Artykuł metodologiczny

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

16.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51216

⸱

31 stycznia 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Streszczenie

Rośliny zapewniają wiele korzyści dla produkcji biofarmaceutyków, w tym niskie koszty, skalowalność i bezpieczeństwo. Ekspresja przejściowa oferuje dodatkową zaletę w postaci krótkich czasów rozwoju i produkcji, ale poziomy ekspresji mogą się znacznie różnić w zależności od partii, co rodzi obawy regulacyjne w kontekście dobrej praktyki wytwarzania. Zastosowaliśmy podejście oparte na projektowaniu eksperymentów (DoE) w celu określenia wpływu głównych czynników, takich jak elementy regulatorowe w konstrukcie ekspresji, parametry wzrostu i rozwoju roślin oraz warunki inkubacji podczas ekspresji, na zmienność ekspresji między partiami. Przetestowaliśmy rośliny wykazujące ekspresję modelowego przeciwciała monoklonalnego anty-HIV (2G12) i fluorescencyjnego białka markerowego (DsRed). Omawiamy przesłanki wyboru określonych właściwości modelu i identyfikujemy jego potencjalne ograniczenia. Ogólne podejście można łatwo przenieść na inne problemy, ponieważ zasady modelu mają szerokie zastosowanie: wybór parametrów w oparciu o wiedzę, redukcja złożoności poprzez podzielenie początkowego problemu na mniejsze moduły, sterowana programowo konfiguracja optymalnych kombinacji eksperymentów i stopniowe rozszerzanie projektu. W związku z tym metodologia ta jest przydatna nie tylko do charakteryzowania ekspresji białek w roślinach, ale także do badania innych złożonych systemów, które nie mają opisu mechanistycznego. Równania predykcyjne opisujące wzajemne powiązania między parametrami mogą być wykorzystane do ustanowienia modeli mechanistycznych dla innych złożonych systemów.

Wprowadzenie

Produkcja białek biofarmaceutycznych w roślinach jest korzystna, ponieważ rośliny są tanie w uprawie, platformę można skalować poprzez zwiększenie liczby roślin, a patogeny ludzkie nie są w stanie w nich replikować 1,2. Strategie ekspresji przejściowej oparte na przykład na infiltracji liści za pomocą Agrobacterium tumefaciens zapewniają dodatkowe korzyści, ponieważ czas między dostarczeniem DNA a otrzymaniem oczyszczonego produktu skraca się z lat do mniej niż 2 miesięcy 3. Ekspresja przejściowa jest również stosowana w analizach funkcjonalnych, np. w celu testowania zdolności genów do komplementacji mutantów z utratą funkcji lub badania oddziaływań białkowych 4-6. Jednak poziomy ekspresji przejściowej wykazują tendencję do większej zmienności między partiami niż poziomy ekspresji w roślinach transgenicznych 7-9. Zmniejsza to prawdopodobieństwo, że procesy wytwarzania biofarmaceutyków oparte na ekspresji przejściowej zostaną zatwierdzone w ramach dobrej praktyki wytwarzania (GMP), ponieważ powtarzalność jest krytycznym atrybutem jakości i podlega ocenie ryzyka 10. Taka zmienność może również maskować oddziaływania, które badacze zamierzają przeanalizować. W związku z tym podjęliśmy próbę zidentyfikowania głównych czynników wpływających na poziomy ekspresji przejściowej w roślinach oraz zbudowania wysokiej jakości ilościowego modelu predykcyjnego.

Podejście polegające na zmianie jednego czynnika naraz (OFAT) jest często stosowane w celu określenia wpływu (efektu) określonych parametrów (czynników) na wynik (odpowiedź) eksperymentu 11. Jest ono jednak nieoptymalne, ponieważ poszczególne testy (próby) w ramach badania (eksperymentu) będą rozmieszczone liniowo w potencjalnym obszarze obejmowanym przez testowane czynniki (przestrzeń projektowa). Pokrycie przestrzeni projektowej, a co za tym idzie stopień informacji uzyskanych z eksperymentu, jest niskie, co przedstawiono na Ryc. 1A 12. Ponadto zależności między różnymi czynnikami (interakcje czynników) mogą pozostać niewykryte, co prowadzi do powstania niedoskonałych modeli i/lub przewidywania fałszywych optimów, jak pokazano na Ryc. 1B 13.

Opisane powyżej wady można wyeliminować, stosując podejście oparte na planowaniu eksperymentów (DoE), w którym serie doświadczalne są rozłożone bardziej równomiernie w przestrzeni projektowej, co oznacza, że między dwiema seriami zmienia się więcej niż jeden czynnik 14. Istnieją wyspecjalizowane schematy dla mieszanin, przesiewania czynników (planowanie czynnikowe) oraz ilościowego określania wpływu czynników na odpowiedzi (metody powierzchni odpowiedzi, RSM) 15. Co więcej, RSM mogą być realizowane jako plany centralne kompozytowe, ale można je również skutecznie osiągnąć za pomocą specjalistycznego oprogramowania, które stosuje różne kryteria wyboru serii. Na przykład tzw. kryterium D-optymalności wybiera serie w taki sposób, aby zminimalizować błąd współczynników wynikającego modelu, podczas gdy kryterium IV-optymalności wybiera serie, które zapewniają najniższą wariancję prognozy w całej przestrzeni projektowej 15,16. Opisana tutaj metoda RSM pozwala na precyzyjne ilościowe określenie przejściowej ekspresji białek w roślinach, ale można ją łatwo przenieść do dowolnego systemu obejmującego kilka (~5-8) czynników numerycznych (np. temperatura, czas, stężenie) i kilka (~2-4) czynników kategorycznych (np. promotor, kolor), w których opis mechanistyczny jest niedostępny lub zbyt złożony do zamodelowania.

Podejście DoE wywodzi się z nauk rolniczych, ale rozprzestrzeniło się na inne dziedziny, ponieważ można je zastosować w każdej sytuacji, w której pożądane jest zmniejszenie liczby prób niezbędnych do uzyskania wiarygodnych danych i wygenerowania modeli opisowych dla złożonych procesów. Doprowadziło to z kolei do włączenia DoE do dokumentu „Guidance for Industry, Q8(R2) Pharmaceutical Development” opublikowanego przez Międzynarodową Konferencję ds. Harmonizacji Wymogów Technicznych dotyczących Rejestracji Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi (ICH) 17. DoE jest obecnie szeroko stosowane w badaniach naukowych i przemyśle 18. Należy jednak zachować ostrożność podczas planowania i przeprowadzania eksperymentu, ponieważ wybór niewłaściwego stopnia wielomianu dla modelu regresji liniowej wielokrotnej (modelu bazowego) może wymusić przeprowadzenie dodatkowych prób w celu prawidłowego zamodelowania wszystkich efektów czynników. Co więcej, uszkodzone lub brakujące dane prowadzą do powstania błędnych modeli i wadliwych przewidywań, a nawet mogą uniemożliwić jakąkolwiek próbę budowy modelu, co opisano w sekcjach protokołu i dyskusji 18. W sekcji protokołu przedstawimy wstępnie najważniejsze kroki planowania eksperymentu opartego na RSM, a następnie wyjaśnimy projektowanie z wykorzystaniem oprogramowania DoE DesignExpert v8.1. Podobne projekty można jednak stworzyć za pomocą innego oprogramowania, w tym JMP, Modde oraz STATISTICA. Procedurom eksperymentalnym towarzyszą instrukcje dotyczące analizy i oceny danych.

