-2100Transformacja Agrobacterium 
(

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, , Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Agrobacterium mediated Transient Protein ProductionVacuum Infiltration TechniqueNicotiana Species SelectionAgrobacterium Strain OptimizationHydroponic Plant GrowthViral RNA Silencing SuppressorGFP Expression AnalysisWestern Blot DetectionFluorescence Assay QuantificationIndustrial scale Protein Production

Powiązane artykuły