Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51218

⸱

27 stycznia 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

W tym artykule

Podsumowanie

Uporczywa aktywacja hamujących receptorów sprzężonych z białkiem G powoduje uwrażliwienie na sygnalizację cyklazy adenylowej. Aby zidentyfikować podstawowe szlaki molekularne, konieczne jest bezstronne podejście; jednak strategia ta wymaga opracowania skalowalnego testu uczulającego na cAMP opartego na komórkach. W niniejszym artykule opisujemy test uczulający do badań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA.

Streszczenie

Uwrażliowanie na sygnalizację cyklazy adenylowej (AC) jest związane z różnymi zaburzeniami neuropsychiatrycznymi i neurologicznymi, w tym nadużywaniem substancji i chorobą Parkinsona. Ostra aktywacja receptorów sprzężonych z Gαi/o hamuje aktywność AC, podczas gdy trwała aktywacja tych receptorów powoduje heterologiczne uczulenie AC i zwiększony poziom wewnątrzkomórkowego cAMP. Wcześniejsze badania wykazały, że to zwiększenie odpowiedzi na prąd przemienny obserwuje się zarówno in vitro, jak i in vivo po przewlekłej aktywacji kilku typów receptorów sprzężonych z Gαi/o, w tym receptorówD2, dopaminy i μ receptorów opioidowych. Chociaż heterologiczne uczulenie na AC zostało po raz pierwszy zgłoszone cztery dekady temu, mechanizm (mechanizmy) leżący u podstaw tego zjawiska pozostaje w dużej mierze nieznany. Brak danych mechanistycznych prawdopodobnie odzwierciedla złożoność związaną z tą reakcją adaptacyjną, co sugeruje, że bezstronne podejścia mogą pomóc w identyfikacji szlaków molekularnych zaangażowanych w heterologiczne uczulenie AC. Wcześniejsze badania sugerowały, że kinaza i sygnalizacja Gbγ są nakładającymi się składnikami, które regulują heterologiczne uczulenie AC. Aby zidentyfikować unikalne i dodatkowe nakładające się cele związane z uczuleniem na prąd przemienny, konieczne jest opracowanie i walidacja skalowalnego testu uczulającego na prąd przemienny w celu uzyskania większej przepustowości. Poprzednie podejścia do badania uczulenia były na ogół kłopotliwe, obejmując ciągłe utrzymywanie hodowli komórkowych, a także złożoną metodologię pomiaru akumulacji cAMP, która obejmuje wiele etapów mycia. W związku z tym opracowanie solidnego testu opartego na komórkach, który może być wykorzystany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) w formacie 384 dołków, ułatwiłoby przyszłe badania. Korzystając z dwóch modeli komórkowych receptora dopaminy D2 (tj. CHO-D2L i HEK-AC6 / D2L), przekształciliśmy nasz 48-dołkowy test uczulający (>20 kroków 4-5 dni) w pięcioetapowy, jednodniowy test w formacie 384-dołkowym. Ten nowy format jest podatny na badania przesiewowe małych cząsteczek i wykazujemy, że ten projekt testu może być również łatwo wykorzystany do odwrotnej transfekcji siRNA w oczekiwaniu na ukierunkowane badania przesiewowe biblioteki siRNA.

Wprowadzenie

Adaptacyjna odpowiedź sygnalizacyjna cyklazy adenylowej (AC) znana jako heterologiczna lub super-uczulenie została po raz pierwszy odkryta w laboratorium laureata Nagrody Nobla, dr Marshalla Nirenberga. Dr Nirenberg zaproponował, że obserwowana zwiększona reakcja AC po przewlekłej aktywacji receptora opioidowego δ była mechanizmem związanym z tolerancją i uzależnieniem od opiatów1. Oprócz przewlekłej aktywacji receptora opioidowego δ, ta neuroadaptacyjna odpowiedź sygnalizacji AC występuje również po trwałej aktywacji kilku innych receptorów sprzężonych z Gαi/o2. Warto zauważyć, że wiele z tych receptorów jest związanych z bólem, zaburzeniami neuropsychiatrycznymi i neurologicznymi i obejmują opioid μ/κ, dopaminę D2/4, 5HT1A i receptory muskarynoweM2/4 2. Oprócz odkryć dr Nirenberga, istnieje wiele dowodów łączących uwrażliwienie na sygnalizację AC z przewlekłą aktywacją receptorów opioidowych zarówno in vitro, jak i in vivo3-7. Uczulenie na AC jest również związane z różnymi chorobami obejmującymi receptory dopaminowe podobne doD2, w tym ze schizofrenią i chorobą Parkinsona (przegląd patrz odniesienie2). Pomimo potencjalnego znaczenia uczulenia, dokładny mechanizm (mechanizmy) związany z trwałą aktywacją receptora sprzężonego z Gαi/o, która prowadzi do zwiększonej odpowiedzi na prąd przemienny, pozostaje w dużej mierze nieznany.

