Artykuł metodologiczny

Optymalizacja i wykorzystanie produkcji białek przejściowych za pośrednictwem Agrobacterium w Nicotiana

42.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51204

⸱

19 kwietnia 2014

 ,  ,  , 
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

W tym artykule

Podsumowanie

Produkcja białka przejściowego w roślinach Nicotiana oparta na infiltracji próżniowej za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe (oparte na wirusie mozaiki tytoniu) jest szybkim i ekonomicznym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych. Uprościliśmy procedurę i poprawiliśmy akumulację celu, optymalizując warunki hodowli bakterii, dobierając gatunki gospodarzy i współwprowadzając supresory wyciszające RNA.

Streszczenie

Produkcja białek przejściowych w roślinach za pośrednictwem Agrobacterium jest obiecującym podejściem do produkcji antygenów szczepionkowych i białek terapeutycznych w krótkim czasie. Jednak technologia ta dopiero zaczyna być stosowana w produkcji na dużą skalę, ponieważ obecnie pokonuje się wiele przeszkód technologicznych związanych z zwiększaniem skali. W tym miejscu demonstrujemy prostą i powtarzalną metodę produkcji białek przejściowych na skalę przemysłową opartą na infiltracji próżniowej roślin Nicotiana za pomocą agrobakterii przenoszących wektory startowe. Optymalizacja hodowli Agrobacterium w pożywce AB pozwala na bezpośrednie rozcieńczenie kultury bakteryjnej w wodzie Milli-Q, upraszczając proces infiltracji. Spośród trzech badanych gatunków Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) została wybrana jako najbardziej obiecujący żywiciel ze względu na łatwość infiltracji, wysoki poziom produkcji białka reporterowego i około dwukrotnie wyższą produkcję biomasy w kontrolowanych warunkach środowiskowych. Indukcja Agrobacterium zawierającego pBID4-GFP (oparty na wirusie mozaiki tytoniu) przy użyciu substancji chemicznych, takich jak acetosyringon i monosacharyd, nie miała wpływu na poziom produkcji białka. Infiltracja rośliny pod ciśnieniem od 50 do 100 mbar przez 30 lub 60 sekund spowodowała około 95% infiltracji tkanek liści roślin. Infiltracja laboratoryjnym szczepem Agrobacterium GV3101 wykazała najwyższą produkcję białka w porównaniu z laboratoryjnymi szczepami Agrobacteria LBA4404 i C58C1 oraz szczepami Agrobacteria typu dzikiego w at6, at10, at77 i A4. Jednoczesna ekspresja wirusowego supresora wyciszającego RNA, p23 lub p19, u N. benthamiana skutkowała wcześniejszą akumulacją i zwiększoną produkcją (15-25%) białka docelowego (hemaglutyniny wirusa grypy).

Wprowadzenie

Rośliny są teraz uznawane za bezpieczną, niezawodną, skalowalną i tanią platformę do produkcji heterologicznych rekombinowanych biofarmaceutyków i białek przemysłowych1-3 i mają ważne zalety w porównaniu z systemami ekspresji mikroorganizmów i komórek zwierzęcych4. Rośliny są zdolne do ekspresji prawidłowo pofałdowanych białek z modyfikacjami potranslacyjnymi, w tym złożonymi przeciwciałami multimerycznymi5-7. Kilka rekombinowanych białek farmaceutycznych pochodzenia roślinnego jest obecnie poddawanych ocenie klinicznej8. Należą do nich specyficzne dla pacjenta rekombinowane szczepionki idiotypowe (scFv) stosowane w leczeniu chłoniaka nieziarniczego9, kandydaci na szczepionki przeciw grypie pandemicznej i sezonowej na bazie hemaglutyniny10,11 (Cummings i wsp., zgłoszone do szczepienia), przeciwciało antygenu powierzchniowego I/II przeciwko Streptococcus do leczenia próchnicyzębów 12 oraz insulina ludzka do leczenia cukrzycy13. Ponadto, ludzka rekombinowana glukocerebrozydaza do enzymatycznej terapii zastępczej u pacjentów z chorobą Gauchera została zatwierdzona w Izraelu i USA i jest dostarczana w ramach Programu Rozszerzonego Dostępu poza USA14,15.

Heterologiczne białka mogą być wytwarzane w stabilnie przekształconych (transgenicznych lub transplastomicznych) lub przejściowo przekształconych roślinach. Przejściowa produkcja białek ma kilka zalet w porównaniu z produkcją w roślinach transgenicznych, w tym krótki czas na osiągnięcie ekspresji i akumulacji16 i może być osiągnięta poprzez wprowadzenie bakteryjnych wektorów binarnych lub rekombinowanych roślinnych wektorów wirusowych do tkanek roślinnych4. Najbardziej zaawansowany system ekspresji stanów przejściowych opiera się na wykorzystaniu "wektorów startowych", które łączą składniki wirusów roślinnych i plazmidów binarnych i są dostarczane przez agroinfiltrację17,18. Agroinfiltracja wektora startowego opartego na wirusie mozaiki tytoniu (TMV) została z powodzeniem zastosowana na skalę laboratoryjną do produkcji antygenów szczepionkowych przeciwko patogenom, takim jak wirus brodawczaka ludzkiego19, Yersinia pestis20, wirusy grypy A21,22, Bacillus anthracis23 i wirus ospy prawdziwej24 w liściach N. benthamiana. Ekspresja przejściowa za pośrednictwem Agrobacterium jest również obiecującą metodą jednoczesnej produkcji wielu białek2,25-27. Na przykład roślinne przejściowe systemy ekspresji wykorzystano do produkcji rekombinowanych przeciwciał specyficznych dla nowotworu28,29, glikozylowanego rekombinowanego przeciwciała przeciwko receptorowi naskórkowego czynnika wzrostu30 oraz przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla antygenu ochronnego wąglika31,32. Jednoczesna infiltracja roślin Nicotiana benthamiana za pomocą genu docelowego i supresora wyciszania genów powoduje zwiększoną ekspresję białka docelowego33,34.

Agroinfiltracja to powszechna metoda równomiernego wprowadzania bakterii zawierających interesujący gen do tkanek roślinnych35-37. Infiltracja próżniowa Agrobacterium w celu przejściowej ekspresji genów w nienaruszonych liściach roślin jest szybką, skalowalną i użyteczną metodą produkcji obcych białek bez konieczności generowania roślin transgenicznych38-41. Podczas agroinfiltracji próżniowej rośliny są odwracane do góry nogami, a części nadziemne zanurzane w zawiesinie Agrobacterium. Następnie stosuje się próżnię, powodując ewakuację gazów z przestrzeni międzykomórkowych liści przez aparaty szparkowe. Szybki wzrost ciśnienia po uwolnieniu podciśnienia powoduje wlew zawiesiny Agrobacterium do liścia. Po infiltracji próżniowej agrobakterii rośliny są dalej uprawiane i monitorowana jest ekspresja celu. Najwyższe poziomy ekspresji docelowej obserwuje się zwykle 2-3 dni po infiltracji (dpi) w przypadku wektora binarnego i 4-7 dpi w przypadku wektora startowego, po czym poziom ekspresji zwykle spada17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens jest najczęściej stosowanym nośnikiem do dostarczania interesującego genu do rośliny w celu produkcji białka. Agroinfiltracja działa wyjątkowo dobrze w przypadku N. benthamiana, ale stosunkowo słabo w przypadku większości innych roślin, w tym Arabidopsis thaliana46.

W tym badaniu opracowaliśmy prostą, efektywną i ekonomiczną metodę przejściowej produkcji białka u 5-6 tygodniowego N. benthamiana za pomocą infiltracji A. tumefaciens. Główną wadą przemysłowego skalowania techniki agroinfiltracji jest odwirowanie zebranych bakterii i ponowne zawieszenie osadu bakteryjnego w pożywce zawierającej 4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenon (acetosyringon), monosacharydy i bufor kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego (MES) do indukcji genów wirusa. Udało nam się przezwyciężyć te problemy poprzez optymalizację wzrostu Agrobacterium w pożywce AB (pożywka minimalna), a następnie bezpośrednie rozcieńczenie w wodzie Milli-Q oraz kontrolowanie czasu i warunków infiltracji. Porównaliśmy również docelową produkcję białka w gatunkach żywicieli tytoniu typu dzikiego N. benthamiana i N. excelsior, a także w hybrydach N. excelsiana.

