Method Article

Charakterystyka układów złożonych z wykorzystaniem podejścia Design of Experiments: przejściowa ekspresja białek w tytoniu jako studium przypadku

DOI:

10.3791/51216

⸱

January 31st, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy podejście do projektowania eksperymentów, które może być użyte do określenia i modelowania wpływu elementów regulatorowych transgenu, parametrów wzrostu i rozwoju roślin oraz warunków inkubacji na przejściową ekspresję przeciwciał monoklonalnych i białek reporterowych w roślinach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rośliny zapewniają wiele korzyści dla produkcji biofarmaceutyków, w tym niskie koszty, skalowalność i bezpieczeństwo. Ekspresja przejściowa oferuje dodatkową zaletę w postaci krótkich czasów rozwoju i produkcji, ale poziomy ekspresji mogą się znacznie różnić w zależności od partii, co rodzi obawy regulacyjne w kontekście dobrej praktyki wytwarzania. Zastosowaliśmy podejście oparte na projektowaniu eksperymentów (DoE) w celu określenia wpływu głównych czynników, takich jak elementy regulatorowe w konstrukcie ekspresji, parametry wzrostu i rozwoju roślin oraz warunki inkubacji podczas ekspresji, na zmienność ekspresji między partiami. Przetestowaliśmy rośliny wykazujące ekspresję modelowego przeciwciała monoklonalnego anty-HIV (2G12) i fluorescencyjnego białka markerowego (DsRed). Omawiamy przesłanki wyboru określonych właściwości modelu i identyfikujemy jego potencjalne ograniczenia. Ogólne podejście można łatwo przenieść na inne problemy, ponieważ zasady modelu mają szerokie zastosowanie: wybór parametrów w oparciu o wiedzę, redukcja złożoności poprzez podzielenie początkowego problemu na mniejsze moduły, sterowana programowo konfiguracja optymalnych kombinacji eksperymentów i stopniowe rozszerzanie projektu. W związku z tym metodologia ta jest przydatna nie tylko do charakteryzowania ekspresji białek w roślinach, ale także do badania innych złożonych systemów, które nie mają opisu mechanistycznego. Równania predykcyjne opisujące wzajemne powiązania między parametrami mogą być wykorzystane do ustanowienia modeli mechanistycznych dla innych złożonych systemów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja białek biofarmaceutycznych w roślinach jest korzystna, ponieważ rośliny są tanie w uprawie, platforma może być skalowana tylko poprzez uprawę większej liczby roślin, a ludzkie patogeny nie są w stanie replikować 1,2. Przejściowe strategie ekspresji oparte na przykład na infiltracji liści Agrobacterium tumefaciens zapewniają dodatkowe korzyści, ponieważ czas między punktem dostarczenia DNA a dostarczeniem oczyszczonego produktu skraca się z lat do mniej niż 2 miesięcy3. Ekspresja przejściowa jest również wykorzystywana do analizy funkcjonalnej, np. do testowania genów pod kątem ich zdolności do uzupełniania mutantów pow....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Planowanie strategii DoE

  1. Zidentyfikuj istotne czynniki i odpowiedzi, które należy uwzględnić w projekcie.
    1. Zdefiniuj jedną lub kilka odpowiedzi do pomiaru. W tym przypadku zastosowano poziomy ekspresji 2G12 i DsRed (μg/ml), w tym minimalną wykrywalną różnicę uznaną za istotną (odpowiednio 10 i 20 μg/ml) oraz przybliżoną wartość szacowanego odchylenia standardowego układu (odpowiednio 4 i 8 μg/ml) na podstawie wcześniejszych eksperymentów.
    2. Korzystając z dostępnej literatury, danych z poprzednich eksperymentów lub specjalistycznych projektów badań przesiewowych (np. modelu czynnikowego, patrz wprowadzenie), aby wybrać istotn....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisowy model akumulacji DsRed podczas przejściowej ekspresji przy użyciu różnych promotorów i 5'UTR

DsCzerwona fluorescencja w ekstraktach z liści została użyta do wskazania poziomu ekspresji białka rekombinowanego, a tym samym została użyta jako odpowiedź w strategii DoE. Minimalna wykrywalna różnica, którą uznaliśmy za istotną, wynosiła 20 μg/ml, a szacowane odchylenie standardowe systemu wynosiło 8 μg/ml na podstawie wstępnych eksperymentów. Czynniki wchodzące w skład mode.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdy eksperyment wymaga starannego planowania, ponieważ zasoby są często rzadkie i drogie. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku strategii DoE, ponieważ błędy w fazie planowania (np . wybór modelu podstawowego, który nie obejmuje wszystkich interakcji między istotnymi czynnikami) mogą znacznie zmniejszyć moc predykcyjną powstałych modeli, a tym samym zdewaluować cały eksperyment. Jednak tych błędów można łatwo uniknąć, postępując zgodnie z podstawowymi procedurami.