Te badania dostarczają uzasadnienia do zbadania mechanizmów uwrażliwienia cyklazy adenylowej jako ważnego celu neurobiologicznego. Podobnie, należy również uznać fizjologiczne znaczenie sygnalizacji AC8 oraz znaczenie, jakie poszczególne izoformy AC odgrywają w tej odpowiedzi adaptacyjnej2,9,10. W kontekście naszych badań, ogólne cechy związane z heterologicznym uczuleniem rekombinowanych izoform AC są równoległe do cech opisanych dla badania endogennych izoform AC. W szczególności wcześniejsze badania wykazały, że aktywacja białek Gαi / o, a następnie uwalnianie / rearanżacja podjednostek βγ są ważnymi wymaganiami dla indukowanej receptorem uczulenia wszystkich izoform AC. Ponadto kilka badań sugeruje, że sygnalizacja z kinaz białkowych i podjednostek Gβγ jest zaangażowana w uczulenie2,11-13. Poszczególne AC wykazują również unikalne i wyraźne wzorce uczulania12. Na przykład utrzymująca się ekspozycja receptorów D2 na agonistów wiąże się z uczuleniem AC1 i AC8 na stymulację Ca2 + / kalmoduliną14,15, podczas gdy blisko spokrewniony AC3 nie jest uczulony2. AC2, AC4 i AC7 są blisko spokrewnione, jednak tylko stymulowana przez PKC aktywność AC2 jest silnie uwrażliwiona po długotrwałej ekspozycji receptorów D2 na agonistów7,14,16,17. Dodatkowo, AC5 i AC6 wykazują wyraźny stopień heterologicznego uczulenia na akumulację cAMP stymulowaną gazem i forskoliną po aktywacji receptorów D2 14,18-20, ale wydają się różnić pod względem wymagań dotyczących interakcji podjednostki Gβγ z AC21. Chociaż większość badań nad uczuleniem na prąd przemienny wykorzystywała modelowe linie komórkowe (np. komórki HEK293 wykazujące ekspresję poszczególnych izoform AC), wydaje się, że wyniki te przekładają się na natywne modele komórek neuronalnych4,22. Ostatnio efekty selektywnych inhibitorów małych cząsteczek izoform AC zidentyfikowanych w komórkach HEK293 eksprymujących izoformy AC można również przełożyć na badania behawioralne in vivo 23.

Brak zidentyfikowanego molekularnego mechanizmu heterologicznego uczulenia prawdopodobnie odzwierciedla złożoność odpowiedzi adaptacyjnej, jak również unikalne właściwości regulacyjne poszczególnych izoform AC12. Rozwikłanie takiej złożoności jest dodatkowo skomplikowane ze względu na zastosowanie uciążliwej metodologii, która ograniczyła badaczy akademickich w stosowaniu bezstronnych podejść. Na przykład nasze poprzednie badania mechanistyczne obejmowały wykorzystanie modeli komórkowych hodowanych w sposób ciągły przy użyciu 24- i 48-dołkowych kultur tkankowychw formacie 15. Hodowane komórki były zwykle hodowane przez 48 godzin, a następnie poddawane agonistycznemu leczeniu farmakologicznemu (2-18 godzin), po którym następowała seria płukania komórek i inkubacji (ryc. 1). Następnie zastosowano protokoły akumulacji cAMP specyficzne dla izoformy AC, a następnie dokonano pomiaru akumulacji cAMP przy użyciu pracochłonnej i czasochłonnej metodologii wiązania [3H]cAMP15,24. Czas trwania od początku do końca każdego testu wymagał na ogół od czterech do pięciu dni od posiewu komórek do analizy danych (ryc. 1). Zastosowanie nowych technologii i automatyzacji doprowadziło do znacznego ulepszenia badań nad uczuleniem w warunkach przemysłowych i ośrodków HTS. Na przykład grupa współpracująca z National Center for Chemical Genomics poinformowała o dwudniowej procedurze testu HTS w celu identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów μ uczulenia wywołanego receptorem opioidowym w formacie 1536-dołkowym25.