Protokół

1. Uprawa roślin

Do późniejszej agroinfiltracji oceniliśmy dwa dzikie gatunki Nicotiana (N. benthamiana i N. excelsior) oraz hybrydę (N. excelsiana) uprawianą hydroponicznie na wełnie mineralnej w pomieszczeniach zamkniętych.

  1. Namocz płyty z wełny mineralnej w roztworze nawozu roślinnego.
  2. Wysiewaj nasiona N. benthamiana, N. excelsior i N. excelsiana typu dzikiego (hybryda N. benthamiana × N. excelsior) na nasączonej składnikami odżywczymi powierzchni wełny mineralnej.
  3. Rośliny z nasion należy uprawiać w kontrolowanych warunkach (24 °C i 40-65% wilgotności względnej) i fotoperiodzie długiego dnia (14 godzin światła i 10 godzin ciemności, przy oświetleniu 130-150 μE m-2 sec-1) przez 4-5 tygodni dla N. benthamiana i N. excelsiana oraz 5-6 tygodni dla N. excelsior.

2. Budowa wektorów do agroinfiltracji

  1. Wprowadzić syntetyczny gen reporterowy (białko zielonej fluorescencyjnej [GFP]), hemaglutyninę (HA) o pełnej długości ze szczepu wirusa grypy A/California/04/2009 (HAC1) i zmodyfikowany enzym porchanazy (LicKM)18 oddzielnie do wektora startowego pBID418 (wektor oparty na TMV) w celu uzyskania pBID4-GFP, pBID4-HAC1 i pBID4-LicKM, odpowiednio18,32,41,47.
  2. Wprowadzić 10-50 ng pBID4 przenoszącego GFP lub HAC1 do elektrokompetentnych komórek szczepu A. tumefaciens GV3101 i LicKM do elektrokompetentnych komórek szczepów A. tumefaciens GV3101, C58C1, GLA4404, At06, At10, At77 i A4 za pomocą elektroporatora genu MicroPulser.
  3. Użyj przekształconych agrobakterii do eksperymentów infiltracyjnych, chyba że zaznaczono inaczej.

3. Próżniowa infiltracja Agrobacterium do roślin Nicotiana

  1. Szczepy A. tumefaciens należy uprawiać przez noc (O/N) na pożywce LB, pożywce YEB lub pożywce AB uzupełnionej 50 mg/l kanamycyny w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem przy 200-250 obr./min.
  2. Rozcieńczyć agrobakterie w wodzie Milli-Q do gęstości optycznej przy 600 nm (A600) 0,5 lub odwirować komórki Agrobacterium wyhodowane w LB lub YEB lub AB w temperaturze 4 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w pożywce indukcyjnej (1x sól MS, 10 mM MES, 200 μM acetosyringon, 2% sacharozy [MMA]) do A600 0,5, i mieszać w temperaturze pokojowej przez 1-3 godziny, chyba że zaznaczono inaczej.
  3. Naciekać rośliny w komorze próżniowej, zanurzając tkanki powietrzne rośliny Nicotiana w zawiesinie Agrobacterium i stosując próżnię 50-400 mbar na 30 lub 60 sekund. Optymalna infiltracja jest rutynowo stosowana przy ciśnieniu 50-100 mbar przez 60 sekund.
  4. Po przerwaniu próżni usuń rośliny z komory próżniowej, spłucz w wodzie i rosnąć przez 5-7 dni w tych samych warunkach wzrostu, które są używane do wzrostu przed infiltracją.
  5. W celu zbadania skuteczności substancji chemicznych indukujących gen Agrobacterium vir, do agrobakterii zawieszonych w buforze infiltracyjnym dodano różne stężenia acetosyringonu (0, 100, 200 lub 400 μM) (1x MS, 10 mM MES, 2% glukozy). Ze względu na wpływ monosacharydu na indukcję genu vir, różne procenty glukozy (0, 1, 2 lub 4%) dodawano do agrobakterii zawieszonych w buforze naciekowym (1x MS, 10 mM MES, 200 μM acetosyringonu). Rośliny N. benthamiana zostały zinfiltrowane, jak wspomniano powyżej w krokach 3.3 i 3.4).
  6. Szczepy laboratoryjne Agrobacterium GV3101, C58C1 i LBA4404 oraz szczepy typu dzikiego A4, At06, At10 i At77 zawierające wektor pBID4-LicKM rozcieńczono w wodzie Milli-Q do A600 0,5. Rośliny N. benthamiana zostały przesiąknięte każdym konkretnym szczepem, jak wspomniano powyżej w krokach 3.3 i 3.4.

4. Procedura ko-agroinfiltracji dla supresora wyciszającego wirusa

  1. Wymieszać rozcieńczone wodą kultury Milli-Q Agrobacterium GV3101 zawierające gen GFP i supresor wyciszający p19 wirusa krzaczastego karłowatości pomidora (TBSV) w proporcjach 1:1, 2:1, 3:1 i 4:1. Naciekać rośliny N. benthamiana zgodnie z powyższym opisem.
  2. Naciekać rośliny N. benthamiana mieszaniną dwóch rozcieńczonych wodą kultur Agrobacterium GV3101 rozcieńczonych w wodzie Milli-Q: pierwsza przenosząca plazmid pBID4-HAC1, a druga przenosząca jeden z supresorów wyciszających – p19 TBSV lub p23 wirusa Citrus tristeza, odpowiednio w plazmidzie pCassp (pCassp19) i w plazmidzie binarnym pGR pod promotorem 35S (pGR-P23), w stosunku 4:1.

5. Analiza Western Blot

  1. Zbierz losowe próbki liści z roślin N. benthamiana, N. excelsior lub N. excelsiana w temperaturze 4-7 dpi i sproszkowaj w ciekłym azocie na drobny proszek.
  2. Do każdej próbki dodać trzy objętości buforu 1x PBS zawierającego 0,5% Triton X-100.
  3. Delikatnie wstrząsać wyekstrahowanymi próbkami przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Wiruj ekstrakt przez 5 minut i zbierz całkowite rozpuszczalne białko do czystej probówki Eppendorfa.
  5. Rozcieńczyć ekstrakty do odpowiedniego rozcieńczenia (1:50 1:100) w 1x buforze ekstrakcyjnym PBS i dodać 5× buforu próbki (250 mM Tris-HCl [pH 6,8], 10% SDS, 0,5% błękitu bromofenolowego, 50% glicerolu v/v i 500 mM DTT) do końcowego stężenia 1×.
  6. Gotuj próbki przez 5 minut.
  7. Oddziel białka przez 10% SDS-PAGE, przenieś na błonę transferową Immobilon-P i zablokuj 0,5% I-blokiem.
  8. Wykryć GFP za pomocą króliczej poliklonalnej surowicy anty-GFP w stosunku 1:5 000 i HAC1 za pomocą mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-polihistydyny w stosunku 1:1 000 w roztworze blokującym przez 1 godzinę.
  9. Po znakowaniu przeciwciałami pierwotnymi przemyć błony trzy razy przez 10 minut każdą 1× PBST-20 i inkubować z przeciwciałem antykróliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) w stosunku 1:5 000 lub przeciwciałem anty-mysim sprzężonym z HRP w stosunku 1:10 000 przez 1 godzinę, odpowiednio w celu wykrycia GFP i HAC1.
  10. Przetwarzaj Western blot przy użyciu substratu chemiluminescencyjnego SuperSignal West Pico.
  11. Użyj oprogramowania GeneTools, aby przeanalizować intensywność pasma białka i uzyskać skalibrowaną ilość prążka.

Produkcja białka: (Skalibrowana ilość x rozcieńczenie próbki)/ilość załadowanej próbki) x 4 = mg/kg.
Równanie: produkcja białka (P), skalibrowana ilość (C), rozcieńczenie próbki (D) i ilość załadowanej próbki (S).

6. Test Zymogramu

  1. Zbierz losowe próbki tkanek N. benthamiana infiltrowane pBID4-LicKM.
  2. Ekstrahuj białka przy użyciu tych samych metod, które opisano powyżej, do analizy Western blot, a następnie analizuj za pomocą 10% SDS-PAGE z 0,1% porostem zawartym w żelach.
  3. Po elektroforezie przemyć żele dwa razy przez 10 minut każdy w buforze do przemywania (100 mM Tris-HCl [pH 8,0] i 0,1% Triton X-100), a następnie inkubować w buforze do przemywania w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę.
  4. Po inkubacji wyrzucić bufor do przemywania i zabarwić żele 0,5% czerwienią Kongo przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Opłucz żele w wodzie Milli-Q trzy razy przez 10 minut każdy i dodaj 1 M NaCl, aby uwidocznić aktywność liczenanazy. Oczyszczone białko porazazy bakteryjnej zastosowano jako pozytywną kontrolę aktywności enzymu.