Diagram PCA i powierzchni odpowiedzi, czynniki A, B, C; analiza wielowymiarowa, model statystyczny.
Rycina 1. Porównanie metod OFAT i DoE. A. Sekwencyjna zmiana jednego czynnika na raz (OFAT) w eksperymencie (czarne, czerwone i niebieskie okręgi) zapewnia niskie pokrycie przestrzeni projektowej (obszary kreskowane). W przeciwieństwie do tego, jednoczesna zmiana więcej niż jednego czynnika z wykorzystaniem strategii planowania eksperymentów (DoE) (zielone okręgi) zwiększa pokrycie, a tym samym precyzję wynikających z niej modeli. B. Obciążone pokrycie przestrzeni projektowej oznacza, że eksperymenty OFAT (czarne okręgi) mogą nie zidentyfikować optymalnych obszarów operacyjnych (czerwone) i mogą przewidzieć rozwiązania suboptymalne (duży czarny okrąg), podczas gdy strategie DoE (czarne gwiazdki) z większym prawdopodobieństwem identyfikują preferowane warunki (duża czarna gwiazdka).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Planowanie strategii DoE

  1. Zidentyfikuj odpowiednie czynniki i odpowiedzi do uwzględnienia w projekcie.
    1. Zdefiniuj jedną lub kilka zmiennych odpowiedzi do pomiaru. W tym przypadku wykorzystano poziomy ekspresji 2G12 oraz DsRed (μg/ml), w tym minimalną różnicę wykrywalną uznaną za istotną (10 i 20 μg /ml odpowiednio) oraz przybliżoną wartość szacowanego odchylenia standardowego układu (4 i 8 μg/ml, odpowiednio) na podstawie poprzednich eksperymentów.
    2. Należy skorzystać z dostępnej literatury, danych z poprzednich eksperymentów lub wyspecjalizowanych schematów przesiewowych (np. układ factorialny, patrz wprowadzenie) w celu wybrania istotnych czynników, których wpływ na odpowiedzi zostanie określony ilościowo (Tabela 1) 7,8,19,20.
    3. Przypisz typy czynników (numeryczne lub kategoryczne) i wybierz zakresy, w których czynniki numeryczne będą zmieniane podczas badania DoE (Tabela 1).
    4. Zidentyfikuj czynniki numeryczne, dla których trudne jest wdrożenie zmienności ciągłej.
      1. Należy unikać stosowania zmienności ciągłej w odniesieniu do czynników, których nie można precyzyjnie dostosować do określonego poziomu. np. Temperaturę inkubacji zazwyczaj można kontrolować z dokładnością do ±2 °Czatem zmienność ciągła z wykorzystaniem wartości takich jak 27.2 °C, 25.9 °Ci 29.3 °C należy unikać.
      2. Zamiast tego należy wybrać szereg dyskretnych poziomów dla tych czynników (Tabela 1). Liczba poziomów powinna odpowiadać przewidywanemu modelowi bazowemu (krok 1.2). Ma to znaczenie jedynie w przypadku projektów optymalnych, ponieważ centralne układy kompozytowe zawsze posiadają dyskretne poziomy czynników.
    5. Określ, czy czynnik kategoryczny jest nominalny, t. j. brak określonej kolejności (np. różnych producentów), lub parametr porządkowy, a tym samym dyskretny parametr numeryczny (np. różne liście na roślinie).
    6. Wybierz poziomy dla obu typów czynników kategorycznych.
  2. Wybierz odpowiedni model bazowy.
    1. Na podstawie eksperymentów wstępnych oraz literatury należy przewidzieć relację między każdym czynnikiem a odpowiedzią, a także interakcje między czynnikami a odpowiedzią. Przykładowo: liniową (im więcej, tym lepiej), kwadratową (pojedyncze optimum lub nieliniowy wzrost/spadek) lub sześcienną (optimum asymetryczne).
    2. Należy upewnić się, że liczba poziomów dla dyskretnych czynników numerycznych wynosi n + 1, gdzie n oznacza stopień wielomianu zależności między czynnikiem a odpowiedzią. Na przykład, jeśli oczekuje się, że temperatura będzie miała kwadratowy wpływ na odpowiedź, n = 2, w związku z czym w celu dopasowania do efektu kwadratowego należy zbadać co najmniej trzy poziomy temperatury.
  3. Zdefiniuj ułamek przestrzeni projektowej (FDS), dla którego wariancja predykcji powinna znajdować się poniżej określonego progu (poziomu alfa). FDS powinien być >0,95 (obejmując ponad 95% przestrzeni projektowej), aby uzyskać modele zapewniające wiarygodne przewidywania w całej przestrzeni projektowej 21-23 .
    Uwaga: Próg 0,05 odpowiada 5-procentowemu poziomowi istotności (błąd typu I) i jest wartością typową. Zwiększenie tej wartości zmniejszy liczbę eksperymentów wymaganych dla strategii DoE, ale jednocześnie zwiększy prawdopodobieństwo pominięcia istotnych efektów oraz błędnego oszacowania ich wpływu na odpowiedź.

Tabela czynników eksperymentalnych przedstawiająca zmienne numeryczne i kategoryczne oraz wartości poziomów dla badania.
Tabela 1. Czynniki wpływające na przejściową ekspresję białek w tytoniu, w tym zakresy zmienności podczas DoE. Czynniki pogrubione zostały uwzględnione w projekcie wyłącznie dla eksperymentów opisanych w sekcji „Opisowy model akumulacji DsRed podczas ekspresji przejściowej z użyciem różnych promotorów/5'UTR”, natomiast czynniki zapisane kursywą zostały uwzględnione w projekcie wyłącznie dla „Optymalizacji warunków inkubacji i schematów zbioru dla produkcji przeciwciał monoklonalnych w roślinach z wykorzystaniem ekspresji przejściowej”.

Schemat analizy czynników z przypisaniem atrybutów, wyborem modelu, definicją mocy predykcyjnej i transferem danych.
Rysunek 2. Proces planowania DoE. Na podstawie dostępnych danych wybierane są czynniki mające istotny wpływ na badaną odpowiedź. Następnie przypisywane są atrybuty czynników (np. numeryczne), zakresy i poziomy. Poprzednia wiedza i eksperymenty służą do zdefiniowania odpowiedniego modelu bazowego. Wymagania dotyczące mocy predykcyjnej są definiowane na podstawie zastosowania/celu końcowego modelu. Zebrane dane mogą następnie zostać przeniesione do odpowiedniego oprogramowania DoE.

