Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe przeciwciał przeciwjądrowych przy użyciu komórek HEp-2

DOI:

10.3791/51211

⸱

23 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1IFA Development Manager, INOVA Diagnostics, Inc., 2IFA Development, INOVA Diagnostics, Inc., 3Product Manager, Rheumatology, INOVA Diagnostics, Inc., 4Medical Director, INOVA Diagnostics, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy immunofluorescencyjne pośrednie (IIF) były tradycyjnie używane do wykrywania przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) w ludzkiej surowicy. Obecność tych przeciwciał może pomóc w diagnostyce układowych autoimmunologicznych chorób reumatycznych (SARD). Protokół ten pokazuje, jak skutecznie wykonać technikę IIF w celu dokładnego wykrycia tych autoprzeciwciał.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stanowisko American College of Rheumatology w sprawie testów ANA przewiduje użycie IIF jako złotego standardu dla badań przesiewowych ANA1. Chociaż IIF jest doskonałym testem przesiewowym w rękach ekspertów, trudności techniczne związane z przetwarzaniem i odczytywaniem preparatów IIF – takie jak pracochłonne przetwarzanie preparatów, ręczny odczyt, potrzeba doświadczonych, przeszkolonych technologów i korzystanie z ciemni – sprawiają, że metoda IIF jest trudna do dopasowania do przepływu pracy nowoczesnych, zautomatyzowanych laboratoriów.

Pierwszym i kluczowym krokiem w kierunku wysokiej jakości badań przesiewowych ANA jest staranne przetwarzanie preparatów. Ta procedura jest pracochłonna i wymaga pełnego zrozumienia procesu, a także dbałości o szczegóły i doświadczenia.

Czytanie slajdów odbywa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w ciemnych pomieszczeniach i jest wykonywane przez wyszkolonych technologów, którzy są zaznajomieni z różnymi wzorcami, w kontekście cyklu komórkowego i morfologii interfazy i podziału komórek. Biorąc pod uwagę, że IIF jest pierwszym narzędziem przesiewowym w kierunku SARD, zrozumienie kroków niezbędnych do prawidłowego wykonania tej techniki ma kluczowe znaczenie.

Ostatnio opracowano cyfrowe systemy obrazowania do automatycznego odczytywania slajdów IIF. Systemy te, takie jak zautomatyzowany mikroskop fluorescencyjny NOVA View, zostały zaprojektowane w celu usprawnienia rutynowego przepływu pracy IIF. NOVA View pozyskuje i przechowuje cyfrowe obrazy odwiertów w wysokiej rozdzielczości, oddzielając w ten sposób akwizycję obrazu od interpretacji; Obrazy są oglądane i interpretowane na monitorach komputerowych o wysokiej rozdzielczości. Przechowuje obrazy do wykorzystania w przyszłości i wspiera interpretację operatora, dostarczając dane o natężeniu światła fluorescencyjnego na obrazach. Wstępnie kategoryzuje również wyniki jako pozytywne lub ujemne i zapewnia rozpoznawanie wzorców dla próbek dodatnich. Podsumowując, eliminuje potrzebę korzystania z ciemni oraz automatyzuje i usprawnia przepływ pracy odczytu/interpretacji IIF. Co najważniejsze, zwiększa spójność między czytelnikami a czytaniami. Ponadto, dzięki zastosowaniu preparatów z kodami kreskowymi, eliminowane są błędy transkrypcji poprzez zapewnienie identyfikowalności próbki i pozytywnej identyfikacji pacjenta. Skutkuje to zwiększoną integralnością i bezpieczeństwem danych pacjenta.

Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie procedury IIF, w tym przetwarzania preparatów, identyfikacji typowych wzorców IIF oraz wprowadzenia nowych osiągnięć w celu uproszczenia i harmonizacji tej techniki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termin przeciwciało przeciwjądrowe (ANA) opisuje różnorodność autoprzeciwciał, które reagują ze składnikami jąder komórkowych, w tym DNA, białkami i rybonukleoproteinami 1,2. Komórka HEp-2, natywna matryca białkowa z setkami antygenów, stanowi idealny substrat do wykrywania ANA1. Wykrywanie ANA w surowicy ludzkiej jest ważnym narzędziem przesiewowym w kierunku chorób tkanki łącznej, a IIF jest metodą referencyjną dla badania ANA1. Ostatnio IIF na komórkach HEp-2 został zastąpiony w niektórych laboratoriach testami immunologicznymi specyficznymi dla antygenu i metodami multipleksowymi. Ze względu na obawy związane z fałszywie ujemnymi wynikami i brakiem przejrzystości dla klinicystów, American College of Rheumatology utworzył grupę zadaniową, która doszła do wniosku, że IIF przy użyciu komórek HEp-2 powinien być "złotym standardem" dla badań przesiewowych ANA1.

Ze względu na subiektywny charakter badań przesiewowych ANA, jakość komórek HEp-2 jest integralną częścią dokładnego i pewnego raportowania wyników. Szczególnie ważna jest obecność dużej liczby komórek mitotycznych, optymalna morfologia komórek, wystarczająca konfluencja i ekspresja odpowiednich antygenów. Rozpoznawanie wzorców IIF służy jako ważne narzędzie pomagające w diagnozowaniu pacjenta. Zrozumienie znaczenia różnych wzorców umożliwia klinicystom i personelowi laboratoryjnemu przeprowadzenie odpowiednich badań kontrolnych w celu potwierdzenia diagnozy. Na przykład jednorodny wzór ANA może wystąpić w obecności przeciwciał anty-dsDNA lub chromatyny i może być związany z toczniem rumieniowatym układowym (SLE)3. Z drugiej strony, niedawno opisano, że tak zwany gęsty wzór drobno nakrapiany (DFS), który jest powszechnie obserwowany w 12% rutynowych próbek, jest głównie związany z przeciwciałami anty-DFS70. Te autoprzeciwciała, gdy zostaną znalezione w izolacji (bez innych specyficznych dla choroby ANA), nie są związane z układowymi autoimmunologicznymi chorobami reumatycznymi4-9. W ten sposób testy potwierdzające na obecność przeciwciał anty-DFS70 mogą pomóc w ograniczeniu niepotrzebnych testów odruchowych, zaoferować znaczne oszczędności kosztów i złagodzić niepokój pacjenta.

Biorąc pod uwagę, że IIF jest metodologią pierwszego rzutu do wykrywania autoprzeciwciał, najważniejsze jest, aby użytkownik zrozumiał, jak wybór odczynników i substratów tkankowych może wpłynąć na wyniki. Ponieważ technika IIF jest z natury subiektywna, ważne jest, aby stosowane odczynniki zapewniały najwyższą jakość wyników.

Celem tego protokołu wideo jest zapoznanie użytkownika z prawidłowymi krokami potrzebnymi do wykonania metody IIF, powszechnymi wzorcami związanymi z ANA, oraz wprowadzenie nowych ulepszeń, które mogą usprawnić przepływ pracy w laboratorium i ustandaryzować wyniki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki i wybór podłoża

  1. Wyjmij odczynniki z opakowania i pozwól, aby każdy przedmiot osiągnął temperaturę pokojową. Przygotować odczynniki i rozcieńczyć surowice pacjenta zgodnie z ulotką kierunkową. Uwaga: Szkiełka NOVA Lite są oznaczone kodami kreskowymi i można je łatwo zintegrować z automatycznymi systemami w połączeniu z laboratoryjnym systemem informacyjnym LIS. Ta procedura ilustruje ręczne przetwarzanie slajdów; Laboratoria o wysokiej przepustowości mogą jednak zdecydować się na zautomatyzowane urządzenia do obróbki szkiełek.