Zagadnienia do ro.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opłata za publikację została częściowo ufundowana przez firmy Statease, Inc. (USA) i Statcon (Niemcy), które nie były zaangażowane w przygotowanie manuskryptu ani nie były odpowiedzialne za żadną z jego treści.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni dr Thomasowi Rademacherowi za dostarczenie wektora ekspresji roślin pPAM oraz Ibrahimowi Al Amedi za uprawę roślin tytoniu użytych w tym badaniu. Chcielibyśmy podziękować dr Richardowi M. Twymanowi za pomoc w redagowaniu manuskryptu. Praca ta została częściowo sfinansowana przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych w ramach zaawansowanego grantu "Future-Pharma", numer wniosku 269110 oraz Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fundację Fraunhofera Przyszłości).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ekspert ds. projektowania(R) 8Stat-Ease, Inc.Oprogramowanie n.a.DoE
TryptonCarl Roth GmbH8952.2Składnik pożywki
Ekstrakt drożdżowyCarl Roth GmbH2363.2Składnik podłoża
Chlorek soduCarl Roth GmbHP029.2Składnik pożywki
AmpicylinaCarl Roth GmbHK029.2Antybiotyk
Agar-AgarCarl Roth GmbH5210.2Składnik pożywki
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012Mikroorganizm
pPAMGenBankAY027531Wektor klonowania/ekspresji;  
Plazmid NucleoSpin MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250Zestaw do izolacji plazmidowego DNA
NucleoSpin Gel i PCR Clean-upMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250Zestaw do oczyszczania plazmidowego DNA
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.Spektrofotometr
NcoINew England Biolabs Inc.R3193LOgraniczenieendonukleaza
EcoRINowa Anglia Biolabs Inc.R3101LOgraniczenieendonukleaza
AscINowa Anglia Biolabs Inc.R0558LOgraniczenieendonukleaza
NEB 4New England Biolabs Inc.B7004SRestrykcyjny bufor endonukleazy
TRISCarl Roth GmbH4855.3Składnik pożywki
Tetraboran disodowyCarl Roth GmbH4403.3Składnik medialny
EDTACarl Roth GmbH8040.2Składnik podłoża
AgarozaCarl Roth GmbH6352.4Składnik podłoża
Błękit bromofenolowyCarl Roth GmbHA512.1Wskaźnik koloru
CzylenuCarl Roth GmbHA513.1Wskaźnik koloru
GlycerolCarl Roth GmbH7530.2Komponent medialny
Mini-Sub Cell GT CellBioRad170-4406Komora do elektroforezy żelowej
Agrobacterium tumefaciens szczep GV3101:pMP90RKDSMZ12365Mikroorganizm
Elektroporator 2510Eppendorf4307000.658Elektroporator
Ekstrakt z wołowinyCarl Roth GmbHX975.2Składnik medialny
PeptonCarl Roth GmbH2365.2Składnik medialny
SacharozaCarl Roth GmbH4621.2Składnik medialny
Siarczan magnezuCarl Roth GmbH0261.3Składnik medialny
CarbenicillinCarl Roth GmbH6344.2Antybiotyk
KanamycynaCarl Roth GmbHT832.3Antybiotyk
RyfampicynaCarl Roth GmbH4163.2
Antybiotyk FWD podkładEurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV starterEurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720 TermocyklerApplied Biosystems4359659Thermocycler
RNAfold webserverUniwersytet Wiedeńskin.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Nawóz
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cmGrodann.a.Rockwoolblock
Szklarnian.a.n.a.Douprawy roślin
PhytotronIlka Zelln.a.Douprawy roślin
Omnifix-F SoloB. Braun6064204Strzykawka
Sole Murashige i SkoogDuchefaM 0222.0010Składnik podłoża
GlukozaCarl Roth GmbH6780.2Składnik podłoża
AcetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GAnalogon
fitohormonu  BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008Fotometr
Osram zimna biel 36 WOsram4930440Źródło światła
Fosforan disodowyCarl Roth GmbH4984.3Komponent medialny
Wirówka 5415DEppendorf5424 000.410
Wirówka Forma -86C Zamrażarka ULTThermoFisher88400Zamrażarka
Synergy HTBioTekSIAFRTCzytnik płytek fluorescencyjnych
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPR
urządzenie Białko ALife Technologies10-1006Białko wiążące przeciwciało
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Składnik podłoża
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Składnik podłoża
Przeciwciało 2G12PolymunAB002Przeciwciało referencyjne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Design Of ExperimentsTransient Protein ExpressionTobacco PlantsProtein AccumulationLeaf AgeIncubation ConditionsFluorescence MeasurementResponse SurfaceNumerical OptimizationPredictive Modeling

Related Articles