2. Konfiguracja RSM w programie DesignExpert

  1. Uruchom program DesignExpert i wybierz „New Design”. W oknie „Response Surface” wybierz „Optimal” i wprowadź liczbę czynników numerycznych i kategorycznych wybranych w sekcji 1.1).
  2. W odpowiednich polach wprowadź nazwy czynników, jednostki, typy, podtypy, liczbę poziomów/granice poziomów oraz wartości poziomów dla wszystkich czynników.
  3. Przejdź do następnej strony i w opcjach „Search” wybierz „Best” oraz pożądane kryterium „Optimality”, w tym przypadku „D-optimal”.
  4. W menu „Edit model…” wybierz model zawierający czynniki i interakcje przewidziane w sekcji 1.2). W przypadku niepewności wybierz pełny model obejmujący wszystkie czynniki i interakcje dla określonego stopnia wielomianu, tutaj „Quadratic”. Należy pamiętać, że wybór pełnego modelu (zawierającego wszystkie interakcje) może zwiększyć liczbę eksperymentów wymaganych dla DoE.
  5. Wybierz liczbę „Blocks”. W tym przypadku zastosowano jeden blok, ponieważ wszystkie rośliny pochodziły z tej samej partii, wszystkie bakterie zostały wyhodowane jednocześnie, a wszystkie iniekcje zostały wykonane w tym samym dniu przez tego samego operatora. Użyj więcej niż jednego bloku, jeśli wykorzystano więcej niż jedną partię roślin lub iniekcje wykonuje kilku operatorów.
  6. Zbalansuj projekt
    1. Włącz opcję „Force categoric balance”, aby równomiernie rozłożyć serie eksperymentalne pomiędzy poziomy czynników kategorycznych, np. testowane różne promotory.
      Uwaga: może to obniżyć optymalność projektu do stopnia, który DesignExpert zgłosi jako wartość procentową, w zależności od punktów wybranych przez algorytm optymalności.
    2. Przelicz projekt kilkakrotnie, korzystając z wbudowanego algorytmu ziarna losowego (random seed), aby zminimalizować spadek optymalności.
      Uwaga: straty w optymalności mogą wynosić od ~3-40% przy tych samych danych wejściowych, ale zmianę liczby powtórzeń można wykorzystać do utrzymania balansu kategorycznego.
  7. Oprogramowanie zasugeruje wartość liczby „Model points” na podstawie modelu bazowego, tutaj 70 serii. Dostosuj liczbę serii dla „Replicates” i „To estimate the lack of fit”, aby upewnić się, że każda z nich stanowi >5% liczby „Model points”, tutaj po 10 serii dla każdej z tych opcji.
  8. Przejdź do następnej strony, wybierz liczbę odpowiedzi oraz wprowadź ich nazwy i jednostki. Dodatkowe odpowiedzi można dodać w dowolnym momencie podczas oceny danych bez negatywnego wpływu na projekt.
  9. Kontynuuj, aby uruchomić algorytm obliczający poziomy czynników dla serii DoE. Jeśli wybrany model bazowy nie zgadza się z liczbą poziomów dla określonego czynnika, wyświetlone zostanie powiadomienie, a obliczenia nie zostaną rozpoczęte. W takim przypadku należy albo:
    1. zwiększyć liczbę poziomów dla tego czynnika; albo
    2. odznaczyć w modelu bazowym wyrazy, których nie można obliczyć na podstawie aktualnej liczby poziomów.
    3. Na przykład, jeśli w aktualnym projekcie dla czynnika „Incubation time” t istnieją dwa poziomy (tj. 2 d i 5 d), a wybrany został kwadratowy model bazowy zawierający wyraz t2, należy dodać trzeci poziom dla t (tj. 8 d) lub usunąć czynnik t2 z modelu.
  10. Zapisz arkusz zawierający optymalne kombinacje czynników, który zostanie wyświetlony po zakończeniu obliczeń.
  11. W węźle „Design” wybierz podwęzeł „Evaluation” i przejdź do karty „Graphs”.
    1. W narzędziu „Graphs tool” wybierz „FDS”, a w polu „FDS Graph” wybierz „Pred” jako typ błędu. Następnie wprowadź minimalną wykrywalną różnicę oraz przybliżoną wartość szacowanego odchylenia standardowego systemu zdefiniowanego w sekcji 1.1.1) jako wartości odpowiednio dla „d” i „s” (tutaj 20 i 8 μg/ml dla DsRed). Wprowadź również poziom alfa (akceptowalny % pominięcia istotnego efektu) odpowiedni dla zastosowania, zazwyczaj 0.05 (5%).
    2. Upewnij się, że obliczone FDS odpowiada wartości procentowej określonej w sekcji 1.3) (zazwyczaj >0.95 dla modeli predykcyjnych). Preferowana jest płaska krzywa na wykresie FDS, co wskazuje na jednorodną dokładność predykcji w całej przestrzeni projektu.
      1. Jeśli tak nie jest (jak w tym przypadku, gdzie FDS wynosiło 1%, co pokazano na Ryc. 3A), wróć do węzła „Design” i w pasku zadań wybierz „Design Tools”, następnie „Augment Design…” i wybierz „Augment”.
      2. Wybierz te same kryteria „Search” i „Optimality” co wcześniej. Wybierz również te same ustawienia „Edit model” i „Force categoric balance”. Jeśli rozszerzenie projektu jest wykonywane przed jakimkolwiek eksperymentem (jak zrobiono tutaj), zmień ustawienie „Put runs into block” na „Block1”.
      3. W sekcji „Runs” wprowadź liczbę dodatkowych „Model points”, utrzymując co najmniej 5% „Replicates” i „To estimate lack of fit” w całkowitym projekcie. Tutaj dodano 100 dodatkowych serii i nie uwzględniono „Replicates” ani „To estimate lack of fit”.
      4. Po zakończeniu obliczeń ponownie sprawdź wykres FDS zgodnie z powyższym opisem. Jeśli FDS nadal nie jest satysfakcjonujące, powtórz rozszerzenie projektu w opisany wyżej sposób. Tutaj po rozszerzeniu FDS wynosiło 100%, zatem dalsze rozszerzenie nie było konieczne (Ryc. 3B).

Wykresy A i B błędu standardowego prognozy przedstawiające analizę frakcji przestrzeni projektowej.
Rycina 3. Porównanie wykresów FDS. A. DoE składające się z 90 serii pomiarowych generuje niewystarczającą wartość FDS wynoszącą zaledwie 1% dla błędu standardowego prognozy, przy zastosowaniu kwadratowego modelu bazowego w połączeniu z wartościami dla minimalnej wykrywalnej różnicy (20 μg/ml) i szacowanego odchylenia standardowego systemu (8 μg/ml). B. Rozszerzenie DoE do łącznie 210 serii pomiarowych pozwoliło na osiągnięcie 100% FDS oraz płaskiej krzywej, co wskazuje na jednorodną precyzję modelu w całej przestrzeni projektowej.