7. Obrazowanie GFP

  1. Wykonaj wizualną detekcję fluorescencji GFP w całych przejściowo przekształconych roślinach za pomocą ręcznej lampy UV o długiej fali.
  2. Fotografuj przejściowo przekształcone rośliny aparatem cyfrowym przez filtr Yellow 8, ES 52 (czas naświetlania, 15 sekund).
  3. Uzyskaj obrazy z analiz Western blot za pomocą oprogramowania GeneSnap na GeneGnome i określ ilościowo wyniki za pomocą oprogramowania GeneTools, z krzywą kalibracyjną opartą na oczyszczonym wzorcu GFP.
  4. Określić ilościowo białko HAC1 za pomocą krzywej kalibracyjnej opartej na oczyszczonym wzorcu białka HAC ze szczepu A/Indonesia/05/05 wirusa grypy.
  5. Oblicz średnie wartości z 3–4 powtórzeń dla wszystkich eksperymentów.

Wyniki

Wymagania odżywcze dla wzrostu roślin. Zastosowanie hydroponicznego podłoża do wzrostu roślin (wełna mineralna) oraz roztworu odżywczego zapewnia jednolity wzrost N. benthamiana i eliminuje komplikacje (mechaniczne, regulacyjne i wydajnościowe) związane z wykorzystaniem gleby do uprawy roślin. Hodowaliśmy N. benthamiana na płytach z wełny mineralnej nasączonych dostępnymi komercyjnie nawozami, aby określić optymalne warunki wzrostu roślin i akumulacji biomasy. Zaobserwowaliśmy 95-100% kiełkowania nasion. Należy zauważyć, że dodatek fosforu jest kluczowy dla uzyskania kiełkowania, ponieważ stwierdziliśmy, że roztwór odżywczy pozbawiony fosforu nie wspierał kiełkowania i wzrostu nasion N. benthamiana (Rysunek 1A).

Wpływ pożywek do wzrostu i infiltracji Agrobacterium na kondycję roślin i produkcję białek. Przetestowaliśmy kilka warunków hodowlanych w celu optymalizacji wydajności techniki agroinfiltracji w produkcji na dużą skalę. Bakterie (szczep A. tumefaciens GV3101) zawierające konstrukt pBID4-GFP hodowano przez noc w różnych pożywkach (YEB, LB lub AB), a następnie albo wirowano i zawieszano ponownie w pożywce indukcyjnej (MMA) (zawierającej 1× mieszaninę soli podstawowych Murashige & Skoog [MS], 10 mM MES pH 5.6, 20 g/L sacharozy i 200 µM acetosyringonu), albo rozcieńczano w wodzie Milli-Q do A600 wynoszącej 0.5 przed zastosowaniem do infiltracji roślin. Zaobserwowaliśmy, że infiltracja próżniowa roślin bakteriami rozcieńczonymi w wodzie prowadziła do produkcji białek porównywalnej z wynikami uzyskanymi przy użyciu jakichkolwiek pożywek do infiltracji opisanych w poprzednich raportach42,48. W przeciwieństwie do tego, infiltracja nierozcieńczonymi Agrobacteria hodowanymi na pożywkach YEB lub LB skutkowała całkowitym więdnięciem liści N. benthamiana w czasie krótszym niż 24 h po infiltracji, podczas gdy nierozcieńczone Agrobacteria hodowane na pożywce AB nie miały wpływu na kondycję infiltrowanych roślin (dane nie pokazano). Jak przedstawiono na Rysunku 1B, rośliny infiltrowane kulturami Agrobacterium hodowanymi na pożywkach YEB, LB lub AB i rozcieńczonymi wodą Milli-Q (1:5, A600 od 0.6-0.8 lub 1:10, A600 od 0.3-0.4) nie wykazały żadnych objawów i osiągnęły średnią produkcję GFP wynoszącą odpowiednio 1645, 1520 i 1839. Agrobacteria wirowane i zawieszone ponownie w pożywce indukcyjnej (MMA) nie wywołały żadnych objawów i nie wykazały istotnych różnic w produkcji białek w porównaniu do Agrobacteria rozcieńczonych bezpośrednio w wodzie Milli-Q (odpowiednio 1671 ± 102 i 1667 ± 131 mg/kg). W związku z tym, do rozcieńczania kultur Agrobacterium do infiltracji roślin zaleca się stosowanie wody Milli-Q, którą rutynowo wykorzystywano w naszych kolejnych eksperymentach w celu uzyskania A600 na poziomie 0.5.

Wpływ gęstości zawiesiny komórek Agrobacterium oraz przebiegu czasowego na ekspresję celu. Następnie zbadano, czy gęstość komórek bakteryjnych wpływa na wydajność infiltracji oraz poziomy ekspresji celu. W tym celu oceniono cztery różne gęstości zawiesiny komórek Agrobacterium niosących pBID4-GFP, przy A600 wynoszących 1,0, 0,5, 0,1 i 0,05. Po infiltracji monitorowano rośliny N. benthamiana pod kątem rozwoju widocznych objawów oraz przebiegu czasowego ekspresji celu, pobierając próbki w 4, 7 i 10 dpi. W 4 dpi zaobserwowano wyraźne różnice w fluorescencji GFP pomiędzy roślinami infiltrowanymi zawiesinami komórek Agrobacterium o różnych gęstościach (przy A600 0,05 nie zaobserwowano ekspresji GFP). W 7 dpi fluorescencja GFP była podobna w roślinach infiltrowanych zawiesinami o gęstościach A600 1,0, 0,5 i 0,1, ale była niższa w roślinach infiltrowanych przy A600 0,05. Jak pokazano na Rysunku 1C, dane te potwierdzono analizami Western blot próbek pobranych w 4 dpi, które wykazały bardzo niską produkcję białka przy A600 0,05 (5 mg/kg) i najwyższą przy A600 1,0 (1739 mg/kg). W 7 dpi rośliny nie wykazały istotnych różnic w szacowanej produkcji GFP przy A600 1,0, 0,5 i 0,1 (odpowiednio 1662, 1870 i 1890), natomiast przy A600 0,05 odnotowano niższą produkcję GFP (1199 mg/kg). W przeciwieństwie do tego, w 10 dpi nie zaobserwowano różnic w produkcji GFP pomiędzy roślinami infiltrowanymi każdą z czterech gęstości zawiesiny komórek (1218, 1181, 1197 i 1304).

Infiltracja alternatywnymi szczepami Agrobacterium. Aby zwiększyć różnorodność szczepów Agrobacterium dostępnych do przejściowej produkcji białek, przetestowano izolaty typu dzikiego. Szczepy te, wyizolowane z narośli galowych naturalnych gospodarzy, zostały udostępnione przez dr. Gelvina (Purdue University, West Lafayette, Indiana). W celu zbadania ich użyteczności w przejściowej produkcji białek, przeprowadzono infiltrację N. benthamiana następującymi szczepami niosącymi pBID4-LicKM18: A. rhizogenes (A4) oraz szczepami typu dzikiego Nester A. tumefaciens A348, A208 i A281 (nazwanymi odpowiednio At6, At10 i At77), a także zmodyfikowanymi szczepami laboratoryjnymi A. tumefaciens GV3101, C58C1 i LBA4404. Zainfiltrowane liście zebrano w 7 dpi, a poziom ekspresji LicKM oszacowano za pomocą analizy Western blot. Jak pokazano na Ryc. 2A, najwyższy poziom produkcji LicKM można było osiągnąć przy użyciu szczepów GV3101, A4 i LBA4404 (~1,750 ± 163, 1,650 ± 26 i 1,450 ± 117 mg/kg, odpowiednio), z niewielkimi różnicami; najniższy poziom ekspresji (~900 ± 102 mg/kg) uzyskano dla C58C1, a produkcję pośrednią dla At6, At10 i At77 (~1,250 ± 19, 1,100 ± 42 i 1,200 ± 111 mg/kg, odpowiednio). Aktywność enzymatyczną lichenazy wykazano za pomocą analizy zymogramu. Ryc. 2B pokazuje, że lichenaza wytworzona w zainfiltrowanych tkankach roślinnych przy użyciu dowolnego ze szczepów Agrobacterium była aktywna enzymatycznie. Należy również zauważyć, że rośliny N. benthamiana zainfiltrowane szczepami A4 i At77 wykazywały objawy patologiczne (zakarłowacenie, wydłużenie i skręcanie ogonków liściowych oraz zwijanie się liści), podczas gdy w przypadku szczepu At10 objawy były łagodne. Nie zaobserwowano żadnych objawów u roślin N. benthamiana zainfiltrowanych szczepem laboratoryjnym GV3101 (Ryc. 2C).