Niniejszy artykuł opisuje nasze wysiłki zmierzające do opracowania testu HTS do badań nad heterologicznym uczulenictwem przy użyciu technologii, które są dostępne w większości akademickich instytucji badawczych. Strategia ta została osiągnięta poprzez włączenie kriokonserwowanych komórek z modeli komórkowych heterologicznie eksprymujących receptor dopaminyD2 w połączeniu z endogennymi lub indywidualnymi rekombinowanymi izoformami cyklazy adenylowej (CHO-D2L lub HEK-AC6 / D2L). Aby poprawić naszą przepustowość, przeprojektowaliśmy nasz 48-dołkowy test uwrażliwiający (ok. >20 kroków w ciągu 4-5 dni) na pięcioetapowy, jednodniowy test w formacie 384-dołkowym, który był zasadniczo "wymieszaj i przeczytaj". Nowy format wykorzystuje dostępny na rynku test jednorodnej fluorescencji rozdzielczej w czasie (HTRF) do pomiaru akumulacji cAMP w nienaruszonych komórkach za pomocą wielomodowego czytnika płytek. Test jest solidny i podatny na badania przesiewowe małych cząsteczek i może być skutecznie stosowany do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów uczulenia heterologicznego. Ponadto dostarczamy dane, które pozwalają na zastosowanie tego testu z odwrotną transfekcją siRNA do celowanych lub obejmujących cały genom badań przesiewowych biblioteki siRNA z niewielkimi modyfikacjami podejścia ogólnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspansja i kriokonserwacja komórek gotowych do testów

  1. Hodowla komórek CHO-K1-DRD2L (CHO-D2L) na naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 15 cm2 w pożywce F12 Hama uzupełnionej 1,0 μM L-glutaminy, 800 μg/μl G418, 300 μg/μl higromycyny, 100 μg/μl penicyliny, 100 μg/μl streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 , aż komórki zlewają się w 90-95%. Przemyć komórki 10 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i zebrać komórki, dodając 3 μl buforu dysocjacji komórek na 5 minut w temperaturze 37 °C. Ponownie zawiesić komórki przy użyciu 12 μl pożywki hodowlanej i policzyć komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego.
  3. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 μl pożywki do zamrażania (10% dimetylosulfotlenku, 90% FBS). Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek (np. 1-20 x 106 komórek/μl).
  4. Podwielokrotność 1,0 μl roztworu komórkowego do każdego kriowialu. Inkubować kriowiale w pojemniku do zamrażania komórek w temperaturze -80 °C przez noc. Przenieś kriowiale do zbiornika z płynnymN2 w celu długotrwałego przechowywania.

2. Komórki gotowe do testu posiewu (i opcja odwrotnej transfekcji)

  1. Szybko rozmrozić zamrożony kriowial komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu komórek przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 μl zawierającej 9 μl Opti-MEM i wymieszaj, odwracając probówkę 3-5 razy.
  2. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 μl Opti-MEM.
  3. Policz komórki, stosując wykluczenie błękitu trypanowego, aby określić żywotność komórek i w razie potrzeby rozcieńczyć żywe komórki (np. stężenie 3 x 105 komórek/μl) w Opti-MEM. Płytka 10 μl/basenik komórek w kulturze tkankowej na płytce 384-dołkowej poddanej działaniu pipety wielokanałowej.
  4. Wykonaj seryjne rozcieńczenia cAMP w Opti-MEM, aby wygenerować standardową krzywą do oszacowania produkcji cAMP przez ogniwa (zgodnie z zaleceniami producenta - patrz rozdział 7). Dodać 10 μl/dołek wzorców cAMP do płytki. Uwaga: pojedynczą krzywą wzorcową można przygotować na oddzielnej płytce lub w studzienkach zerowych na jednej z płytek testowych.
  5. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 1 godzinę.