3. Klonowanie i analiza kaset ekspresyjnych

  1. Hodować Escherichia coli w 5 ml pożywki LB (10 g/L tryptonu, 5 g/L ekstraktu drożdżowego, 170 mM NaCl, 50 mg/L ampicyliny; dla płytek LB-agar dodać 15 g/L agaru) w temperaturze 37 °C przez 6-8 h lub przez noc na inkubatorze z wytrząsaniem przy 160 rpm. UWAGA: ampicylina jest substancją szkodliwą. Zaszczepić pożywkę LB za pomocą 50 μl kultury płynnej lub przenieść komórki z kolonii wyrosłych na płytkach przy użyciu końcówki do pipety.
  2. W celu oczyszczenia plazmidowego DNA pSo oraz innych pochodnych pPAM (GenBank AY027531) z szczepu E. coli K12 DH5a, postępować zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do oczyszczania DNA 24. UWAGA: zestaw do oczyszczania zawiera szkodliwe odczynniki chemiczne (szczegóły w powyższej instrukcji). Sekwencja plazmidu została opisana na Ryc. 4 oraz przez Buyer et al. 20.
  3. Oznaczyć stężenie DNA w oczyszczonym elucianie, mierząc absorbancję 2 μl próbki przy 260 nm za pomocą urządzenia NanoDrop.
  4. Potwierdzić tożsamość oczyszczonego plazmidowego DNA poprzez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi (RE).
    1. Wybrać endonukleazy restrykcyjne zgodnie z sekwencją plazmidu tak, aby uzyskać unikalne i rozróżnialne wzory fragmentów. Stosować zalecenia producenta dotyczące warunków trawienia, takich jak objętość reakcji, czas, temperatura oraz stężenie stabilizatora – albuminy surowicy bydlęcej. W zależności od czułości urządzenia analitycznego, użyć 50-500 ng plazmidowego DNA na jedno trawienie.
    2. Przygotować żele 0,8-2,0% do rozdziału fragmentów DNA, gotując agarozę w buforze Tris-borat-EDTA (TBE) (90 mM Tris, 90 mM boranu, 2 mM EDTA; pH 8,0). Im większe spodziewane fragmenty, tym mniejszą ilość agarozy należy zastosować w żelu.
    3. Dodać 5 μl pięciokrotnego buforu do próbek (5x SABU, 0,1% (w/v) błękitu bromofenolowego, 0,1% (w/v) cyjanolu ksylenowego, 10% (w/v) glicerolu rozpuszczonego w TBE) do 50 μl próbki DNA poddanej działaniu RE i rozdzielić fragmenty za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym przy 100 V przez ok. 40 min lub do momentu uzyskania wyraźnego rozdziału fragmentów. Na każdym żelu należy umieścić ścieżkę z markerami wielkości DNA do porównania, np. 2-3 μl drabinki 1-kb.
  5. Zastąpić omega 5'UTR w pSo jednym z trzech pozostałych 5'UTR.
    1. Wyciąć sekwencję omega 5'UTR z ok. 4 μg oczyszczonego DNA pSo poprzez trawienie 20 jednostkami RE EcoRI-HF i NcoI-HF w buforze NEBuffer 4 w temperaturze 37 °C przez ok. 60 min. Następnie rozdzielić fragmenty zgodnie z opisem w sekcjach 3.4.2 i 3.4.3.
    2. Wyizolować większy fragment (pS, „szkielet”) z żelu agarozowego przy użyciu zestawu do ekstrakcji z żelu zgodnie z instrukcją producenta 25 i oznaczyć stężenie oczyszczonego DNA zgodnie z opisem w sekcji 3.3). UWAGA: zestaw do ekstrakcji z żelu zawiera szkodliwe odczynniki chemiczne, szczegóły znajdują się w instrukcji.
    3. Wyizolować 5'UTR dla CHS, CHS-LPH i TL z odpowiednich wektorów donora, traktując ok. 10 μg każdego wektora 20 jednostkami RE EcoRI-HF i NcoI-HF w buforze NEBuffer 4 w temperaturze 37 °C przez ok. 60 min. Następnie rozdzielić fragmenty zgodnie z opisem w sekcjach 3.4.2 i 3.4.3 i oczyścić mniejszy fragment zawierający 5'UTR zgodnie z opisem w sekcji 3.5.2.
    4. Ligować wyizolowane oczyszczone 5'UTR w oddzielnych alikwotach z wyizolowanym oczyszczonym liniowym wektorem pS w temperaturze 25 °C przez 5 min zgodnie z zaleceniami producenta 26. Użyć ok. 50 ng DNA wektora i trzykrotnego nadmiaru molowego DNA 5'UTR w całkowitej objętości 20 μl.
  6. Transformować komórki E coli zrekombinowanymi plazmidami 26,27.
    1. Dodać ok. 10 ng (ok. 4-5 μl) mieszaniny ligacyjnej (patrz sekcja 3.5.4) do 50 μl kompetentnych komórek E. coli RbCl i delikatnie wymieszać, a następnie inkubować przez 30-60 min w lodzie. Wykonać szok termiczny przez 1,5 min w temperaturze 42 °C i schłodzić w lodzie przez 5-30 min.
    2. Dodać 950 μl pożywki LB bez antybiotyków i inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C i przy 160 rpm. W celu selekcji transformantów, wysiać 50 i 100 μl kultury na płytkach LB-agar zawierających ampicylinę i inkubować przez ok. 16-20 h w temperaturze 37 °C.
    3. Zaszczepić 5-10 oddzielnych kolonii reprezentujących każdą ligację promotor-5'UTR opisaną w sekcji 3.1 do 5-ml alikwotów pożywki LB zawierającej ampicylinę. Następnie oczyścić plazmidowe DNA i potwierdzić jego tożsamość zgodnie z opisem w sekcjach 3.2 do 3.4.
  7. Zastąpić promotor 35SS promotorem nos w każdym z czterech plazmidów 5'UTR, używając RE AscI i EcoRI w buforze NEBuffer 4 w temperaturze 37 °C przez 1 h, zgodnie z opisem w sekcjach 3.5 i 3.6.
  8. Wprowadzić każdy z ośmiu otrzymanych plazmidów do szczepu A. tumefaciens GV3101:pMP90RK poprzez elektroporację 28.
    1. Dodać ok. 500 ng oczyszczonego plazmidowego DNA do 50 μl kompetentnych komórek A. tumefaciens w lodzie. Delikatnie wymieszać i przenieść do schłodzonej wcześniej kuwety do elektroporacji o szerokości 0,2 cm. Upewnić się, że mieszanina znajduje się na dnie kuwety i nie zawiera pęcherzyków powietrza.
    2. Przesłać impuls o napięciu 2,5 kV przez 5 msec i potwierdzić intensywność oraz czas trwania impulsu.
    3. Unikać podwyższonych stężeń soli w próbce DNA lub nieprawidłowego przygotowania kompetentnych komórek A. tumefaciens, ponieważ mogą one prowadzić do wysokich prądów jonowych powodujących natychmiastowe odparowanie zawiesiny komórkowej, co znacznie zmniejsza wydajność transformacji.
    4. Dodać 950 μl pożywki YEB bez antybiotyków (5 g/L ekstraktu wołowego, 1 g/L ekstraktu drożdżowego, 5 g/L peptonu, 5 g/L sacharozy, 2 mM MgSO4, pH 7,0), delikatnie wymieszać i natychmiast przenieść do sterylnej probówki reakcyjnej 1,5 ml. Inkubować przez 2-4 h w temperaturze 26-28 °C i przy 160 rpm.
    5. Wysiać 1-2 μl na płytki YEB-agar zawierające antybiotyki (50 mg/L karbenicyliny, 25 mg/L kanamycyny, 25 mg/L rifampicyny) w celu selekcji transformantów. UWAGA: rifampicyna jest substancją toksyczną.
    6. Zaszczepić trzy 5-ml alikwoty pożywki YEB zawierającej antybiotyki komórkami z oddzielnych kolonii reprezentujących każdą ligację promotor-5'UTR i inkubować przez 48-72 h w temperaturze 26-28 °C i przy 160 rpm.
  9. Potwierdzić sukces transformacji A. tumefaciens.
    1. Przenieść 2 μl każdego alikwotu z sekcji 3.8.6 do oddzielnych 48 μl alikwotów mastermixu do PCR (2 μl każdego zapasu primera 10 μM (końcowe stężenie każdego primera 400 nM), 1 μl mieszaniny dNTP 10 mM (końcowe stężenie każdego ddeoksynukleozydotrifosforanu 200 μM), 5 μl 10-krotnego buforu Expand High Fidelity z 15 mM MgCl2, 0,75 μl mieszaniny enzymów Expand High Fidelity oraz 39,25 μl sterylnej wody destylowanej).
    2. Namnożyć kasetę ekspresyjną każdego plazmidu za pomocą odpowiednich primerów (FWD: 5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3', wiążący się 1026 nukleotydów powyżej promotora; REV: 5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3', wiążący się w obrębie miejsca poliadenylacji 35S) w odpowiednich warunkach PCR. W tym przypadku zastosowano 94 °C do denaturacji wstępnej, a następnie 30 cykli: denaturacja 94 °C przez 15 s, annealowanie 51 °C przez 30 s i elongacja 72 °C przez 120 s, oraz końcowy etap elongacji w 72 °C przez 8 min.
    3. Oznaczyć wielkość produktów PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym zgodnie z opisem w sekcji 3.4.3.
  10. Przygotować zapasy glicerolowe A. tumefaciens, mieszając 500 μl 50% (v/v) sterylnego glicerolu z 500 μl kultur A. tumefaciens z sekcji 3.8.6, dla których potwierdzono transformację (sekcja 3.9.3). Przechowywać zapasy glicerolowe w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
  11. Obliczyć energie zwijania różnych mRNA za pomocą serwera sieciowego RNAfold 29, uwzględniając sekwencję nukleotydową od miejsca rozpoczęcia transkrypcji do pierwszych 50 bp regionu kodującego.
    1. W sekcji „Fold algorithms and basic options” wybrać opcje „minimum free energy (MFE) and partition function” oraz „avoid isolated base pairs”.
    2. W sekcji „Advanced folding options” wybrać „dangling energies on both sides of a helix in any case”, „RNA parameters (Turner model, 2004)” i zmienić „rescale energy parameters to given temperature (C)” na 25 °C.
    3. W sekcji „Output options” zaznaczyć wszystkie opcje.
    4. Z sekcji „Results for thermodynamic ensemble prediction” pliku wynikowego wyodrębnić wartości „free energy of the thermodynamic ensemble” oraz „frequency of the MFE structure in the ensemble” do porównania.

