Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

12.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51219

⸱

15 czerwca 2014

 ,  , 
1Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.

Streszczenie

Technika ekspansji komórek w celu zgromadzenia dużej liczby komórek z pojedynczej próbki do eksperymentów badawczych i prób klinicznych byłaby bardzo korzystna dla społeczności komórek macierzystych. Wiele obecnych metod ekspansji jest pracochłonnych i kosztownych, a te obejmujące całkowitą dysocjację mogą powodować różnicowanie lub wczesne starzenie się kilku typów komórek macierzystych i progenitorowych. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy zautomatyzowaną metodę mechanicznego pasażowania, zwaną "siekaniem", która jest prosta i niedroga. Technika ta pozwala uniknąć chemicznej lub enzymatycznej dysocjacji na pojedyncze komórki, a zamiast tego pozwala na ekspansję na dużą skalę zawieszonych, sferoidalnych kultur, które utrzymują stały kontakt komórka/komórka. Metoda siekania była stosowana głównie w przypadku płodowych nerwowych komórek progenitorowych lub neurosfer pochodzących z mózgu, a ostatnio została opublikowana do stosowania z nerwowymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Procedura polega na wysiewie neurosfer na szalce Petriego w kulturze tkankowej, a następnie przepuszczeniu ostrego, sterylnego ostrza przez komórki, skutecznie automatyzując żmudny proces ręcznej mechanicznej dysocjacji każdej kuli. Zawieszenie komórek w hodowli zapewnia korzystny stosunek powierzchni do objętości; ponieważ ponad 500 000 komórek może być hodowanych w jednej neurosferze o średnicy mniejszej niż 0,5 mm. W jednej kolbie T175 ponad 50 milionów komórek może rosnąć w kulturach zawiesinowych, w porównaniu do zaledwie 15 milionów w kulturach przylegających. Co ważne, procedura rozdrabniania została zastosowana zgodnie z obecną dobrą praktyką produkcyjną (cGMP), co pozwala na masową produkcję produktów komórkowych klasy klinicznej.

Wprowadzenie

Istnieje długa historia ekspansji nerwowych komórek macierzystych gryzoni w hodowli jako monowarstwa1-3 lub zagregowane neurosfery4-7. Ponadto ludzkie neuronalne komórki progenitorowe (hNPC) wyizolowane z różnych regionów rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego8-17 zostały namnażone in vitro. Komórki te są bipotencjalne, zdolne do różnicowania się zarówno w astrocyty, jak i neurony, i są bardzo przydatnym narzędziem w badaniu rozwoju neuronalnego18,19 i mechanizmu choroby20,21. hNPC zostały również przeszczepione do wielu różnych modeli zwierzęcych choroby ośrodkowego układu nerwowego o różnym poziomie integracji, przeżycia i efektów funkcjonalnych22-24.

Tradycyjnie, NPC pochodzące od gryzoni lub ludzkich płodów są narażone na czynniki wzrostu - często naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i/lub czynnik wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2)25-28 - i zarówno przylegające29, jak i trójwymiarowe systemy sferoidalne są zazwyczaj pasażowane za pomocą dysocjacji enzymatycznej do zawiesiny jednokomórkowej30-34. Standardową metodą namnażania komórek do celów badawczych lub klinicznych jest adherentna monowarstwa ze względu na łatwą manipulację. Wykazaliśmy jednak, że pasażowanie jednowarstwowych i neurosferycznych hNPC z roztworami enzymatycznymi lub chemicznymi powodowało wczesne starzenie się35. Ponadto dysocjacja enzymatyczna może powodować zwiększony poziom różnicowania i nieprawidłowości kariotypowe na podstawie danych wykazanych na embrionalnych komórkach macierzystych36-38. Chociaż standardowa metoda pasażowania hNPC pozwoliła na opracowanie aktualnych produktów klasy dobrej praktyki wytwarzania (cGMP), które przeszły do badań klinicznych fazy 1 (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), metoda ta pozwoliła tylko na kilka rund amplifikacji komórek, co ograniczyło potencjał bankowania.