2. Dodawanie kontroli i próbek

  1. Dozować 1 kroplę kontroli dodatniej i 1 kroplę kontroli ujemnej do odpowiednich studzienek szkiełkowych. Odpipetować 20-25 μl rozcieńczonej surowicy pacjenta do pozostałych studzienek. Przetwarzaj jeden slajd na raz.
  2. Umieść szkiełko (szkiełka) w pojemniku do barwienia z wilgotnym ręcznikiem papierowym na dnie. Przykryj pojemnik i inkubuj szkiełko (szkiełka) przez 30 minut. Uwaga: Wilgotne warunki zapobiegną wysychaniu podłoża. Wysuszenie studzienek może spowodować sztuczne przebarwienia. Podczas tego okresu inkubacji przeciwciała przeciwjądrowe w surowicy pacjenta będą wiązać się z antygenami komórek, które są przymocowane do każdej studzienki.
  3. Po okresie inkubacji spłukać surowicę delikatnym strumieniem buforu do płukania. Aby uniknąć uszkodzenia podłoża i zapobiec przenikaniu próbek między studzienkami, należy lekko pochylić szkiełko, aby uniknąć kierowania strumienia bezpośrednio na studzienki. Strząśnij nadmiar buforu do płukania i umieść szkiełko w słoiku Coplin zawierającym bufor do płukania na około 5 minut.

3. Dodawanie koniugatu fluorescencyjnego

  1. Jeden po drugim wyjmij szkiełka z bufora myjącego i delikatnie postukaj, aby usunąć nadmiar bufora do mycia. Nałóż 1 kroplę koniugatu fluorescencyjnego (znakowanego FITC anty-ludzkiego IgG) na każdą studzienkę. Inkubuj szkiełka przez 30 minut w nawilżonym pojemniku i pamiętaj o założeniu pokrywy pojemnika do barwienia. Uwaga: Do badania ANA zaleca się stosowanie koniugatu specyficznego dla IgG Fc. Koniugat jest wrażliwy na światło, a osłona chroni szkiełka przed ekspozycją na światło, a także utrzymuje wilgotne środowisko. Podczas tego okresu inkubacji koniugat zwiąże się z przeciwciałami przeciwjądrowymi pacjenta, które związały się z antygenami komórkowymi. To sprzężone wiązanie powoduje obecność fluorescencji w studzienkach.
  2. Opłucz i umyj szkiełko w sposób opisany powyżej.
  3. Umieść szkiełko nakrywkowe na ręczniku papierowym i nałóż medium mocujące w linii ciągłej na dolną krawędź szkiełka nakrywkowego.
  4. Wyjmij każdy szkiełko z bufora myjącego i delikatnie postukaj w szkiełko, aby usunąć nadmiar buforu do płukania. Przyłóż dolną krawędź szkiełka do krawędzi szkiełka nakrywkowego.
  5. Delikatnie opuścić szkiełko nakrywkowe na szkiełko nakrywkowe w taki sposób, aby medium mocujące na szkiełku nakrywkowym spływało do górnej krawędzi szkiełka bez tworzenia się pęcherzyków powietrza. Uwaga: Szkiełko nakrywkowe, w tym użycie optymalnej ilości medium montażowego, jest techniką, której doskonalenie wymaga praktyki.

4. Identyfikacja pozytywnych i negatywnych wyników

Interpretacja manualna

  1. Obejrzyj szkiełka z mikroskopem fluorescencyjnym, umieszczonym w ciemnym pomieszczeniu. Wykonaj skanowanie całej studzienki za pomocą obiektywu 20X lub 25X, aby ocenić rozmieszczenie komórek i jednorodność fluorescencji
  2. Przełącz się na obiektyw 40X, aby dokonać ostatecznej interpretacji dotyczącej pozytywności i wzorca.
  3. Spójrz na kontrole pozytywne i negatywne. Oceń pozytywność za pomocą skali oceny reaktywności od 1+ do 4+. Uwaga: Kontrola ujemna może nie wydawać się całkowicie ciemna, ale często wykazuje niski poziom niespecyficznej fluorescencji. Kontrola pozytywna wykaże jasnozieloną fluorescencję jabłka w jądrze (ryc. 1).