Schemat edycji genów; wektory z miejscami restrykcyjnymi EcoRI i HindIII; analiza promotora.
Rycina 4. Warianty promotora i 5'UTR. Kasety ekspresyjne zostały wytworzone poprzez etapową wymianę 5'UTR, co zaowocowało czterema kombinacjami z promotorem CaMV 35SS, a następnie zastąpieniem tego promotora sekwencją nos, co dało cztery dodatkowe warianty i łącznie osiem różnych kombinacji promotor/5'UTR.

4. Uprawa roślin

  1. Przygotować 0,1% roztwór nawozu Ferty 2 Mega w wodzie dejonizowanej o pH 5,9.
  2. Przygotować bloki z wełny mineralnej o wymiarach 10 x 10 x 8 cm poprzez intensywne płukanie wodą dejonizowaną w celu usunięcia pozostałości substancji chemicznych, a następnie nasycić je nawozem.
  3. Zasiać rośliny tytoniu, umieszczając 1-2 nasiona tytoniu na każdym bloku wełny mineralnej, a następnie krótko przepłukać nawozem, uważając, aby nie wypłukać nasion.
  4. Kiełkować i hodować rośliny tytoniu przez 42 dni w szklarni w temperaturze dzień/noc 25/22 °C, przy wilgotności względnej 70% i 16-godzinnym fotoperiodzie (180 mmol sec-1 m-2; λ = 400-700 nm). W trakcie tego fotoperiodu nawadniać nawozem przez 15 min każdej godziny w uprawie hydroponicznej.

5. Przejściowa ekspresja białek

  1. Przygotowanie A. tumefaciens do iniekcji do liści.
    1. Zaszczepić 5-50 ml pożywki YEB zawierającej antybiotyki 1% kulturą mrożoną A. tumefaciens i inkubować w temperaturze 27 °C do momentu osiągnięcia OD600nm na poziomie 5,0 (~48-72 hr w zależności od objętości i rodzaju naczynia).
    2. Rozcieńczyć kulturę A. tumefaciens wodą oraz 2-krotną pożywką do infiltracji (4,3 g/L soli Murashige i Skoog (pH 5,6), 5 g/L sacharozy, 1,8 g/L glukozy, 100 mM acetosyringonu), aby uzyskać OD600nm wymaganą do iniekcji. Potwierdzić wartość OD600nm bezpośrednio przed iniekcją. Uwaga: OD600nm równa 1,0 odpowiada ok. 1,43 ± 0,12 x 109 jednostkom tworzących kolonie na ml.
  2. Iniekcja zawiesiny A. tumefaciens do liści.
    1. Wybrać i oznakować liście inne niż liścienie oraz miejsca na nich, które mają zostać poddane działaniu (np. zgodnie ze strategią DoE).
    2. Nie wstrzykiwać różnych roztworów A. tumefaciens w to samo pole międzyżyłkowe. Zamiast tego należy wykorzystać przeciwległe sekcje po obu stronach osi żyłki głównej. Jeśli w tym samym miejscu konieczne jest wstrzyknięcie więcej niż dwóch różnych roztworów, należy użyć dodatkowej rośliny.
    3. Dokładnie wstrząsnąć roztworem A. tumefaciens, aby resuspenderować komórki, które mogły opaść na dno od czasu przygotowania rozcieńczenia, a następnie pobrać go do strzykawki 1-ml.
    4. Delikatnie zadrapać epidermę w miejscu przeznaczonym do iniekcji końcówką pipety lub podobnym narzędziem, aby ułatwić napływ roztworu A. tumefaciens. Należy unikać przerwania blaszki liściowej podczas tej czynności.
    5. Trzymać strzykawkę prostopadle do blaszki liściowej, dociskając korpus do pola międzyżyłkowego, które ma zostać poddane działaniu, a następnie delikatnie docisnąć wylot (bez założonej igły) do spodniej strony liścia. Jednocześnie delikatnie docisnąć górną stronę liścia, aby zapobiec przesunięciu lub przerwaniu blaszki liściowej.
    6. Delikatnie wcisnąć tłok strzykawki. Roztwór A. tumefaciens wniknie w przestrzenie międzykomórkowe wewnątrz blaszki liściowej, co objawi się ciemnozielonym kolorem i wilgocią w miejscach traktowanych. Powtarzać tę procedurę w kilku miejscach, aż całe pole międzyżyłkowe zostanie zinfiltrowane przez A. tumefaciens. Następnie przejść do kolejnego pola międzyżyłkowego.
    7. Upewnić się, że strzykawka pozostaje prostopadle do liścia. Przechylenie strzykawki spowoduje wytryśnięcie zawiesiny bakteryjnej pod wysokim ciśnieniem.
    8. W przypadku użycia różnych roztworów A. tumefaciens (np. w celu przetestowania różnych promotorów), przed zastosowaniem kolejnego roztworu należy usunąć nadmiar roztworu pozostały na spodniej stronie liścia po pierwszej iniekcji za pomocą ręcznika papierowego lub podobnego materiału.
  3. Inkubacja roślin po infiltracji i pobieranie próbek.
    1. Przygotować fitotron dla traktowanych roślin na ok. 24 hr przed iniekcją, aby umożliwić wyrównanie temperatury i wilgotności do poziomów wymaganych przez DoE.
    2. Po iniekcji przenieść rośliny do fitotronu i umieścić je w tacy wystarczająco dużej do podlewania wodą aż do końca okresu inkubacji określonego przez DoE.
    3. Ustanowić 16-godzinny fotoperiod, stosując sześć chłodnych białych świetlówek Osram 36 W na 0,7 m2 (75 mmol sec-1 m-2; λ = 400-700 nm). Zapobiegać zacienianiu roślin przez siebie nawzajem, ograniczając ich liczbę do sześciu na 0,7 m2.
    4. Przed pobraniem próbek upewnić się, że wybrano właściwe pole międzyżyłkowe, porównując etykietę dodaną w sekcji 5.2.1 z planem DoE.
    5. Użyć wycinaka korkowego, aby pobrać 4-5 krążków liściowych z traktowanych pól międzyżyłkowych w pozycjach i czasach wskazanych przez DoE. Podczas pobierania próbek nie usuwać całego liścia z rośliny. Stabilizować liść ręcznikiem papierowym podczas wycinania krążków, aby zapobiec przerwaniu tkanki.
    6. Wyznaczyć masę każdej próbki i umieścić ją w plastikowej probówce reakcyjnej 1,5 ml opisanej nazwą próbki i masą. Próbki przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C przed oznaczaniem ilości białka. Proces ten można przerwać na tym etapie na kilka miesięcy, w zależności od stabilności próbek i temperatury przechowywania.