Infiltracja alternatywnych gatunków Nicotiana. Porównaliśmy tempo przyrostu biomasy i produkcji białek u dwóch gatunków dzikich z rodzaju Nicotiana (N. benthamiana oraz N. excelsior) oraz u gatunku hybrydowego, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior). Spośród badanych gatunków, N. benthamiana, powszechnie stosowany gospodarz do przejściowej produkcji białek z wykorzystaniem systemów ekspresyjnych opartych na Agrobacterium lub wektorach wirusowych2,34,49, osiąga gotowość do infiltracji w ciągu 4-5 tygodni od kiełkowania. Niezbędny okres wzrostu w celu uzyskania optymalnego poziomu biomasy wynosi również 4-5 tygodni dla N. excelsiana, natomiast jest dłuższy (6-7 tygodni) dla N. excelsior. Ponadto, w porównaniu z innymi gatunkami Nicotiana, u N. excelsior międzywęźla roślin są stosunkowo krótkie.

Ponadto zaobserwowaliśmy, że infiltracja próżniowa N. benthamiana oraz N. excelsiana przy 50-250 mbar przez 60 s jest bardzo wydajna w przypadku agroinfiltracji całych liści, podczas gdy N. excelsior jest trudna do infiltracji ze względu na niższą koronę i skórzaste liście, nawet gdy próżnia była stosowana trzykrotnie po 1 min w obecności niejonowych surfaktantów, takich jak Sillwet-77 lub S240. Ponadto wskaźnik kiełkowania nasion N. excelsiana oraz N. excelsior wynosił ~40-50%; aby zwiększyć wskaźnik kiełkowania do 90-100%, nasiona należy traktować 10% wybielaczem przez 1 h przed wysiewem. W tych samych warunkach wzrostu najwyższa biomasa liści, jaką można uzyskać z N. excelsiana, jest około dwukrotnie wyższa w porównaniu z N. benthamiana (Tabela 1).

Produkcję białka badano u N. benthamiana, N. excelsior oraz N. excelsiana infiltrowanych szczepem Agrobacterium GV3101 zawierającym pBID4-GFP. Akumulację GFP oceniano w 7 dpi w całych infiltrowanych liściach przy użyciu światła UV, a następnie za pomocą analizy Western blot. Rycina 3A pokazuje równomierny rozkład GFP u N. benthamiana i N. excelsiana oraz nierównomierny rozkład u N. excelsior (ze względu na trudności w infiltracji całej powierzchni liścia N. excelsior). Rycina 3B przedstawia poziom produkcji GFP oszacowany poprzez naświetlanie światłem UV w infiltrowanych liściach pobranych od trzech gatunków Nicotiana w 7 dpi. Poziom akumulacji GFP był wyższy u N. benthamiana (~2,23 g/kg) niż u N. excelsiana i N. excelsior (~1,89 i 1,54 g/kg, odpowiednio). Niski poziom produkcji białka u N. excelsior wynika z nierównomiernej infiltracji i rozkładu zakumulowanego GFP w pobranym liściu.

Zaobserwowaliśmy, że górne liście bezpośrednio wystawione na działanie światła często wykazują wcześniejszą i wyższą akumulację przejściową GFP (w 2-4 dpi) niż liście znajdujące się pod baldachimem. Jednak w naszych badaniach akumulacja GFP była najwyższa w 7 dpi i była rozmieszczona równomiernie w większości liści, z wyjątkiem nieinfiltrowanych, nowo wyrastających liści, w których nie stwierdzono akumulacji GFP.

Wpływ ciśnienia próżniowego i czasu jego trwania na przejściową produkcję białek. Infiltracja próżniowa znacząco zwiększa poziomy przejściowej ekspresji w porównaniu do ciśnienia przyłożonego podczas iniekcji ręcznej za pomocą strzykawki bezigłowej42. Zastosowanie próżni powoduje usunięcie gazów z zanurzonych liści roślin poprzez aparaty szparkowe. W momencie przerwania próżni i gwałtownego wzrostu ciśnienia, zawiesina Agrobacterium jest wtłaczana do liści w miejsce usuniętych gazów50.

Aby zbadać wpływ ciśnienia próżniowego na liście N. benthamiana, przeprowadzono infiltrację roślin szczepem Agrobacterium GV3101 zawierającym pBID4-GFP przy różnych wartościach ciśnienia próżniowego (50-400 mbar) przez 30 lub 60 s. Wykazano, że zastosowanie silniejszej próżni (poniżej 50 mbar) przez 30 lub 60 s powoduje uszkodzenia mechaniczne infiltrowanych liści, co prowadzi do więdnięcia tkanek i obumarcia rośliny w krótkim czasie po infiltracji (24-48 h). Z kolei zastosowanie łagodniejszej próżni (400 mbar) skutkuje infiltracją jedynie 50% powierzchni liścia oraz obniżeniem poziomu produkcji GFP (303 ± 90 mg/kg) (Rysunek 4A). Co istotne, nie zaobserwowano różnic w produkcji GFP przy ciśnieniu 50, 100 i 200 mbar (odpowiednio 1,651 ± 107, 1,688 ± 40, 1,594 ± 26 mg/kg) (Rysunek 4A), a zastosowanie ciśnienia próżniowego od 50 do 200 mbar przez 30 lub 60 s miało niewielki lub żaden negatywny wpływ na kondycję roślin. W związku z tym do eksperymentów z infiltracją zaleca się stosowanie ciśnienia próżniowego w zakresie 50-100 mbar.

Wpływ czasu trwania próżni na ekspresję celu oceniono poprzez infiltrowanie jednej kasetki roślin N. benthamiana co godzinę za pomocą zawiesiny GV3101 niosącej pBID4-GFP o A600 wynoszącej 0,5 przez 8 h, korzystając z tej samej kultury Agrobacterium. Rycina 4B pokazuje, że poziom produkcji GFP był podobny we wszystkich punktach czasowych do 8 h, co sugeruje, że w tym okresie Agrobacterium zachowuje zdolność do wprowadzania jednoniciowego DNA.

Wpływ indukcji chemicznej na produkcję białek. Niektóre fenolowe metabolity roślinne oraz cukry mogą indukować geny wirulencji A. tumefaciens1,52. W konsekwencji doniesiono, że wiele substancji chemicznych i monosacharydów zwiększa przejściową produkcję białek u różnych gatunków roślin. Acetosyringon jest najczęściej dodawany do kultur A. tumefaciens w celu indukcji operonu vir przed agroinfiltracją40,53-57.

Oceniliśmy wpływ różnych stężeń acetosyringonu (0, 100, 200 i 400 µM) oraz glukozy (0-4%) na przejściową produkcję białka GFP w N. benthamiana infiltrowanej szczepem Agrobacterium GV3101 zawierającym pBID4-GFP. W tym celu komórki Agrobacterium resuspendowano w pożywce indukcyjnej MMA zawierającej różne stężenia acetosyringonu i glukozy na 1-3 h przed infiltracją. Zgodnie z wynikami obserwacji wizualnej (dane nie pokazano) oraz analizy Western blot (Rysunek 4C), żadne z testowanych stężeń tych związków nie wywołało znaczącego wzrostu fluorescencji GFP ani produkcji białka w porównaniu z kontrolą, w której pożywka indukcyjna nie zawierała acetosyringonu ani glukozy.

Wpływ ko-infiltracji supresora wyciszania na przejściową produkcję genów GFP i HAC1 w liściach N. benthamiana. Wcześniej wykazano, że ko-ekspresja supresora wyciszania (p19 wirusa Tomato bushy stunt virus [TBSV]) zakłóca posttranskrypcyjne wyciszanie genów (PTGS), co skutkuje zwiększoną produkcją białek reporterowych34.