3. Opcja odwróconej transfekcji siRNA*

Ta sekcja jest opcjonalna i dotyczy rysunku 3.

  1. Przygotować roztwór siRNA w wolnym od RNaz ddH2O (np. 0,4 pmol/μl). Dodać 5 μl do poszczególnych dołków na płytce 384-dołkowej i odwirować płytkę przy 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.
  2. Rozcieńczyć Lipofectamine 2000 w Opti-MEM przez współczynnik 0,006 (np. dodać 6 μl Lipofectamine 2000 do 1 000 μl Opti-MEM) i mieszać pipetując w górę i w dół.
  3. Inkubować roztwór Lipofectamine 2000/Opti-MEM przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 5 μl rozcieńczonego roztworu Lipofectamine 2000/Opti-MEM do indywidualnych studzienek 384-dołkowej płytki, która zawiera już siRNA. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Komórki gotowe do przeprowadzenia testu na płytce, jak opisano powyżej (sekcja 2). Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.
  6. Włożyć płytkę testową do nawilżonego inkubatora w temperaturze 37 °C (5% CO2) przez 48-96 godzin, zgodnie z ustaleniami dla docelowego knock down genu (patrz dyskusja).

4. Badania przesiewowe małych cząsteczek

  1. Rozcieńczyć interesujący Cię lek (np. inhibitory małocząsteczkowe) w Opti-MEM do 6-krotności pożądanych stężeń końcowych. Seryjne rozcieńczenia można wykonywać za pomocą pipet ręcznych lub stacji obsługi cieczy.
  2. Dodać 2,5 μl/basenik badanego związku lub nośnika zawierającego bufor (np. DMSO) na bok studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.
  3. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej (inkubacja jest opcjonalna).

5. Leczenie uporczywym agonistą

  1. Przygotować roztwór chinpirolu o stężeniu 600 nM (tj. 6-krotność pożądanego stężenia końcowego wynoszącego 100 nM) w Opti-MEM.
  2. Dodać 2,5 μl/studzienkę roztworu kwinpirolu o stężeniu 600 nM na bok studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
  3. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 przez 2 godziny.

6. Stymulacja akumulacji cAMP

  1. Podczas 2-godzinnej inkubacji przygotuj roztwór stymulacyjny w Opti-MEM. Roztwór stymulacyjny składa się z 40 μM forskoliny, 2 μM 3-izobutylo-1-metyloksantyny (IBMX) i 4 μM spiperonu (wszystkie stężenia w kroku 6 są 4x większe od pożądanego stężenia końcowego).
  2. Dodać 5 μl/studzienkę roztworu stymulującego na bok studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.
  3. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.

7. Wygaszanie i szacowanie akumulacji cAMP

  1. Produkcja cAMP przez ogniwa jest mierzona za pomocą zestawu cAMP dynamic 2 zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, rozpuść anty-cAMP-cryptate i cAMP-d2 w wodzie destylowanej. Zamrażać podwielokrotności w temperaturze -20 °C w celu krótkotrwałego przechowywania.
  2. Rozcieńczyć oddzielnie jedną podwielokrotność anty-cAMP-krystatu i jedną podwielokrotność cAMP-d2 w buforze do lizy zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi sporządzania roztworów roboczych.
  3. Dodać 10 μl/basenik roztworu roboczego anty-cAMP-cryptate i 10 μl/basenik roztworu roboczego cAMP-d2 do płytki 384-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej.
  4. Odwirować płytkę o sile 100 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  5. Odczytaj płytkę w czytniku płytek fluorescencyjnych (automatyczne ustawienie skali czułości) przy wzbudzeniu 337 nm i zmierz emisje przy 620 nm i 665 nm zgodnie z instrukcją producenta.
  6. Zastosuj analizę ratiometryczną, aby ocenić standardową krzywą cAMP zgodnie z instrukcjami producenta. Korzystając z otrzymanych wartości, ekstrapoluj szacowaną akumulację cAMP w studzienkach testowych za pomocą oprogramowania do analizy danych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Część I. Opracowanie heterologicznego testu sensybilizacji w formacie 384 dołków do identyfikacji inhibitorów małocząsteczkowych z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego modelu komórkowego.