Tłumaczenie automatyczne

Uwaga: Oprócz ręcznej interpretacji, załaduj i zeskanuj preparaty za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego NOVA View lub innego automatycznego instrumentu do obrazowania cyfrowego; ciemnia nie jest konieczna. Po utworzeniu projektu poprzez wybór odpowiedniego typu szkiełka, urządzenie pozyskuje i przechowuje cyfrowe obrazy komórek w każdej studzience w wysokiej rozdzielczości. Dodatkowo NOVA View mierzy natężenie światła fluorescencyjnego i kategoryzuje wyniki jako pozytywne lub ujemne oraz zapewnia rozpoznawanie wzorców dla próbek dodatnich. Obrazy są oglądane przez operatora na monitorze komputerowym o wysokiej rozdzielczości, co pozwala na ostateczną interpretację, korektę i potwierdzenie wyniku NOVA View. Na podstawie potwierdzonych wyników można generować raporty. Mikroskopia cyfrowa powinna być stosowana w połączeniu z doświadczonym technikiem laboratoryjnym, ponieważ ma na celu pomoc w interpretacji wyników.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas oceny wyników barwienia komórek HEp-2 najczęściej zgłaszanych jest pięć głównych wzorców jądrowych: jednorodny, plamisty, centromerowy, jąderkowy oraz w postaci kropek jądrowych. Wzorce te są wynikiem wiązania autoprzeciwciał ze specyficznymi składnikami jądra. Chociaż badanie ANA jest specyficzne dla struktur jądrowych, mogą być również obserwowane wzorce cytoplazmatyczne związane z autoprzeciwciałami przeciwko strukturom cytoplazmatycznym. W niektórych przypadkach w próbce może występować kilka autoprzeciwciał, a obraz może przedstawiać wzorzec mieszany.

Metodą IIF można wykryć inne, rzadziej obserwowane i często specyficzne dla cyklu komórkowego wzorce; ostatnio w niektórych serum ANA-dodatnich opisano tzw. gęsty, drobnoziarnisty wzorzec o szczególnym znaczeniu klinicznym.

Jednorodny wzór

Aby zidentyfikować wzór homogenny, należy przeskanować dołek i zlokalizować komórki w stanie mitozy lub komórki dzielące się. Skondensowana chromatyna komórek mitotycznych (Rysunek 2, pomarańczowa strzałka) wykazuje silną, jednolitą fluorescencję, która często jest bardziej wyraźna niż w jadrach komórek w stanie spoczynku. W wzorze homogenicznym komórki w stanie spoczynku wykazują jednolitą, rozlaną fluorescencję całego jądra (Rysunek 2, biała strzałka). Ten charakterystyczny wzór jest często wynikiem obecności przeciwciał anty-dsDNA10.

Wzór nakrapiany

W przypadku grubego wzoru plamistego komórki mitotyczne nie wykazują barwienia skondensowanych obszarów chromosomowych (Rycina 3, pomarańczowa strzałka). Komórki w stanie spoczynku wykazują fluorescencję ziarnistą w całym jądrze. Plamistość jądrową można zdefiniować jako grubą lub drobną. Gruby wzór plamistości jest często wynikiem obecności przeciwciał anty-Sm i anty-RNP11.

W obrazie drobnokropkowatym komórki w spoczynku wykazują drobne lub rozproszone nakrapianie w obrębie jąder, zazwyczaj o jednolitym rozkładzie (Rysunek 4, biała strzałka). Obraz drobnokropkowaty często jest wynikiem obecności przeciwciał anty-SSA i anty-SSB12.