Oceniliśmy wpływ ko-infiltracji N. benthamiana wektorem startowym niosącym gen reporterowy GFP (pBID4-GFP) oraz p19. Przed infiltracją rozcieńczenia kultur A. tumefaciens GV3101 zawierających pBID4-GFP i p19 o A600 wynoszącym 0,5 zmieszano odpowiednio w stosunkach 1:1, 2:1, 3:1 oraz 4:1. Ekspresja supresora wyciszania była kontrolowana przez promotor 35S Cauliflower mosaic virus. Jak wskazują wyniki analizy Western blot w 7. dniu po infekcji (Rycina 5A), obecność p19 nie zwiększyła ani nie zmniejszyła produkcji GFP w N. benthamiana przy żadnym ze stosunków obu zawiesin Agrobacterium.

Porównaliśmy również wpływ dwóch wirusowych supresorów wyciszania genów – p23 oraz p19 – na zapobieganie PTGS w przypadku HAC1. Kultury Agrobacterium niosące wektor startowy pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009) oraz jeden z dwóch plazmidów z supresorem wyciszania rozcieńczono do A600 wynoszącej 0.5, zmieszano w stosunku odpowiednio 4:1 i współinfiltrowano do 4-5-tygodniowych roślin N. benthamiana. Jako kontrolę infiltrowano zawiesinę A. tumefaciens niosącą wyłącznie pBID4-HAC1. Próbki infiltrowanych liści pobierano od 3 do 8 dpi. Eksperyment powtórzono trzykrotnie, a średnie poziomy ekspresji HAC1 określono za pomocą analizy Western blot.

Jak pokazano na Rysunku 5B, współinfiltracja N. benthamiana białkami p23 lub p19 doprowadziła do zwiększenia produkcji HAC1 (odpowiednio 642 ± 157 i 764 ± 108 mg/kg) w porównaniu z brakiem zastosowania supresora wyciszania (odpowiednio o około 15-25%) w 6 dpi. Sugeruje to, że p23 i p19 są wydajne w naszym systemie. Należy jednak zauważyć, że akumulacja HAC1 nastąpiła dzień wcześniej, gdy pBID4-HAC1 współinfiltrowano z p19. Zatem nasze wyniki wykazują, że wpływ supresora wyciszania p19 na akumulację HAC1 i GFP jest różny, co sugeruje selektywne wzmocnienie przejściowej ekspresji i/lub stabilności niektórych białek w N. benthamiana.

Zaobserwowaliśmy również, że zarówno w obecności, jak i w nieobecności supresora wyciszania, poziom produkcji białka HAC1 zaczął spadać w 7 dpi. Wskazuje to, że czas spadku przejściowej produkcji białka w N. benthamiana infiltrowanej wektorem startowym jest specyficzny dla celu.

Bank komórek Agrobacterium zawierający wektor startowy był co roku oceniany pod kątem stabilności genu docelowego, żywotności Agrobacterium oraz poziomu akumulacji białka. Wykazano, że zapas glicerolowy banku komórek szczepu GV3101 przekształconego pBID4-HAC1, przechowywany w temperaturze -80 °C, jest bardzo stabilny przez ponad trzy lata, bez zmian w poziomie przejściowej produkcji białka w infiltrowanych roślinach N. benthamiana. Rycina 5C pokazuje, że produkcja białka HAC1 oszacowana metodą Western blotting w latach 2010, 2011, 2012 i 2013 wynosiła odpowiednio 670, 685, 566 i 683 mg/kg. Średnia produkcja HAC1 w roślinach N. benthamiana wyniosła 651 ± 49,4 mg/kg.

Tabela analizy masy gatunków Nicotiana; obliczenia masy liści i łodygi wraz ze średnimi i odchyleniami.
Tabela 1. Porównanie produkcji biomasy roślin N. benthamiana oraz N. excelsiana.

Warunki wzrostu roślin, analiza rozcieńczeń pożywek i wyniki ekspresji białek z elektroforezy żelowej.
Rysunek 1. Analiza Western blot przejściowej ekspresji genu w N. benthamiana. (A) Sześcio-tygodniowe rośliny N. benthamiana 1) rosnące w roztworze nawozowym zawierającym 4,8% fosforu oraz 2) rośliny rosnące w roztworze nawozowym zawierającym 0% fosforu. Na każdą ścieżkę naniesiono ekwiwalent 25 µg świeżej masy liści. (B) Porównanie produkcji GFP w roślinach poddanych infiltracji próżniowej kulturami Agrobacterium GV3101 zawierającymi pBID4-GFP, hodowanych na trzech różnych pożywkach: YEB, AB i LB. Kultury GV3101 hodowane przez noc (O/N) w pożywkach YEB lub LB wirowano z niską prędkością i resuspenderowano w pożywce indukcyjnej (MMA) (ścieżki: odpowiednio MMA-1 i MMA-2), lub hodowano przez noc (O/N) w pożywkach YEB, LB lub AB i bezpośrednio rozcieńczano 1:5 lub 1:10 wodą Milli-Q (ścieżki: YEB/5 i YEB/10; AB/5 i AB/10; LB/5 i LB/10). (C) Porównanie ekspresji GFP w 4, 7 i 10 dni po infiltracji (dpi) po infiltracji próżniowej różnymi stężeniami (A600 wynoszącymi 1,0, 0,5, 0,1 i 0,05) szczepu A. tumefaciens GV3101 niosącego pBID4-GFP.

Porównanie szczepów Agrobacterium: wykres słupkowy, elektroforeza, wyniki wzrostu roślin.
Rysunek 2. Porównanie przejściowej produkcji i aktywności lichenazy po infiltracji próżniowej roślin N. benthamiana różnymi szczepami Agrobacteria. Kultury szczepów Agrobacteria (GV3101, A4, At77, C58C1, At6, At10 i LBA4404) zawierające wektor pBID4-LicKM zostały osobno infiltrowane do liści N. benthamiana. Infiltrowane liście zebrano w 7 dpi. (A) Produkcja lichenazy ilościowo określona za pomocą Western blottingu. (B) Analiza zymogramem wykazująca produkcję lichenazy poprzez aktywność enzymatyczną. (C) Wpływ infiltracji Agrobacterium (dziki typ A4, At10, At77 oraz szczep laboratoryjny GV3101) na kondycję roślin N. benthamiana w 7 dpi. Na każdą ścieżkę naniesiono równowartość 25 µg świeżej masy liścia.

Schemat ekspresji białka fluorescencyjnego i wyniki Western blot w analizie gatunków Nicotiana.
Rycina 3. Przejściowa ekspresja GFP w liściach N. benthamiana, N. excelsiana i N. excelsior w 7. dniu po infiltracji próżniowej za pomocą A. tumefaciens zawierającego wektor pBID4-GFP. (A) Wizualna ocena ekspresji GFP w świetle UV. (B) Analiza Western blot akumulacji GFP.

Analiza ekspresji GFP, wyniki Western blot, zmienne mbar/sek, godziny, poziomy acetosyringonu i glukozy.
Rycina 4. (A) Wpływ ciśnienia próżni na przejściową ekspresję GFP oraz kondycję roślin. Rośliny N. benthamiana poddano infiltracji pBID4-GFP pod ciśnieniem próżni 400, 200, 100 lub 50 mbar, przy czasie utrzymania próżni wynoszącym 30 lub 60 sec. (B) Stabilność i zakaźność A. tumefaciens w N. benthamiana infiltrowanych Agrobacterium GV3101 zawierającym pBID4-GFP, hodowanym na pożywce AB i rozcieńczonym do A600 wynoszącej 0.5. Agroinfiltrację przeprowadzono, infiltrując jedną kasetę roślin N. benthamiana co godzinę przy użyciu tej samej rozcieńczonej kultury Agrobacterium (ścieżki 0-8). (C) Wpływ różnych stężeń acetosyringonu i glukozy na przejściową ekspresję GFP. Szczep Agrobacterium GV3101 zawierający pBID4-GFP hodowano przez noc w pożywce YEB, odwirowano i resuspenderowano do A600 wynoszącej 0.5 albo w MMA zawierającym 2% glukozy z acetosyringonem w stężeniach 0, 100, 200 lub 400 µM, albo w MMA zawierającym 200 µM acetosyringonu z glukozą w stężeniach 0, 1, 2 lub 4%. Suspensje Agrobacterium przechowywano przez 3 hr w temperaturze pokojowej przed infiltracją.

