Artykuł metodologiczny

Serotypowanie torebki Streptococcus pneumoniae za pomocą reakcji Quellung

DOI:

10.3791/51208

⸱

24 lutego 2014

 ,  , 
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Department of Microbiology & Immunology, The University of Melbourne

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reakcja Quellung jest złotym standardem w określaniu Streptococcus pneumoniae. Technika ta wykorzystuje mikroskop i specyficzne surowice odpornościowe na pneumokoki i jest powszechnie stosowana w laboratoriach referencyjnych i badawczych na całym świecie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje ponad 90 różnych serotypów torebkowych Streptococcus pneumoniae (pneumokoków). Serotypowanie torebki może być nie tylko narzędziem do zrozumienia epidemiologii pneumokoków, ale także dostarczyć użytecznych informacji w badaniach nad skutecznością i wpływem szczepionek. Reakcja Quellung jest złotym standardem w serotypowaniu otoczek pneumokoków. Metoda polega na przetestowaniu zawiesiny komórek pneumokokowych z połączonymi i swoistymi surowicami odpornościowymi skierowanymi przeciwko polisacharydowi otoczkowemu. Reakcje antygen-przeciwciało obserwuje się pod mikroskopem. Protokół składa się z trzech głównych etapów: 1) przygotowania zawiesiny komórek bakteryjnych, 2) wymieszania komórek i surowic odpornościowych na szkiełku podstawowym oraz 3) odczytania reakcji Quellung za pomocą mikroskopu. Reakcja Quellung jest dość prosta do przeprowadzenia i może być stosowana wszędzie tam, gdzie dostępny jest odpowiedni mikroskop i surowice odpornościowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) jest odpowiedzialne za śmierć około 800 000 dzieci poniżej piątego roku życia rocznie, przy czym obciążenie chorobami spada głównie w krajach ubogich w zasoby1. Choroby pneumokokowe mają różne nasilenia, od infekcji miejscowych, takich jak ostre zapalenie ucha środkowego, po ciężkie infekcje zagrażające życiu, takie jak sepsa, zapalenie opon mózgowych i zapalenie płuc2. Opisano ponad 90 serotypów otoczkowych pneumokoków 3,4. Obecne szczepionki przeciwko pneumokokom zapewniają ochronę przed serotypami, które są odpowiedzialne za większość chorób inwazyjnych 5,6. Jednak powszechne stosowanie szczepionek wiąże się z zastąpieniem serotypów zawartych w szczepionce serotypami nieszczepionkowymi, zarówno w przypadku nosicielstwa przez nosogardziel, jak i choroby inwazyjnej 7,8. Podkreśla to znaczenie serotypowania dla nadzoru epidemiologicznego i długoterminowych badań wpływu szczepionek9.

Złotym standardem metody typowania pneumokoków jest test reakcji torebkowej, znany jako reakcja Quellunga, po raz pierwszy opisany przez Neufelda w 1902 roku (zobacz austriacki10). Stwierdzono wysoki stopień zgodności między laboratoriami oraz między reakcją Quellung a innymi metodami serotypowania11-13. Istnieje kilka odmian reakcji Quellung 10,14-16. Opisana tutaj metoda nie wymaga użycia przeciwplamicy ani soczewki zanurzeniowej olejowej; zamiast tego kroplę przygotowanej próbki miesza się z surowicą do typowania i bada natychmiast pod 400-krotnym powiększeniem.