Gęsty, drobny wzór kropkowy

Obecnie uznaje się, że gęsty, drobnoziarnisty obraz plamisty (DFS) jest powszechny w rutynowych badaniach, a nawet 12% próbek wykazuje obecność autoprzeciwciał przeciwko DFS70. Jednakże autoprzeciwciała te, gdy występują w izolacji, nie są powiązane z systemowymi reumatycznymi chorobami autoimmunologicznymi4-6. Przeciwciała te są powszechne u zdrowych osób oraz u pacjentów z chorobami niezwiązanymi z SARD6. Badania potwierdzające obecność przeciwciał przeciwko DFS70 mogą pomóc w ograniczeniu niepotrzebnych badań odruchowych, przynieść znaczne oszczędności kosztów oraz zmniejszyć niepokój pacjentów.

Ponieważ wzór DFS jest trudny do zidentyfikowania, a pozytywny wynik testu ANA może budzić niepokój zarówno u pacjentów, jak i lekarzy, wysoce zaleca się wykonanie testu potwierdzającego po zidentyfikowaniu wzoru sugerującego obecność przeciwciał anty-DFS70, aby wyjaśnić znaczenie kliniczne dodatniego wyniku ANA5,6.

W tym wzorcu komórki mitotyczne (Rysunek 5, pomarańczowa strzałka) wykazują pozytywne, nakrapiane barwienie chromatyny w metafazie, natomiast jądra komórek spoczynkowych (Rysunek 5, biała strzałka) wykazują równomiernie rozproszone drobne kropki w całym jądrze.

Wzór centromerowy

Aby zidentyfikować wzór centromerów, należy przeskanować studzienki i zidentyfikować komórki w fazie mitozy lub komórki dzielące się. W komórkach mitotycznych (Rysunek 6, pomarańczowa strzałka) te oddzielne kropki zbliżają się do siebie, tworząc strukturę często opisywaną jako „pasek metafazowy”. W przypadku wzoru centromerów, komórki w stanie spoczynku (Rysunek 6, biała strzałka) wykazują około 40-60 oddzielnych kropek rozmieszczonych w całej jąderku. Wzór centromerów jest wynikiem zastosowania przeciwciał anty-CENP A,B,C13.

Wzór jąderkowy

Niektóre wzorce jąderkowe wiążą się z rozproszonym barwieniem cytoplazmy w komórkach mitotycznych (Rysunek 7, pomarańczowa strzałka) i ujemnym barwieniem regionu chromosomalnego, podczas gdy inne wzorce jąderkowe wykazują dodatnie barwienie regionu chromosomalnego. Wzorzec jąderkowy wiąże się z jednorodnym lub ziarnistym barwieniem jąderek (Rysunek 7, biała strzałka), wraz ze słabym ziarnistym lub jednorodnym barwieniem nukleoplazmy. Wzorce te wiążą się z przeciwciałami anty-polimeraza RNA III, anty-fibrylaryna, anty-Th/To oraz anty-PM/Scl14,15.

Wzór kropek jądrowych

Wzorzec kropkowy jądra wiąże się z ujemnym wynikiem w komórkach mitotycznych w metafazie (Rysunek 8, pomarańczowa strzałka) oraz z niewielką liczbą dyskretnych plamek w jądrach komórek w stanie spoczynku (Rysunek 8, biała strzałka). Ten charakterystyczny wzorzec jest często wynikiem obecności autoprzeciwciał przeciwko sp-100, PML lub p80 colin. Przeciwciała te wiążą się z pierwotnym marskością żółciową oraz autoimmunologicznym zapaleniem wątroby16.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, zielone świecące komórki wskazujące wyniki analizy ekspresji genów.
Rycina 1. Kontrola negatywna (lewa): Komórki wykazują niski poziom nieswoistej fluorescencji, ale brak jest swoistego barwienia jąder. Kontrola pozytywna (prawa): Komórki wykazują jasnozieloną fluorescencję jąder.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej barwionych jąder DNA w hodowli komórkowej, wizualizujący podziały komórek.
Rysunek 2. Wzorzec homogenny. Komórki w fazie mitozy (pomarańczowa strzałka) wykazują jednolitą fluorescencję. Komórki w stanie spoczynku wykazują równomierne, rozproszone barwienie (biała strzałka).