Analiza białek: wyniki elektroforezy, poziomy białka GFP (A); wykresy słupkowe (B, C).
Rycina 5. Wpływ wyciszania supresorów na przejściową produkcję białek w liściach N. benthamiana. (A) Analiza Western blot białka GFP po ko-infiltracji pBID4-GFP i p19 w różnych stosunkach. Próbki pobrane w 7 dpi (na każdą ścieżkę naniesiono równowartość 25 µg świeżej masy liścia). (B) Kulturę Agrobacterium niosącą pBID4-HAC1 mieszano oddzielnie w stosunku 4:1 z kulturą niosącą plazmidy supresorów wyciszania p19 lub p23. Powstałe kombinacje kultur Agrobacterium infiltrowano próżniowo do roślin. Infiltrowane tkanki HAC1 pobierano codziennie do 8 dpi w celu kwantyfikacji białka rekombinowanego. (C) Stabilność banku komórek Agrobacterium. Rośliny infiltrowano tą samą partią banku komórek Agrobacterium każdego roku, aby ocenić akumulację białka. Na każdą ścieżkę naniesiono równowartość 50 µg świeżej masy liścia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

W tym badaniu opracowaliśmy prosty protokół agroinfiltracji do rutynowej przejściowej produkcji białka w wybranych gatunkach Nicotiana przy użyciu szczepów Agrobacterium przenoszących wektor startowy. Ponadto zidentyfikowaliśmy optymalne warunki do osiągnięcia najwyższego poziomu produkcji białka rekombinowanego w naszym przejściowym systemie ekspresji roślin.

Infiltracja próżniowa rozcieńczonego szczepu A. tumefaciens GV3101 zawierającego wektor startowy pBID4 do N. benthamiana, N. excelsiana i N. excelsior spowodowała wyższy poziom produkcji białka docelowego w granicach 7 dpi w porównaniu z innymi gatunkami roślin, takimi jak Pisum sativum infiltrowany GV3101 zawierającym wirusa mozaiki lucerny lub wirusa mozaiki ogórkawektory oparte na ekspresji genu reporterowego GFP pod promotorem 35S41 lub Lactuca sativa, Solanum lycopersicum i Arabidopsis thaliana naciekane szczepem C58C1 A. tumefaciens przenoszącym gen reporterowy beta-glukuronidazy57. N. benthamiana i N. excelsiana były łatwe do infiltracji próżniowej przy ciśnieniu 50 mbar przez 30-60 sekund, z wydajnością infiltracji 90-95%. Pozostałe 5-10% powierzchni liści nie zostało zinfiltrowane z powodu unoszenia się liści na powierzchni zawiesiny Agrobacterium podczas stosowania próżni. Ponieważ wektor startowy ma zdolność do przemieszczania się między komórkami18, przejściowa akumulacja białka występuje w całych liściach, a także ogonkach liściowych w temperaturze 7 dpi. Przy 10 dpi szacowana produkcja GFP była nieco niższa, ponieważ wektor ekspresji pBID4 jest w stanie przemieszczać się z komórki do komórki, ale nie przemieszczać się systemowo18; W związku z tym nowo wyrosłe liście nie zawierają wektora i nie przyczyniają się do produkcji celu. Ponadto degradacja rekombinowanego białka w czasie może przyczyniać się do obniżenia poziomu białka przy 10 dpi. Nasze wyniki wykazały, że infiltracja szczepu A. tumefaciens GV3101 pośredniczyła w wysokim poziomie przejściowej produkcji białka w N. benthamiana. Co więcej, białko docelowe może być zmodyfikowane jako N-końcowe, C-końcowe lub wewnętrzne fuzje z porchanazą (LicKM), β-1,3-1,4-glukanazą, która jest termostabilnym enzymem z Clostridium thermocellum i nadaje termostabilność wielu fuzjom białek docelowych18. Naciekanie N. benthamiana szczepami A. tumefaciens typu dzikiego (at6, at10 i at77) zawierającymi interesujący nas gen wywołało łagodne lub ciężkie objawy: zwijanie się liści, wydłużanie ogonków liściowych i zwijanie się. Nie zaobserwowano żadnych objawów patologicznych u N. benthamiana infiltrowanej laboratoryjnym szczepem GV3101 zawierającym pusty wektor pBID4, podczas gdy niektóre geny wprowadzone do pBID4 i przekształcone w szczepy laboratoryjne GV3101, C58C1 lub LBA4404 wywołały łagodne reakcje nekrotyczne i objawy chlorozy/żółknięcia liści w naciekanych obszarach liści. Objawy nekrotyczne wywołane przez dzikie szczepy Agrobacterium lub rozbrojone szczepy w roślinach psiankowatych zostały zgłoszone wcześniej56,57. Odpowiedź martwicza może wynikać z czynników wirulencji układu wydzielania typu III, białek bakteryjnych przenoszonych do komórki roślinnej przez system wydzielania typu IV i/lub wrażliwości na flagelinę58-60. Odkryliśmy, że przejściowa produkcja heterologicznych białek może również wywoływać patogenność i nadwrażliwość w naciekanych liściach roślin. Wielu badaczy stwierdziło, że agroinfiltracja różnych gatunków roślin za pomocą wektorów binarnych roślin wytworzyła do 5-20 razy wyższy poziom przejściowej produkcji białka w porównaniu ze stabilnie przekształconymi roślinami28,57. Nasze dane pokazują, że N. benthamiana infiltrowana przez GV3101 zawierającą pBID4-GFP przejściowo wyrażała wysokie poziomy GFP, co jest podobne do plonu GFP zgłoszonego dla N. benthamiana infiltrowanego przez Agrobacteria przenoszące wektor wirusowy pICH-GFPSYS (do 80% całkowitego rozpuszczalnego białka)44. Agroinfiltracja przy użyciu naszego wektora startowego zaowocowała wysoką produkcją termostabilnego białka LicKM, 50-krotnie wyższą niż obserwowana przy użyciu standardowego binarnego plazmidu18.

Aby przetestować zakaźność A. tumefaciens i stabilność wektora startowego, infiltrowaliśmy jedno mieszkanie N. benthamiana co godzinę przez okres do 8 godzin, używając tej samej rozcieńczonej wodą kultury Milli-Q GV3101 zawierającej plazmid pBID4-GFP. Nasze dane wykazały, że szczep GV3101 jest skutecznie zakaźny przez co najmniej 8 godzin, a pBID4 (wektor startowy) jest bardzo stabilny podczas 8-godzinnej infiltracji.

Wykazano, że zapas glicerolu szczepu GV3101 zawierający wektor startowy pBID4-HAC1 (bank komórek) przechowywany w temperaturze -80 °C jest bardzo stabilny przez trzy lata bez zmian w przejściowej produkcji białka w infiltrowanych roślinach.  

Rośliny N. benthamiana uprawiane w optymalnych warunkach i między 35 a 42 dniem po siewie były optymalne pod względem przejściowej ekspresji genów za pośrednictwem infiltracji próżniowej40. Młodsze rośliny (w wieku 3-4 tygodni) nie mogą być całkowicie infiltrowane z powodu liści unoszących się na powierzchni zawiesiny komórkowej i uszkodzenia tkanek w wyniku mechanicznych skutków zastosowania próżni. U roślin starszych niż 45 dni, w stadium kotwienia N. benthamiana , w stosowanych optymalnych warunkach oświetleniowych, poziom przejściowej ekspresji jest niski.

Wiadomo, że związki fenolowe o niskiej masie cząsteczkowej (acetosyringon) i monosacharydy (glukoza) indukują geny wiru w A. tumefaciens55,61. Ponadto wykazano, że naciekanie N. benthamiana wektorem binarnym pCAMBIA (gfp) w obecności acetosyringonu w stężeniach 50-600 μM nieznacznie zwiększa przejściową ekspresję genów40. Badaliśmy wpływ różnych stężeń acetosyringonu i glukozy w naszym systemie poprzez dodanie tych związków do kultur GV3101 zawierających pBID4-GFP w MMA przez 3 godziny i nie znaleźliśmy różnicy w ekspresji GFP. Co ciekawe, kultury GV3101 zawierające pBID4-GFP i rozcieńczone w wodzie Milli-Q do A600 0,5 i infiltrowane bez indukcji genu vir wyrażały te same ilości GFP, co te infiltrowane indukowanymi kulturami. Geny vir A. tumefaciens mogą być potencjalnie indukowane przez roślinne związki fenolowe (acetosyringon i kwas sinapinowy) oraz roślinne sacharydy proste (glukozę i fruktozę) obecne w tkance liści. Dlatego spekulujemy, że podobne poziomy ekspresji GFP w obecności lub braku egzogennych induktorów genów wirowych mogą wynikać z działania cytoplazmatycznych induktorów genów wirowych obecnych podczas replikacji wektora startowego eksprymującego GFP w komórkach roślinnych.