Reakcja Quellung jest zwykle przeprowadzana przy użyciu dostępnych na rynku surowic antysurowicowych. Opisana tutaj metoda zużywa mniej surowic odpornościowych w porównaniu z niektórymi innymi metodami16,17, co czyni ją bardziej opłacalną. Gdy izolat zostanie zidentyfikowany jako pneumokoki, jest on sekwencyjnie testowany z pulami surowic odpornościowych, aż do zaobserwowania pozytywnej reakcji. Każda pula surowic zawiera różne mieszaniny surowic odpornościowych podniesionych przeciwko 91 serotypom pneumokokowym18. Po ustaleniu puli, poszczególne surowice odpornościowe typu i grupy, które są włączone do puli reaktywnej, są testowane indywidualnie w sekwencji. Surowice odporności typu na ogół reagują z pojedynczym serotypem (np. surowica odpornościowa typu 1 reaguje z serotypem 1), podczas gdy surowice odpornościowe grupy reagują ze wszystkimi serotypami w danej grupie (np. surowice odporności grupy 22 reagują z serotypami 22F i 22A). Niektóre serotypy w obrębie grup są dodatkowo różnicowane za pomocą surowic odpornościowych (np. Serotyp 22F reaguje z czynnikiem 22b, ale nie z 22c). W takim przypadku badanie jest kontynuowane ze wszystkimi istotnymi surowicami odpornościowymi do momentu określenia serotypu19,20. Reakcja Quellung jest prosta i szybka14 i może być przeprowadzona w każdym laboratorium, które jest wyposażone w dobrej jakości mikroskop i odpowiedni zestaw surowic odpornościowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie zawiesiny komórek do pisania

  1. Używając sterylnej jednorazowej pętli o pojemności 1 μl, przetrzyj niewielką ilość świeżej, czystej kultury pneumokoków wyhodowanych na stałym, nieselektywnym agarze z krwią końską i zaszczepij 100 μl bulionu z naparu sercowego (HI). Zawieszenie powinno wydawać się po prostu widocznie mętne. Delikatnie wymieszać probówkę do emulgowania.
    Uwaga: Inne media, takie jak bulion Brain Heart Infusion, mogą być również odpowiednie. W celu nasilenia reakcji można zastosować dodanie surowicy (np. końcowe stężenie 10% (v/v) surowicy końskiej) i inkubację w temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę przed użyciem.

2. Sprawdzanie gęstości zawiesiny komórek

Zawiesina komórek przygotowana w kroku 1.1 będzie również używana jako kontrola ujemna i powinna być sprawdzona pod kątem gęstości komórek przed dodaniem surowicy typowania.

  1. Za pomocą pętli o objętości 1 μl przenieś kroplę inokulum przygotowanego w kroku 1.1 na szklane szkiełko mikroskopowe.
  2. Za pomocą kleszczy umieść małe okrągłe szkiełko nakrywkowe na zawiesinie.
  3. Korzystając z ustawienia kontrastu fazowego, obserwuj preparat pod mikroskopem pod 400-krotnym powiększeniem, aby sprawdzić gęstość zawiesiny (rysunek 1A).
    1. Jeśli inokulum jest zbyt ciężkie (ryc. 2A), dodaj więcej bulionu do zawiesiny komórkowej wykonanej w kroku 1.1, aby ją rozcieńczyć. Delikatnie wymieszaj ponownie.
    2. Jeśli inokulum jest zbyt lekkie, na przykład, w polu mikroskopowym widocznych jest <50 komórek (ryc. 2B), dodaj więcej bakterii do preparatu zawiesiny komórkowej wykonanego w kroku 1.1 i delikatnie wymieszaj.
      Uwaga: Z doświadczenia wynika, że gęstość zawiesiny komórek można ocenić poprzez potrząsanie i trzymanie pod światło, gdzie powinno wydawać się po prostu widocznie mętne.
  4. Powtarzaj kroki 2.1-2.3, aż w polu mikroskopowym pojawi się odpowiednia liczba komórek.
    Uwaga: Szkiełka podstawowe i nakrywkowe stwarzają zagrożenie ostrymi narzędziami. Po użyciu szkiełka podstawowe i nakrywkowe są zanieczyszczone materiałem zakaźnym i należy je wyrzucić do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.