6. Oznaczanie ilości białka

  1. Wyodrębnij białka z próbek krążków liściowych.
    1. Dodaj 3 ml buforu do ekstrakcji (50 mM fosforanu sodu, 500 mM chlorku sodu; pH 8.0) na każdy mg masy próbki i rozetrzyj krążki liściowe w probówce reakcyjnej za pomocą elektrycznego tłuczka, aż do całkowitego rozdrobnienia fragmentów. Unikaj przegrzania próbki.
    2. Usuń zawiesinę poprzez dwukrotne wirowanie próbki przy 16,000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Po każdym etapie przenieś nadsącz do czystej probówki reakcyjnej o pojemności 1.5 ml, uważając, aby nie naruszyć osadu.
    3. Po wirowaniu proces można przerwać, zamrażając ekstrakty roślinne w temperaturze -20 °C lub -80 °C na kilka miesięcy, w zależności od stabilności próbki i temperatury przechowywania. Potwierdź, że cykl zamrażania i rozmrażania nie wpływa na stężenie białka(ów) docelowego(ych).
  2. Zmierz fluorescencję DsRed.
    1. Przygotuj trzy powtórzenia techniczne każdej próbki w czarnych płytkach 96-dołkowych o zmniejszonej powierzchni (50 μl ekstraktu na dołek). Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza podczas pipetowania.
    2. Aby wygenerować liniową krzywą referencyjną, zastosuj zestaw sześciu rozcieńczeń (0, 25, 75, 125, 175 i 225 μg/ml) standardu DsRed na jedną płytkę 96-dołkową. Przygotuj rozcieńczenia w PBS i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
    3. Zmierz fluorescencję dwukrotnie, sekwencyjnie, w czytniku płytek 96-dołkowych wyposażonym w filtry wzbudzenia 530/25 nm i emisji 590/35 nm.
    4. Dla każdej próbki oblicz średnią fluorescencję z dwóch pomiarów i trzech powtórzeń technicznych, a następnie odejmij wartość zarejestrowaną dla kontroli ślepej zawierającej 0 μg/ml DsRed. Odejmij również tę wartość od pomiarów rozcieńczeń standardu i wykorzystaj te wartości skorygowane o tło do regresji liniowej w celu wyznaczenia krzywej referencyjnej (przechodzącej przez początek układu współrzędnych).
    5. Wykorzystaj nachylenie krzywej referencyjnej do przeliczenia zmierzonej fluorescencji próbek na stężenia DsRed. W razie potrzeby rozcieńcz próbki tak, aby wynik pomiaru mieścił się w przedziale stężeń standardów, i uwzględnij ten czynnik rozcieńczenia w późniejszych obliczeniach.
  3. Wyznacz stężenie 2G12.
    1. Przygotuj urządzenie do powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) do pomiaru stężenia przeciwciał poprzez sprzężenie białka A (Protein A) z aktywowaną powierzchnią jednej celi przepływowej. Drugą celę przepływową wykorzystaj jako referencyjną, dezaktywując jej powierzchnię bez sprzęgania białka A 30,31.
    2. Rozcieńcz ekstrakty roślinne w stosunku 1:20 w buforze roboczym SPR (10 mM HEPES pH 7.4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.05% v/v Tween-20) i zmierz jednostki odpowiedzi (RU) wiązania przeciwciał do białka A w trzech powtórzeniach technicznych każdej próbki na koniec wstrzyknięcia 90 μl (180 s przy 30 μl/min). Odejmij wartość RU zmierzoną w referencyjnej celi przepływowej (bez białka A) od wartości RU zmierzonej w eksperymentalnej celi przepływowej (powierzchnia z białkiem A).
    3. Po każdych 10-15 próbkach zmierz standard 2G12 o stężeniu 585 ng/ml i odejmij wartość zmierzoną w referencyjnych celach przepływowych, zgodnie z opisem powyżej. Użyj średniej wartości RU tych standardów do obliczenia liniowej krzywej referencyjnej przechodzącej przez początek układu współrzędnych.
    4. Oblicz stężenia 2G12 w próbkach na podstawie rozcieńczenia 1:20 i nachylenia krzywej referencyjnej.
    5. Sprawdź, czy nie występuje silne nieswoiste wiązanie do celi referencyjnej, co może zafałszować pomiar. Sprawdź również, czy standardy 2G12 utrzymują w przybliżeniu stałe wartości (odchylenie <5%) w trakcie całej analizy, ponieważ większa zmienność wskazuje na starzenie się powierzchni białka A.