N. benthamiana typu dzikiego została wykorzystana jako gospodarz modelowy do przejściowej produkcji białek49. Jednak stosunkowo niski plon biomasy N. benthamiana utrudnia jego zastosowanie do produkcji białek rekombinowanych na dużą skalę. Optymalny gospodarz powinien łączyć wysoki poziom przejściowej ekspresji, łatwy wzrost w szklarni i być podatny na infiltrację Agrobacterium 2. Aby wybrać alternatywnego żywiciela, przesączyliśmy dwa różne gatunki dzikich typów Nicotiana (N. benthamiana i N. excelsior) oraz hybrydę N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior) ze szczepem A. tumefaciens GV3101 zawierającym plazmid pBID4-GFP. Spośród tych trzech gatunków poziom ekspresji GFP był nieco wyższy u N. benthamiana. Rośliny N. excelsior wykazywały trudności w agroinfiltracji próżniowej ze względu na skórzaste liście, a N. excelsiana wytwarzała około dwa razy więcej biomasy w tych samych warunkach wzrostu. Przejściowa produkcja GFP przy 7 dpi jest stosunkowo podobna u N. benthamiana i N. excelsiana. Dlatego N. excelsiana może być bardziej odpowiednim gospodarzem do produkcji białek rekombinowanych.

Produkcja białek przejściowych, w której pośredniczy Agrobacterium, jest ograniczona przez PTGS26, który można przezwyciężyć poprzez koekspresję supresorów wyciszających geny pochodzenia roślinnego62. Wcześniej wykazano, że produkcja białka przejściowego jest 50-krotnie zwiększona w obecności białka p19 TBSV, które hamuje PTGS w infiltrowanych tkankach34. W naszym badaniu oceniliśmy wpływ dwóch supresorów wyciszających wirusa (p19 i p23) oddzielnie infiltrowanych z wektorem startowym pBID4-HAC1. Współinfiltracja tych supresorów wyciszających wydawała się mieć niewielki wpływ na przejściową ekspresję HAC1, z tylko niewielkim wzrostem akumulacji białka HAC1 (15-25%) w obecności współinfiltrowanego p23 lub p19. Aby pozytywnie wpłynąć na produkcję białka, może być konieczne specjalne dobranie supresorów wyciszających, aby były skuteczne dla docelowych gatunków roślin i wektora wirusowego63. Helikaza TMV ma supresor o działaniu wyciszającym RNA64,65. Nasze dane potwierdzają tę obserwację, ponieważ jednoczesna infiltracja p23 lub p19 z pBID4-HAC1 nie spowodowała wzrostu GFP lub niewielkiego wzrostu przejściowej produkcji białka HAC1.

Podsumowując, zmodyfikowaliśmy i zoptymalizowaliśmy warunki wzrostu roślin i Agrobacterium oraz poprawiliśmy skuteczność infiltracji próżniowej. Ta technologia pozwoliła nam wyhodować i przeniknąć do setki kilogramów materiału roślinnego w ciągu kilku godzin. Udało nam się zautomatyzować technikę roślinnej ekspresji stanów nieustalonych w celu uzyskania wysokoprzepustowej produkcji szczepionek na skalę przemysłową w obecnych warunkach Dobrej Praktyki Produkcyjnej (cGMP). Więcej informacji na temat automatyzacji i wykorzystania roślinnego systemu produkcji białek przejściowych do produkcji białek rekombinowanych, w tym kandydatów na szczepionki podjednostkowe, w warunkach cGMP, czytelnicy są odsyłani do strony internetowej www.fhcmb.org/.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology, iBio, Inc. oraz Defense Advanced Research Projects Agency (grant # HDTRA1-07-C-0054). Autorzy dziękują za hojne dary od dr Stantona Gelvina z Wydziału Nauk Biologicznych, Purdue University (szczepy Agrobacterium tumefaciens) i Wayne'a Fitzmaurice'a z Large Scale Biology Corp. (nasiona N. excelsiana), a także Jennifer Nicholson z US Nicotiana Collection, North Carolina State University (N. excelsior nasiona). Autorzy dziękują Margaret Shillingford i Christopherowi Hullowi za dostarczenie roślin i doskonałą pomoc techniczną. Autorzy dziękują również doktorom Stephenowi Streatfieldowi i Natashy Kushnir za pomoc redakcyjną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nicotiana benthamianaKolekcja plazmy zarodkowej tytoniu, Dział Nauk o Uprawach, Uniwersytet Stanowy Karoliny PółnocnejPI 555478 Infiltracja TW16
Nicotiana excelsiorKolekcja plazmyzarodkowej tytoniu, Departament Nauk o Uprawach, Uniwersytet Stanowy Karoliny PółnocnejPI 555685 TW47Infiltracja
Nicotiana excelsianaDr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CALSBC EBA 042304.02Infiltracja
Płoza próżniowaAbbas, Ashland, MAWykonana na zamówienieinfiltracja roślin
RockwoolGrodan Inc., Ontario, KanadaAO 50/40Pożywka hydroponiczna do uprawy roślin
Kwas 2-(N-Morfolino) etanosulfonowyAcros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ172595000Bufor
Murashige & Sól Skoog (sól MS)Laboratorium fitotechnologiiM524Pożywki do hodowli tkankowych
AcetosyringoneSigma-Aldrich, St. Louis, MOD134406-5GIndukcja Agrobacterium
Membrana transferowa Immobilon-PMillipore, Billerica, MAIPVH00010Western blotting
I-blockApplied Biosystems, Foster City, CAT2015Western blotting
Surowica przeciw poliklonalnej surowicy anty-GFP królika Washington Biotechnology, Baltimore, MDWestern blotting
Mouse anti– przeciwciało monoklonalne poli-histydynyQiagen GmbH, Hilden34670Western blotting
Przeciwciało anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA111-035-003Western blotting
Przeciwciało anty-mysie sprzężone z peroksydazą chrzanowąJackson ImmunoResearch, West Grove, PA115-035-003Western blotting
SuperSignal® Podłoże chemiluminescencyjne West PicoThermo Scientific Pierce, Rockford, IL34078Porosty zachodnie
1-3: 1-4-beta-D-glukan)Megazyme, Bray, Co. Wicklow, IrlandiaP-LICHNAktywność porchazy
Kongo Czerwony Sigma-Aldrich, St. Louis, MOC6277Barwienie żelem
Aparat cyfrowy Olympus, Center Valley, PAC-8080Obrazowanie chemiluminescencyjne
GeneGnomeSyngene, Frederick, MDObrazowanie chemiluminescencyjne 
Norma GFP Wykonane we własnym zakresieobrazowanie chemiluminescencyjne 
Roztwór nawozu do roślinGriffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE67-23-20Uprawa roślin
Lichenaza StandardOczyszczony we własnym zakresieWestern blotting
MicroPulserElectroporator BioRad, Hercules, CA165-2100Transformacja Agrobacterium 
(