3. Pisanie

  1. Przenieść ~1 μl przygotowanego inokulum (np. za pomocą pętli 1 μl) na szklane szkiełko mikroskopowe. Wyrzuć pętlę do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.
  2. Dodać równą objętość (1 μl pętli) surowicy przeciwsurowicy o temperaturze pokojowej na szkiełko i dobrze wymieszać obie krople z pętlą.
  3. Za pomocą kleszczy umieść małe okrągłe szkiełko nakrywkowe na zawiesinie, uważając, aby nie dotknąć kropli. Umieścić szkiełko nakrywkowe na zawiesinie natychmiast po dodaniu surowic odpornościowych, aby zapobiec wysychaniu płynu na szkiełku.
  4. Za pomocą mikroskopu obserwuj zawieszenie w kontraście fazowym z 400-krotnym powiększeniem. Negatywną reakcję Quellung obserwuje się, gdy przy 400-krotnym powiększeniu można zaobserwować niewielki lub żaden "obrzęk" komórek pneumokokowych, podobny do tego, co obserwuje się w zawiesinie komórek pneumokoków bez dodatku surowic odpornościowych (kontrola ujemna). Dodatnią reakcję Quellung obserwuje się, gdy komórki wydają się powiększone lub "spuchnięte" i bardziej widoczne w porównaniu z komórkami w kontroli ujemnej.
    Uwaga: Reakcje niejednoznaczne należy dalej badać, na przykład badając reakcję po 5-10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej lub powtarzając reakcję z większą ilością surowicy.
  5. Przeprowadzać serotypowanie pneumokokowe z kolejnymi testami poszczególnych pul surowic odpornościowych, aż do zaobserwowania pozytywnej reakcji. Alternatywnie, pule mogą być stosowane w "rundach" w zależności od lokalnej częstości występowania serotypów.
    Uwaga: Testowanie w "rundach" gwarantuje, że pule zawierające przeciwciała przeciwko najczęstszym serotypom są testowane w pierwszej kolejności, co minimalizuje wysiłek i koszty. Równoczesne badanie kilku grup zapewnia również dodatkowe kontrole ujemne, które mogą być przydatne w interpretacji. Jeżeli wszystkie pule w danej "rundzie" są ujemne, należy przeprowadzić test izolatu z kolejnymi rundami puli.
  6. Zbadać izolat przy użyciu odpowiedniej surowicy typu lub grupy zawartej w puli reaktywnej. Tam, gdzie jest to właściwe, należy użyć czynnika surowicy odpornościowej w celu dalszego rozróżnienia serotypu.
    Uwaga: Klucze do surowic odpornościowych pneumokokowych dostarczone przez producenta są wykorzystywane przy doborze odpowiedniej puli, typu, grupy lub surowic czynnikowych oraz przy interpretacji wyników (w tym wszelkich reakcji krzyżowych).
  7. Jeśli wyniki ujemne zostaną uzyskane we wszystkich grupach, należy przeprowadzić test izolatu odczynnikiem Omniserum (zawiera przeciwciała przeciwko 91 serotypom21). Jeśli pozytywna reakcja Quellung nadal nie jest obserwowana podczas testowania izolatu pneumokoków z odczynnikiem Omnisurure, może to być spowodowane tym, że izolat wykazuje niewielką ekspresję kapsułki lub nie ma jej wcale, lub że przeciwciała przeciwko serotypowi nie są reprezentowane w surowicy Omnisurum. Ta ostatnia kategoria może obejmować nowe serotypy.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pozytywna reakcja Quellung występuje, gdy przeciwciało specyficzne dla typu wiąże się z kapsułką pneumokoka, prowadząc do zmiany jego współczynnika załamania światła10. Oglądane pod mikroskopem bakterie wydają się "spuchnięte" i bardziej widoczne14. Rycina 1A przedstawia komórki pneumokokowe w bulionie HI. Po dodaniu surowicy przeciw swoistej dla typu wirusa do zawiesiny bakteryjnej pneumokoki wydają się "spuchnięte", refrakcyjne i bardziej zaokrąglone (ryc. 1B).