7. Analiza i ocena danych

  1. Ręcznie przeanalizuj odpowiedzi zaobserwowane w eksperymentach dotyczących ekspresji pod kątem (i) wartości ekstremalnych (wysokich lub niskich) wskazujących na błędy pomiarowe; (ii) nietypowych wyników, np. kombinacji czynników generujących nieoczekiwane odpowiedzi wskazujące na zamianę danych; oraz (iii) wartości brakujących.
    Uwaga: działania te mają na celu zapobieganie budowie modelu w oparciu o błędne dane.
  2. Przenieś przeanalizowane dane odpowiedzi (w tym przypadku stężenia białek) do węzła „Design” w programie DesignExpert. Upewnij się, że dane odpowiedzi są prawidłowo przypisane do odpowiadających im ustawień czynników. W oprogramowaniu DesignExpert dostępna jest obszerna sekcja pomocy, która omawia poniższe kwestie.
  3. W węźle „Analysis” wybierz odpowiedź do analizy i początkowo zaznacz opcję „none” w karcie transformacji.
    Uwaga: transformacja jest zalecana w przypadku stosunku min/max odpowiedzi większego niż 10. Najbardziej użyteczną transformację można uzyskać z wykresu Box-Cox w karcie „Diagnostics” w sekcji „Diagnostics” narzędzia „Diagnostics tool” opisanego poniżej (sekcja 7.8). Często odpowiednia jest transformacja Log10.
  4. Przejdź do karty „Fit summary”, która zawiera ogólne informacje o czynnikach istotnych dla badanego układu (np. interakcje dwuczynnikowe, efekty kwadratowe). Oprogramowanie zasugeruje wstępny model na podstawie jego istotności.
  5. W karcie „Model” wstępny model jest wybrany automatycznie na podstawie wyników z „Fit summary”. Użyj trybu automatycznego, aby edytować ten model:
    1. Wybierz „Process order” o jeden rząd wyższy niż sugerowany model, np. jeśli sugerowanym modelem jest „2FI” (interakcja dwóch czynników), wybierz „Quadratic”.
    2. W polu „Selection” wybierz „Backward”, co spowoduje iteracyjne usuwanie nieistotnych składników z modelu po przejściu do karty „ANOVA” na podstawie wartości „Alpha out”, która początkowo powinna wynosić 0.100.
    3. Jeśli oprogramowanie zapyta, zawsze automatycznie koryguj hierarchię modelu, ponieważ jest to niezbędne do wygenerowania wiarygodnych modeli 32,33.
  6. W karcie „ANOVA” zbadaj sugerowany model i uwzględnione czynniki. Jeśli to konieczne, ręcznie usuń wszystkie czynniki z wartościami p powyżej zdefiniowanego progu (tutaj 0.05, co odpowiada 5% poziomowi istotności) lub te, które są mało prawdopodobne z punktu widzenia mechanistycznego, wracając do karty „Model”, zmieniając „Selection” na „Manual” i eliminując odpowiednie czynniki z modelu.
  7. Wróć do karty „ANOVA” i oceń zaktualizowany model pod kątem wartości p dla „Model” (pożądana jest wartość niska, ponieważ wskazuje ona na istotność) i „Lack-of-fit” (pożądana jest wartość wysoka, ponieważ wskazuje ona na brak istotności), a także wartości „R-squared”, „Adjusted R-squared” i „Predicted R-squared” (dla wszystkich trzech wartości pożądane są wartości > 0.80).
    1. Porównaj te wartości dla różnych modeli, włączając lub wykluczając czynniki na kilku poziomach istotności.
      Uwaga: pomocne może być zduplikowanie kolumny odpowiedzi w węźle „Design” i przeprowadzenie każdej analizy oddzielnie lub wyeksportowanie całej tabeli „ANOVA” do innego programu, np. arkusza kalkulacyjnego.
  8. Przejdź do karty „Diagnostics”, aby potwierdzić jakość modelu i wykryć potencjalne wartości odstające w zbiorze danych, które mają silny wpływ na model, badając wszystkie karty w „Diagnostics Tool” (sekcje „Diagnostics” i „Influence”).
    1. W sekcji „Diagnostics” narzędzia „Diagnostics tool” wykonaj następujące czynności:
      1. Upewnij się, że punkty są rozproszone losowo w obrębie limitów na wykresie „Residuals vs. Predicted”. Rozkład w kształcie grotu strzały wskazuje tutaj na konieczność transformacji danych.
      2. Upewnij się, że punkty są rozproszone losowo w obrębie limitów na wykresie „Residuals vs. Predicted”. Rozkład w kształcie grotu strzały wskazuje tutaj na konieczność transformacji danych.
      3. Zbadaj, czy punkty na wykresie „Residuals vs. run” rozpraszają się losowo w obrębie limitów. Wystąpienie wzorca (np. „schodkowego”) wskazuje na trend w danych; można zastosować budowanie bloków, aby przeciwdziałać jego wpływowi na model.
      4. Szukaj prostej linii przekątnej wskazującej na idealny model na wykresie „Predicted vs. Actual”. Im większe rozproszenie danych wokół przekątnej, tym mniej dokładny jest model.
      5. Sprawdź, czy nie ma nakładania się niebieskiej (najlepszej) i zielonej (rzeczywistej) linii pionowej na wykresie Box-Cox wskazującym transformację danych. Jeśli zielona linia nie pokrywa się z niebieską (znajduje się poza przedziałem wyznaczonym przez czerwone linie pionowe), wróć do sekcji 7.3 i ulepsz proces budowy modelu, wybierając transformację danych zasugerowaną przez wykres Box-Cox. Ponownie, duplikacja kolumny odpowiedzi może być przydatna do porównania różnych modeli.
      6. Upewnij się, że punkty na wykresach „Residuals vs. Factor” (istnieje jeden wykres dla każdego czynnika modelu) rozpraszają się losowo w obrębie limitów. Zakrzywienie w rozkładzie danych może wskazywać na brak czynnika w modelu.
    2. W sekcji „Influence” narzędzia „Diagnostics tool” upewnij się, że dane są rozproszone losowo w obrębie limitów na wykresach „Externally studentized residuals”, „Leverage”, „DFFITS” i „DFBETAS” oraz że rozkład jest równomiernie niski, bez wartości ekstremalnych, na wykresie „Cook's Distance”.
  9. W karcie „Model graphs” zwizualizuj oceniony model. Dla ograniczonej liczby czynników numerycznych (np. 3) przedstawienie powierzchni odpowiedzi („3D surface”) jest przydatne do ręcznej oceny optimów/charakterystyk.
    Uwaga: powierzchnie odpowiedzi ilustrują jedynie wpływ dwóch czynników na badaną odpowiedź. Efekt każdego dodatkowego czynnika na odpowiedź ujawnia się poprzez zmianę jego wartości (czynniki numeryczne) lub poziomu (czynniki kategoryczne) w oknie „Factors tool”. Alternatywnie, czynniki można przypisać do osi wykresu, klikając je prawym przyciskiem myszy w oknie „Factors tool” i wybierając żądaną oś zmiennej niezależnej.
    1. Manipuluj poziomami czynników i przypisz je do współrzędnych wykresu za pomocą „Factors tool”.
    2. Eksportuj wykresy za pomocą polecenia „Export graph to file…” w karcie „File”.
  10. Użyj podwęzła „Numerical” w węźle „Optimization”, aby numerycznie zoptymalizować odpowiedź (minimalizować, maksymalizować, w zakresie) w zależności od czynników modelu, do których z kolei można zastosować określone ograniczenia (np. limity i wagi) za pomocą karty „Criteria”.
    1. Oblicz i zbadaj rozwiązania numeryczne w karcie „Solutions” na podstawie danych wprowadzonych w karcie „Criteria”.
    2. Wyeksportuj te rozwiązania do innego oprogramowania (np. arkuszy kalkulacyjnych) w celu dalszej analizy (np. histogramów), co pozwoli ujawnić ustawienia czynników powiązane z wysokimi lub niskimi wartościami odpowiedzi.
      Uwaga: jest to pomocne, gdy bada się więcej niż trzy czynniki numeryczne i reprezentacja 3D jest trudna.
  11. Użyj podwęzła „Point prediction”, aby przewidzieć odpowiedź dla konkretnych ustawień czynników.
    1. Użyj tej predykcji dla wszystkich ustawień do oceny (tutaj: wszystkie kombinacje promotora i 5'UTR, a także wszystkie liście i czasy inkubacji lub pozycje liści i temperatury inkubacji).
    2. Wyeksportuj przewidywane wartości i zestaw je w tablicę danych, którą można wykorzystać do opisu ekspresji przejściowej w roślinach tytoniu, np. obliczając ekspresję dla konkretnej kombinacji promotor-5'UTR w określonym czasie, uśrednioną dla wszystkich pozycji liści lub dla wszystkich liści rośliny.
    3. Znormalizuj dane ekspresji na podstawie masy różnych liści, aby uzyskać specyficzny poziom ekspresji (μg g-1) lub specyficzną szybkość ekspresji (μg g-1 hr-1).
    4. Alternatywnie, wyeksportuj współczynniki „Final equation” z dołu karty „ANOVA” do arkusza kalkulacyjnego i pomnóż je przez tablicę ustawień czynników, aby uzyskać tę samą tablicę danych.
      Uwaga: tablica ta może zawierać jedynie wartości czynników z początkowej przestrzeni projektowej, ponieważ dopasowane równanie modelu nie nadaje się do ekstrapolacji.
  12. Przeprowadź eksperyment potwierdzający dla punktów modelu, które są szczególnie istotne.
    1. Wykonaj przejściową ekspresję białka w warunkach wybranych dla „Point prediction” (sekcja 7.11). Np. użyj tych samych temperatur i liści itp.
    2. Wyznacz stężenia białek dla tego eksperymentu ekspresji przejściowej zgodnie z opisem powyżej (sekcja 6) i porównaj je z wartościami przewidzianymi przez model.
    3. Sprawdź, czy średnie stężenie białka w eksperymencie potwierdzającym mieści się w przedziale predykcji modelu powierzchni odpowiedzi uzyskanym podczas predykcji punktowej. Zgodność potwierdza moc predykcyjną modelu. Niezgodność wskazuje na niską jakość modelu i może wymagać dodatkowych powtórzeń.
    4. Uwaga: zmienność między partiami roślin poszerza przedział predykcji i może obniżyć wartość eksperymentów potwierdzających wykonanych na innej partii roślin. Jednakże próbki, które nie zostały użyte do wygenerowania modelu, ale pochodzą z tej samej partii roślin co próbki zawarte w modelu, mogą służyć jako skuteczne kontrole.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Model opisowy akumulacji DsRed podczas ekspresji przejściowej z wykorzystaniem różnych promotorów i 5'UTR