Podział komórek w mikroskopii fluorescencyjnej; jądra barwione, komórki mitotyczne zaznaczone; analiza biologiczna.
Rycina 3. Gruboziarnisty wzór plamisty. Komórki mitotyczne (pomarańczowa strzałka) wykazują brak barwienia. Komórki w stanie spoczynku wykazują wyraźne plamiste barwienie (biała strzałka).

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej z oznakowanymi komórkami; biologia komórki, badanie lokalizacji białek.
Rysunek 4. Drobny prążkowany wzór. Komórki w stanie mitozy (pomarańczowa strzałka) wykazują brak barwienia. Komórki w stanie spoczynku wykazują wyraźne, drobne prążkowane barwienie (biała strzałka).

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej, zaznaczone jądra komórkowe, podkreślające lokalizację białka.
Rycina 5. Gęsty, drobny wzór nakrapiany. Komórki w fazie mitozy (pomarańczowa strzałka) wykazują drobne, ziarniste barwienie lite. Komórki w stanie spoczynku wykazują bardzo drobne, rozproszone barwienie nakrapiane (biała strzałka).

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej jąder komórkowych z markerami DNA; podkreśla lokalizację białek.
Rycina 6. Wzór centromerów. Komórki w fazie mitotycznej (pomarańczowa strzałka) wykazują jednorodne, dyskretne punkty. Komórki w stanie spoczynku (biała strzałka) wykazują od 40 do 60 dyskretnych punktów na jądro komórkowe.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek, z zaznaczonymi strukturami błony komórkowej i jądra.
Rycina 7. Wzór jąderkowy. Komórki w fazie mitozy (pomarańczowa strzałka) widoczne są jako duże skupiska granulacyjnego barwienia. Jądro komórki w stanie spoczynku wykazuje fluorescencję w obrębie jąderek (biała strzałka).

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek wykazujący lokalizację białek; badanie komórkowe; zielona fluorescencja.
Rysunek 8. Nuklearny wzór kropkowy. Komórki w fazie mitozy (pomarańczowa strzałka) wydają się negatywne. Komórki w stanie spoczynku wykazują kilka dyskretnych plamek w jądrze komórkowym (biała strzałka). Ponadto nuklearny wzór kropkowy może współistnieć z barwieniem cytoplazmatycznym związanym z autoprzeciwciałami przeciwko antygenom mitochondrialnym (czerwona strzałka).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania przesiewowe za pomocą komórek HEp-2 są kluczowym pierwszym krokiem w diagnostyce pacjentów z SARD. Metody IIF nie są jednak zharmonizowane. Źródłami zmienności są m.in. przygotowanie preparatów, swoistość sprzężona i sprawność mikroskopu fluorescencyjnego oraz doświadczenie czytelnika. Pomimo tych obaw, IIF pozostaje "złotym standardem" dla testów ANA. Komórki HEp-2 zawierają dużą różnorodność autoantygenów i stanowią idealny substrat do wykrywania tych autoprzeciwciał. W niektórych laboratoriach IIF został zastąpiony metodami badań przesiewowych w fazie stałej, takimi jak test multipleksowy lub ELISA. Wadą takich testów jest to, że nie wyświetlają one pełnego zakresu antygenów, aby były wystarczająco czułe. W konsekwencji pacjenci z wynikiem prawdziwie dodatnim mogą zostać pominięci, co może mieć szkodliwe konsekwencje Oprócz problemów związanych z opóźnieniami w leczeniu i błędną diagnozą, mogą wystąpić dodatkowe koszty opieki zdrowotnej z powodu powtarzania testów potwierdzających lub niepotrzebnych badań diagnostycznych. Biorąc pod uwagę nieodłączne wyzwania związane z IIF, niezwykle ważne jest, aby prawidłowo wykonać tę technikę, aby uniknąć subiektywizmu w wynikach.