Zbyt wiele komórek bakteryjnych dodanych do bulionu może spowodować agregację komórek lub fałszywie negatywną reakcję. Rycina 2 przedstawia inokulację komórek pneumokoków w bulionie HI, które są "zbyt ciężkie" (ryc. 2A) lub "zbyt lekkie" (ryc. 2B).

figure-results-1
Rysunek 1. Negatywna i pozytywna reakcja Quellunga. Preparaty izolatu pneumokoków serotypu 9V bez surowicy (1A) i z surowicą odpornościową grupy 9 (1B) oglądano w 400-krotnym powiększeniu. Ten ostatni pokazuje "obrzęk" i zaokrąglenie komórek bakteryjnych, zwykle obserwowane w pozytywnej reakcji Quellung.

figure-results-2
Rysunek 2. Zbyt ciężka i zbyt lekka inokula. Preparaty zawiesin komórek pneumokokowych, które są zbyt ciężkie (2A) lub zbyt lekkie (2B), gdy są oglądane w powiększeniu 400x.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym krokiem w tej technice jest zapewnienie użycia czystej kultury do przygotowania zawiesiny wraz z dodaniem odpowiedniej liczby komórek bakteryjnych do bulionu. Należy zauważyć, że wzrost i morfologia kolonii na płytkach agarowych różni się w zależności od różnych izolatów pneumokoków. Niektóre wytwarzają suche i szorstkie kolonie, które mogą być trudne do zerwania za pomocą pętli i nie emulgują dobrze w bulionie. Z tego powodu podczas przygotowywania zawiesiny komórkowej może być wymagane większe wymiatanie bakterii. W każdym razie konieczne jest, aby pojedyncze komórki, a nie agregaty, były oczywiste w kontroli ujemnej, tak aby ich względną wielkość można było porównać z komórkami z dodatkiem surowic odpornościowych. Dodatkowo zbyt duża liczba komórek bakteryjnych może skutkować fałszywie ujemną reakcją, w której nadmiar antygenu otoczkowego może zahamować reakcję Quellung10. Z tego powodu ważne jest, aby stworzyć zawiesinę bakteryjną o odpowiedniej gęstości komórek (ryc. 1). Zawiesina może być przechowywana przez kilka miesięcy przez dodanie kilku kropli skoncentrowanej formaliny. Umożliwia to łatwiejsze testowanie partii, a także sterylizuje bulion, zmniejszając ryzyko infekcji nabytych w laboratorium; Chociaż należy to rozważyć w stosunku do ryzyka związanego z obchodzeniem się z formaliną, która jest toksyczna,, rakotwórcza, uczulająca i łatwopalna. Ponadto zaobserwowaliśmy, że niektóre izolaty wykazują słabsze reakcje w obecności formaliny (dane nie pokazane).

Reakcje Quellung są badane pod mikroskopem. Zastosowanie kontrastu fazowego zwiększa widoczność kapsułki. W niektórych laboratoriach reakcję obserwuje się za pomocą zanurzenia w oleju przy powiększeniu1000X 14,16. Ponadto niektóre laboratoria używają barwnika przeciwstawnego (błękit metylenowy), aby jeszcze bardziej zwiększyć widoczność pozytywnej reakcji 10,16,22. Przedstawiona tutaj metoda jest oglądana bez zanurzenia w oleju i pod 400-krotnym powiększeniem15,17. Ta metoda jest szybka, prosta i stosunkowo łatwa do odczytania23.

Ważne jest utrzymanie dobrych wewnętrznych procedur kontroli jakości w celu zapewnienia, że surowice odpornościowe i procedury testowe są prawidłowe. Udział w zewnętrznym programie zapewnienia jakości jest często korzystny.