Aby zbadać sensytyzację heterologiczną w modelu komórkowym, wprowadziliśmy szereg ulepszeń, które pozwoliły nam zoptymalizować analizę do formatu typu „wymieszaj i odczytaj” (mix and read). Poniżej wyróżniono kilka kluczowych modyfikacji, które zostały szczegółowo opisane w dyskusji. Pierwsz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Starając się ułatwić badania nad uczuleniem heterologicznym, znacznie zmodyfikowaliśmy naszą poprzednią metodę, uzyskując uproszczony format "mieszaj i czytaj", który można dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych i badania mechanizmu działania. Główne modyfikacje naszego protokołu można podsumować w następujący sposób: 1) zastosowanie komórek kriokonserwowanych jako odczynników "gotowych do testu"; 2) miniaturyzacja testu do formatu 384-dołkowego; oraz 3) wykorzystanie pomiaru cAMP za pomocą HTRF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Panu Richardowi Zinkowi i Toddowi Wiernickiemu za szkolenie metodologiczne i wskazówki dotyczące testów. Dziękujemy również Johnowi Paulowi Spence'owi za uważną lekturę i sugestie redakcyjne. Prace te były wspierane przez National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation oraz Eli Lilly and Company w ramach programu Lilly Research Award Program (LRAP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CHO-K1-DRD2L komórkiDiscoveRx930579C2
Szynka' s F12 mediaVWRSH30026fs
Płodowa surowica bydlęcaVWRSH3007003
G418SigmaA1720
HygromycynaFisher50-230-5556
Penicylina/streptomycynaLife Technologies15070063
Naczynia 15 cmBD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
Bufor dysocjacji komórekLife Technologies13150016
Fosforany buforowane solą fizjologicznąTechnologies10010-049
KriowialneFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
384-dołkowe płytkiPerkin-Elmer6007688
Zestaw HTRF cAMP Dynamic 2Cisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6Oprogramowanie GraphPadNA
3-izobutylo-1-metyloksantynaSigmaI5879
(±)QuinpiroleSigmaQ111
SpiperoneSigmaS7395
ClozapineSigmaC6305
HaloperidolSigmaH1512
S-(-)SulpirideSigmaS112
Lipofectamine 2000 odczynnik do transfekcjiInvitrogen11668019
Trypan blueLife TechnologieT10282
Woda, DNazy i RNazy wolne od biolekówMP821739
Gas siRNADharmaconniestandardowa kontrola siRNA
Nieukierunkowana kontrola siRNADharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02
Life

Bibliografia

  1. Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
  2. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
  3. Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
  4. Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
  5. Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
  6. Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
  7. Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
  8. Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
  9. Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
  10. Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
  11. Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
  12. Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. Siehler, S., Milligan, G. 10, Cambridge University Chapter. 189-217 (2010).
  13. Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
  14. Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
  15. Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
  16. Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
  17. Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
  18. Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
  19. Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
  21. Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324(2012).
  22. Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
  23. Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3(2011).
  24. Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
  25. Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
  26. Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
  27. Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
  28. Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
  29. Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4(2010).
  30. Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user's guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
  31. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  32. Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
  33. Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478(2012).
  34. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
  35. Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
  36. Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Uczulenie cyklazy adenylowejtest akumulacji cAMPwysokoprzepustowe przesiewanieformat 384 do kowykom rki kriokonserwowanedetekcja HTRFprzesiewanie ma ych cz steczekodwrotna transfekcja siRNAreceptor dopaminowy D2traktowanie quinpirolem
Uwrażliwienie cyklazy adenylowej na leki: usprawnienie i miniaturyzacja testów do zastosowań przesiewowych małych cząsteczek i siRNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.