Bibliografia

  1. Ma, J. K., Drake, P. M., Christou, P. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Nature Reviews Genetics. 4, 794-805 (2003).
  2. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., et al. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  3. Mett, V., Farrance, C. E., Green, B. J., Yusibov, V. Plants as biofactories. Biologicals. 36, 354-358 (2008).
  4. Yusibov, V., Rabindran, S. Recent progress in the development of plant derived vaccines. Expert Review of Vaccines. 7, 1173-1183 (2008).
  5. Stoger, E., Sack, M., Fischer, R., Christou, P. Plantibodies: Applications, advantages and bottlenecks. Current Opinion in Biotechnology. 13, 161-166 (2002).
  6. Mahmoud, K. Recombinant Protein Production: Strategic Technology and a Vital Research Tool. Research Journal of Cell and Molecular Biology. 1, 9-22 (2007).
  7. Rai, M. P. H. Expression systems for production of heterologous proteins. Current Science. 80, 1121-1128 (2001).
  8. Yusibov, V., Streatfield, S. J., Kushnir, N. Clinical development of plant-produced recombinant pharmaceuticals: vaccines, antibodies and beyond. Human Vaccines. 7, 313-321 (2011).
  9. McCormick, A. A., Reddy, S., et al. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: Safety and immunogenicity in a phase I clinical study. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10131-10136 (2008).
  10. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Pandemic-flu-vaccine/default.aspx (2013).
  11. Medicago Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.medicago.com/English/Products/Flu-vaccine/default.aspx (2013).
  12. Planet Biotechnology Inc, , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.planetbiotechnology.com/products.html (2013).
  13. Sys Genetics, S. emB. io , Available from: (accessed 17 January, 2013) www.sembiosys.com/Products/Diabetis.aspx (2013).
  14. Protalix, , Available from: (accessed 17 January, 2013) http://www.protalix.com/objects/docs/ELELYSO_Full-Prescribing-Information.pdf (2013).
  15. Protalix, , Available from: (accessed 17 January 2013) http://www.protalix.com/product-development/taliglucerase-alfa.asp (2013).
  16. Plesha, M. A., Huang, T. -K., et al. Optimization of the bioprocessing conditions for scale-up of transient production of a heterologous protein in plants using a chemically inducible viral amplicon expression system). Biotechnology Progress. 25, 722-734 (2009).
  17. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Magnification - A new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23, 2042-2048 (2005).
  18. Musiychuk, K., Stephenson, N., et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants. Influenza and Other Respiratory Viruses. 1, 19-25 (2007).
  19. Massa, S., Franconi, R., et al. Anticancer activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine. Vaccine. 25, 3018-3021 (2007).
  20. Mett, V., Lyons, J., et al. A plant-produced plague vaccine candidate confers protection to monkeys. Vaccine. 25, 3014-3017 (2007).
  21. Mett, V., Musiychuck, K., et al. A plant-produced influenza subunit vaccine protects ferrets against virus challenge. Influenza and Other Respiratory Viruses. 2, 33-40 (2008).
  22. Shoji, Y., Chichester, J. A., et al. Plant expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate. Vaccine. 26, 2930-2934 (2008).
  23. Chichester, J. A., Musiychuk, K., et al. Immunogenicity of a subunit vaccine against Bacillus anthracis. Vaccine. 25, 3111-3114 (2007).
  24. Golovkin, M., Spitsin, S., et al. Smallpox subunit vaccine produced in Planta confers protection in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6864-6869 (2007).
  25. Porta, C., Lomonossoff, G. Use of viral replicons for the expression of genes in plants. Molecular Biotechnology. 5, 209-221 (1996).
  26. Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot: induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126, 930-938 (2001).
  27. Vézina, L. P., Faye, L., et al. Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal. 7, 442-455 (2009).
  28. Vaquero, C., Sack, M., et al. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 11128-11133 (1999).
  29. Galeffi, P., Lombardi, A., et al. Expression of single-chain antibodies in transgenic plants. Vaccine. 23, 1823-1827 (2005).
  30. Rodríguez, M., Ramírez, N. I., et al. Transient expression in tobacco leaves of an aglycosylated recombinant antibody against the epidermal growth factor receptor. Biotechnology and Bioengineering. 89, 188-194 (2004).
  31. Hull, A., Criscuolo, C. J., et al. plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax. Vaccine. 23, 2082-2086 (2005).
  32. Roy, G., Weisburg, S., Rabindran, S., Yusibov, V. A novel two-component Tobacco mosaic virus-based vector system for high-level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. Virology. 405, 93-99 (2010).
  33. Silhavy, D., Molnar, A., et al. A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21-to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO Journal. 21, 3070-3080 (2002).
  34. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant Journal. 33, 949-956 (2003).
  35. Bechtold, N., Pelletier, G. In planta Agrobacterium-mediated transformation of adult Arabidopsis thaliana plants by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 82, 259-266 (1998).
  36. Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Academy of Science Paris, Life Sciences. 316, 1194-1199 (1993).
  37. Tague, B., Mantis, J. In planta Agrobacterium-mediated transformation by vacuum infiltration. Methods in Molecular Biology. 323, 223-215 (2006).
  38. Fischer, R., Vaquero-Martin, C., et al. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30, 113-116 (1999).
  39. Horn, M. E., Woodard, S. L., Howard, J. A. Plant molecular farming: systems and products. Plant Cell Reports. 22, 711-720 (2004).
  40. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 35, 289-298 (2006).
  41. Green, B. J., Fujiki, M., et al. Transient protein expression in three Pisum sativum (green pea) varieties. Biotechnology Journal. 4, 1-8 (2009).
  42. Kapila, J., DeRycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Science. 122, 108-101 (1997).
  43. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant Journal. 22, 543-551 (2000).
  44. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, 718-723 (2005).
  45. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants. Current Opinion in Biotechnology. 18, 134-141 (2007).
  46. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1015-1026 (2008).
  47. Shoji, Y., Bi, H., et al. Plant-derived hemagglutinin protects ferrets against challenge infection with the A/Indonesia/05/05 strain of avian influenza. Vaccine. 27, 1087-1092 (2009).
  48. Llave, C., Kasshau, K. D., Carrington, J. C. Virus-encoded suppressor of posttranscriptional gene silencing targets a maintenance step in the silencing pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13401-13406 (2000).
  49. McCormick, A. A., Kumagai, M. H., et al. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 703-708 (1999).
  50. Simmons, C. W., VanderGheynst, J. S., Upadhyaya, S. K. A model of agrobacterium tumefaciens vacuum infiltration into harvested leaf tissue and subsequent in planta transgene transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 102, 965-970 (2009).
  51. Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugar-mediated induction of Agrobacterium tumefaciens virulence genes: structural specificity and activities of monosaccharides. Journal of Bacteriology. 172, 6442-6446 (1990).
  52. Cangelosi, G. A., Ankenbauer, R. G., Nester, E. W. Sugars induce the Agrobacterium virulence genes through a periplasmic binding protein and a transmembrane signal protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 6708-6712 (1990).
  53. Stachel, S. E., Nester, E. W., Zambryski, P. C. A plant cell factor induces Agrobacterium tumefaciens vir gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 379-383 (1986).
  54. Rogowsky, P. M., Close, T. J., Chimera, J. A., Shaw, J. J., Kado, C. I. Regulation of the vir genes of Agrobacterium tumefaciens plasmid pTiC58. Journal of Bacteriology. 169, 5101-5112 (1987).
  55. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal. 6, 271-282 (1994).
  56. Vander Hoorn, J. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 13, 439-446 (2000).
  57. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assay of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, 259-273 (2005).
  58. Salmond, G. P. C. Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annual Review of Phytopathology. 32, 181-200 (1994).
  59. Felix, G., Duran, J. D., Volko, S., Boller, T. Plants have a sensitive perception system for the most conserved domain of bacterial flagellin. Plant Journal. 18, 265-276 (1999).
  60. Goodner, B., Hinkle, G., et al. Genome sequence of the plant pathogen and biotechnology agent Agrobacterium tumefaciens C58. Science. 294, 2323-2328 (2001).
  61. Lee, Y. -W., Jin, S., Sims, W. -S., Nester, E. W. Genetic evidence for direct sensing of phenolic compounds by the vir A protein of Agrobacterium tumefaciens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 12245-12249 (1995).
  62. Voinnet, O., Pinto, Y. M., Baulcombe, D. C. Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 14147-14152 (1999).
  63. Voinnet, O. RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends in Genetics. 17, 449-459 (2001).
  64. Ding, X. S., Liu, J., et al. The Tobacco mosaic virus 126-kDa protein associated with virus replication and movement suppresses RNA silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 17, 583-592 (2004).
  65. Harries, P. A., Palanichelvam, K., Bhat, S., Nelson, R. S. Tobacco mosaic virus 126-kDa protein increases the susceptibility of Nicotiana tabacum to other viruses and its dosage affects virus-induced gene silencing. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21, 1539-1548 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika infiltracji pr niowejdob r gatunk w Nicotianaoptymalizacja szczep w Agrobacteriumhydroponiczna uprawa ro linsupresor wyciszania RNA wirusowegoanaliza ekspresji GFPdetekcja metod Western blotilo ciowe oznaczanie testem fluorescencyjnymprzemys owa produkcja bia ek

Powiązane artykuły