Głównym ograniczeniem reakcji Quellung w przypadku serotypowania pneumokoków jest wysoki koszt wymaganych surowic odpornościowych. Jest to jednak zminimalizowane w powyższym protokole ze względu na niewielką ilość surowicy używanej do każdej reakcji. Opisano kilka innych metod pneumokoków serotypujących23,24. Jednak Quellung pozostaje złotym standardem, a rozwój nowych metod wymaga standaryzacji przeciwko reakcji Quellung23. Używając odpowiednich surowic odpornościowych, reakcja Quellung może być również wykorzystana do identyfikacji i typowania innych bakterii wytwarzających kapsułki25. Reakcja Quellung odgrywa zasadniczą rolę w charakterystyce obecnych i pojawiających się serotypów pneumokoków, a także dostarcza informacji na temat skuteczności szczepionki i długoterminowego wpływu szczepienia na nosicielstwo i chorobę.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Fundację Billa i Melindy Gatesów (projekt PneuCarriage, Grant 52099) oraz Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii. Podziękowania dla Eileen Dunne, Janet Strachan i Kim Hare za krytyczną lekturę rękopisu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pneumokoki (Neufeld) antisura surowicySSI Diagnosticahttp://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Przed użyciem doprowadzić wszystkie surowice odpornościowe do temperatury pokojowej
Surowica przeciw Pneumokokom (Omni)SSI Diagnostica2438Przed użyciem doprowadzić wszystkie surowice odpornościowe do temperatury pokojowej
Mikroskop optycznyLeica MicrosystemsKalibrowane
1 i mikro; lTalerze CopanCD175S01
Agar z krwią końską (HBA)Thermo Fisher ScientificPP2001http://www.thermofisher.com.au/
Przed użyciem doprowadzić do temperatury pokojowej Bulion
do naparu serca (HI)Jednostka przygotowania podłoża (MPU), Uniwersytet w Melbourne40HINPrzed użyciem
doprowadzić do temperatury pokojowejSzkiełka mikroskopowe szklane 76 mm x 26 mmLomb Scientific7101Zagrożenie ostrymi narzędziami: Wyrzucić do pojemnika na ostre narzędzia stanowiące zagrożenie biologiczne
Szkiełka nakrywkowe okrągłeNeuVitroGG-5
*Z wyjątkiem surowic odpornościowych, wszystkie inne materiały można nabyć od alternatywnych dostawców
lub ludzkiej nie są
jednorazowe pętle do zaszczepiania Leica DML *Płytki przygotowane z defibranowanej krwi owczej są odpowiednie, ale płytki z krwią przygotowaną z krwi cytrynianowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).
  3. Henrichsen, J. Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).
  4. Calix, J. J., et al. Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype. J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).
  5. Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I. Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).
  6. Johnson, H. L., et al. Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project. PLoS Med. 8, (2010).
  7. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378, 1962-1973 (2011).
  8. Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination. Lancet. 348, 271-272 (1996).
  9. Mulholland, K., Satzke, C. Serotype replacement after pneumococcal vaccination. Lancet. 379, 1388-1389 (2012).
  10. Austrian, R. The quellung reaction, a neglected microbiologic technique. Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).
  11. Konradsen, H. B. Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe. Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).
  12. Lovgren, M., et al. Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from. J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).
  13. Reasonover, A., et al. The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).
  14. Hare, K. M., et al. #34;Dodgy 6As": differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction. J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).
  15. Kong, F., Gilbert, G. L. Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes. J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).
  16. Castillo, D., et al. Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).
  17. Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae. J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).
  18. SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from: http://www.ssi.dk/ssidiagnostica (2013).
  19. Sorensen, U. B. Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera. J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).
  20. Diagnostica SSI, Key to pneumococcal factor antisera. , (2013).
  21. Diagnostica SSI, Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use. , (2011).
  22. Lund, E. Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections. Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).
  23. Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. Vaccine. 32, 165-179 (2013).
  24. Vernet, G., et al. Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs. Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).
  25. Casewell, M. W. Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species. J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Capsular SerotypingQuellung ReactionStreptococcus pneumoniaePneumococcal CapsuleAntisera TestingMicroscopic ObservationPhase ContrastBacterial SuspensionSlide PreparationSerological Typing

Powiązane artykuły