Aby zapewnić dokładną interpretację i raportowanie wyników badań przesiewowych ANA, konieczne jest użycie podłoża najwyższej jakości. Przy wyborze substratu HEp-2 bardzo ważne jest, aby komórki były zoptymalizowane pod kątem ekspresji klinicznie istotnych epitopów w ich natywnym stanie białkowym. Transfekowane lub w inny sposób zmodyfikowane linie komórkowe HEp-2 mogą nie pozwalać na prawidłowe wiązanie przeciwciało-antygen. Ponadto, gdy jednocześnie obecnych jest kilka różnych autoprzeciwciał, komórki rekombinowane mogą maskować jeden lub więcej wzorców. W podłożu powinna być również obecna duża liczba komórek mitotycznych. Odpowiednia liczba komórek mitotycznych pozwala na szybką i dokładną identyfikację wzorców.

Oprócz atrybutów substratu, celem tego protokołu wideo jest opisanie techniki IIF poprzez pokazanie krytycznych etapów, takich jak dodanie próbki, mycie szkiełka, dodanie koniugatu, ślizganie się okładki oraz określenie wyników pozytywnych i negatywnych. Wyniki mogą być zagrożone, jeśli nie zostanie użyta odpowiednia technika dla każdego z tych kroków. Prawidłowe mycie jest ważne, aby usunąć wszystkie niezwiązane przeciwciała. Niektórzy pacjenci wykazują bardzo duże ilości autoprzeciwciał i w takich przypadkach ważne jest, aby wypłukać surowicę ze studzienek, aby nie zanieczyszczała innych studzienek.

Chociaż IIF jest tradycyjnie bardzo pracochłonną i subiektywną metodą laboratoryjną, nowe technologie, takie jak procesory preparatów, preparaty z kodami kreskowymi i zautomatyzowana mikroskopia cyfrowa, mogą znacznie uprościć przepływ pracy, zwiększyć spójność i zmniejszyć źródła zmienności interpretacji.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorki Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner i Anna Eslami są pracownicami INOVA Diagnostics.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Cassandrze Bryant za przeprowadzenie eksperymentu IIF i Carol Buchner za jej ekspercki przegląd techniczny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
NOVA Lite HEp-2 IgG (koniugat DAPI)INOVA Diagnostics708102
NOVA View InstrumentINOVA DiagnosticsNV2000
Stacja robocza QUANTA LinkDiagnostyka INOVALINK010
Licencja na stację roboczą QUANTA Link SkanerINOVA DiagnosticsLINK001
INOVA DiagnosticsLINK019
kodów kreskowych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  2. Tan, E. M. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).
  3. Sack, U., et al. Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).
  4. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  5. Mahler, M., et al. Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).
  6. Mahler, M., Fritzler, M. J. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin Dev Immunol. , (2012).
  7. Miyara, M., et al. Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort. Clin Dev Immunol. , (2013).
  8. Mariz, H., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  9. Muro, Y., et al. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  10. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  11. Craft, J., et al. The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen. J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).
  12. Salomonsson, S., et al. A serologic marker for fetal risk of congenital heart block. Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).
  13. Miyawaki, S., et al. Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies. J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).
  14. Raijamkers, R., et al. PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome. Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).
  15. Yang, J. M., et al. Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex. Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).
  16. Granito, A., et al. Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis. Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Po rednia analiza immunofluorescencyjnamikroskopia fluorescencyjnaprzygotowanie preparat wrozpoznawanie wzorc wzautomatyzowane systemy obrazowaniaNova Viewpreparaty z kodami kreskowymiciemnia

Powiązane artykuły