Fluorescencja DsRed w ekstraktach z liści została wykorzystana do określenia poziomu ekspresji białka rekombinowanego, a tym samym służyła jako zmienna odpowiedzi w strategii DoE. Minimalna wykrywalna różnica uznana za istotną wynosiła 20 μg/ml, a szacowane odchylenie standardowe układu na podstawie wstępnych eksperymentów wynosiło 8 μg/ml. Czynniki uwzględnione w modelu e...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Każdy eksperyment wymaga starannego planowania, ponieważ zasoby są często rzadkie i drogie. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku strategii DoE, ponieważ błędy w fazie planowania (np . wybór modelu podstawowego, który nie obejmuje wszystkich interakcji między istotnymi czynnikami) mogą znacznie zmniejszyć moc predykcyjną powstałych modeli, a tym samym zdewaluować cały eksperyment. Jednak tych błędów można łatwo uniknąć, postępując zgodnie z podstawowymi procedurami.

Zagadnienia do ro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Opłata za publikację została częściowo ufundowana przez firmy Statease, Inc. (USA) i Statcon (Niemcy), które nie były zaangażowane w przygotowanie manuskryptu ani nie były odpowiedzialne za żadną z jego treści.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni dr Thomasowi Rademacherowi za dostarczenie wektora ekspresji roślin pPAM oraz Ibrahimowi Al Amedi za uprawę roślin tytoniu użytych w tym badaniu. Chcielibyśmy podziękować dr Richardowi M. Twymanowi za pomoc w redagowaniu manuskryptu. Praca ta została częściowo sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach zaawansowanego grantu "Future-Pharma", numer wniosku 269110 oraz Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fundację Fraunhofera Przyszłości).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ekspert ds. projektowania(R) 8Stat-Ease, Inc.Oprogramowanie n.a.DoE
TryptonCarl Roth GmbH8952.2Składnik pożywki
Ekstrakt drożdżowyCarl Roth GmbH2363.2Składnik podłoża
Chlorek soduCarl Roth GmbHP029.2Składnik pożywki
AmpicylinaCarl Roth GmbHK029.2Antybiotyk
Agar-AgarCarl Roth GmbH5210.2Składnik pożywki
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012Mikroorganizm
pPAMGenBankAY027531Wektor klonowania/ekspresji;  
Plazmid NucleoSpin MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250Zestaw do izolacji plazmidowego DNA
NucleoSpin Gel i PCR Clean-upMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250Zestaw do oczyszczania plazmidowego DNA
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spektrofotometr
NcoINew England Biolabs Inc.R3193LOgraniczenieendonukleaza
EcoRINowa Anglia Biolabs Inc.R3101LOgraniczenieendonukleaza
AscINowa Anglia Biolabs Inc.R0558LOgraniczenieendonukleaza
NEB 4New England Biolabs Inc.B7004SRestrykcyjny bufor endonukleazy
TRISCarl Roth GmbH4855.3Składnik pożywki
Tetraboran disodowyCarl Roth GmbH4403.3Składnik medialny
EDTACarl Roth GmbH8040.2Składnik podłoża
AgarozaCarl Roth GmbH6352.4Składnik podłoża
Błękit bromofenolowyCarl Roth GmbHA512.1Wskaźnik koloru
CzylenuCarl Roth GmbHA513.1Wskaźnik koloru
GlycerolCarl Roth GmbH7530.2Komponent medialny
Mini-Sub Cell GT CellBioRad170-4406Komora do elektroforezy żelowej
Agrobacterium tumefaciens szczep GV3101:pMP90RKDSMZ12365Mikroorganizm
Elektroporator 2510Eppendorf4307000.658Elektroporator
Ekstrakt z wołowinyCarl Roth GmbHX975.2Składnik medialny
PeptonCarl Roth GmbH2365.2Składnik medialny
SacharozaCarl Roth GmbH4621.2Składnik medialny
Siarczan magnezuCarl Roth GmbH0261.3Składnik medialny
CarbenicillinCarl Roth GmbH6344.2Antybiotyk
KanamycynaCarl Roth GmbHT832.3Antybiotyk
RyfampicynaCarl Roth GmbH4163.2
Antybiotyk FWD podkładEurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV starterEurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720 TermocyklerApplied Biosystems4359659Thermocycler
RNAfold webserverUniwersytet Wiedeńskin.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Nawóz
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cmGrodann.a.Rockwoolblock
Szklarnian.a.n.a.Douprawy roślin
PhytotronIlka Zelln.a.Douprawy roślin
Omnifix-F SoloB. Braun6064204Strzykawka
Sole Murashige i SkoogDuchefaM 0222.0010Składnik podłoża
GlukozaCarl Roth GmbH6780.2Składnik podłoża
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GAnalogon
fitohormonu  BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008Fotometr
Osram zimna biel 36 WOsram4930440Źródło światła
Fosforan disodowyCarl Roth GmbH4984.3Komponent medialny
Wirówka 5415DEppendorf5424 000.410
Wirówka Forma -86C Zamrażarka ULTThermoFisher88400Zamrażarka
Synergy HTBioTekSIAFRTCzytnik płytek fluorescencyjnych
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPR
urządzenie Białko ALife Technologies10-1006Białko wiążące przeciwciało
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Składnik podłoża
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Składnik podłoża
Przeciwciało 2G12PolymunAB002Przeciwciało referencyjne

Bibliografia

  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al. A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens. Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).
  4. Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).
  5. Berg, R. H., Beachy, R. N. Fluorescent protein applications in plants. Method Cell Biol. 85, 153 (2008).
  6. Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria. Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).
  7. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
  8. Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).
  9. Buyel, J. F., Fischer, R. Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building. Bioengineered. 4, (2013).
  10. Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins. Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).
  11. Daniel, C. One-at-a-time plans. Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).
  12. Czitrom, V. One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician. 53, 6 (1999).
  13. Anderson, M. J., Kraber, S. L. Keys to successful designed experiments. ASQ - The global voice of quality. 6, 6 (1999).
  14. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Inc. (2007).
  15. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
  16. Piepel, G. F. Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions. J Qual Technol. 20, 15 (1988).
  17. FDA. , U.S. Department of Health and Human Services. Rockville, MD, USA. (2009).
  18. Shivhare, M., McCreath, G. Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design. BioProcess International. 8, 9 (2010).
  19. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).
  20. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).
  21. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , Productivity Inc. (2000).
  22. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  23. De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression. Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).
  24. Plasmid DNA purification User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).
  25. PCR clean-up Gel extraction User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).
  26. Quick Ligation Protocol. 4, NewEnglandBiolabs. Ipswich. (2009).
  27. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
  28. Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. Electroporation protocols for Agrobacterium. Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).
  29. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).
  30. Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface. J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).
  31. Newcombe, A. R., et al. Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments. Process Biochem. 41, 842-847 (2006).
  32. Peixoto, J. L. Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models. Am Stat. 41, 311-313 (1987).
  33. Peixoto, J. L. A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models. Am Stat. 44, 26-30 (1990).
  34. Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).
  35. Ma, J. K. C., et al. Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants. Science. 268, 716-719 (1995).
  36. Wycoff, K. L. Secretory IgA antibodies from plants. Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).
  37. Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ro liny tytoniuakumulacja bia ekwiek li ciwarunki inkubacjipomiar fluorescencjipowierzchnia odpowiedzioptymalizacja numerycznamodelowanie predykcyjne

Powiązane artykuły