Oczywiście, duże eksperymenty badawcze i przyszłe próby kliniczne mogłyby skorzystać z możliwości masowego rozmnażania komórek i opóźnionego starzenia, co pozwoliłoby na wzrost na dużą skalę i bankowanie komórek. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, opracowaliśmy nowatorski i zautomatyzowany sposób mechanicznego przechodzenia nienaruszonych neurosfer poprzez "krojenie" ich na małe skupiska w celu utrzymania kontaktu między komórkami. Metoda ta znacznie wydłużyła ich żywotność39 , a hodowla zawiesinowa pozwala na bardziej efektywne wykorzystanie przestrzeni inkubatora w porównaniu z kulturami jednowarstwowymi, co widać w przypadku alternatywnej metody hodowli w bioreaktorze3D 40. Dostarczony protokół siekania pozwala na produkcję dużych banków z jednej próbki płodu większej niż pasaż 10, co jest mało prawdopodobnym wyczynem przy użyciu standardowych metod pasażowania. Chociaż ta metoda pasażowania hNPC jest niekonwencjonalna, zyskuje na popularności i została niedawno opublikowana z innymi typami komórek, takimi jak nerwowe komórki macierzyste pochodzące z ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, umożliwiając ekspansję na dużą skalę do różnych zastosowań, w tym modelowania chorób in vitro 41-46. Co ważne, przy użyciu metody siekania stworzono już bank komórek hNPC klasy cGMP, co pokazuje, że technika ta może być stosowana w przyszłych zastosowaniach klinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Oświadczenie etyczne i bezpieczeństwo

  1. Niniejsza procedura wiąże się z wykorzystaniem produktów hodowli komórkowych pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego. Wszystkie pochodne tkanki muszą zostać zatwierdzone przed użyciem przez odpowiednią Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board) i/lub Komisję ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee).
  2. Wszystkie odpady biologicznie niebezpieczne muszą być utylizowane zgodnie z przepisami bezpieczeństwa ustalonymi przez odpowiednią instytucję. Należy znać i stosować wszystkie właściwe wytyczne dotyczące bezpieczeństwa i utylizacji podczas przeprowadzania tej procedury.

2. Przygotowanie sprzętu, materiałów, odczynników i obserwacje

  1. Przygotowanie
    1. Przygotować szklaną szalkę Petriego, krążki papieru filtrowanego o średnicy 8,5 cm oraz dwustronne żyletki preparacyjne.
    2. Umieścić kawałek papieru filtrowanego w szalce Petriego, a następnie przełożyć kilka nieopakowanych żyletek na papier w szalce.
    3. Wielokrotnie układać warstwy papieru filtrowanego i żyletek, aż szalka Petriego będzie wypełniona w około 75%, przykryć pokrywką szalki i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w środowisku sterylnym lub zamkniętym w celu zachowania sterylności.
    4. Wysterylizować w autoklawie pęsetę 18 cm oraz autoklawowalny klucz do nakrętek w worku do sterylizacji. W przypadku produkcji zgodnie z zasadami cGMP wysterylizować w autoklawie kilka stalowych podkładek w workach do sterylizacji. Więcej informacji na temat podkładek znajduje się w kroku 3.5.
    5. Zdezynfekować komorę z laminarnym przepływem powietrza (BSC) 70% alkoholem izopropylowym (IPA).
    6. Wszystkie procedury muszą być wykonywane w BSC w celu zachowania sterylności. Aseptycznie przenieść do BSC następujące elementy:
      1. Siekacz do tkanek McIlwain (siekacz). Przetrzeć wszystkie powierzchnie 70% IPA, zwłaszcza ramię siekacza (Rysunek 1B). W razie potrzeby cały siekacz można odkażać tlenkiem etylenu.
      2. Jeden wysterylizowany w autoklawie klucz do nakrętek lub klucz płaski (dołączony do siekacza, Rysunek 1I), jedną pęsetę 18 cm, jeden zestaw standardowych mikropipet (20 µl-1 000 µl), jeden kontroler pipet oraz statywy na probówki.
      3. Sterylne jednorazowe pipety serologiczne, końcówki do pipet z filtrem, probówki stożkowe 15 ml, szalki Petriego 60 mm, dwustronne żyletki preparacyjne oraz odpowiednio dobrane kolby T. OSTROŻNIE: Ostrymi żyletkami należy operować wyłącznie za pomocą pęsety.
  2. Odczynniki
    1. Namnażać hNPC w pożywce utrzymującej (MM) składającej się z pożywki do namnażania neuralnych komórek macierzystych, EGF w stężeniu 100 ng/ml oraz czynnika hamującego białaczkę (LIF) w stężeniu 10 ng/ml. Przenieść odczynniki oraz urządzenie(ia) do filtracji niezbędne do przygotowania pożywek do BSC.
    2. Rozpuścić liofilizowany EGF w pożywce do namnażania neuralnych komórek macierzystych i przygotować alikwoty o stężeniu 100 µg/ml, które należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 1 rok. LIF przechowuje się w oryginalnym opakowaniu w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 6 miesięcy lub do daty ważności podanej przez producenta.
    3. Przenieść odczynniki MM do BSC. Połączyć wszystkie odczynniki w odpowiednio dobranej jednostce filtracyjnej i przefiltrować za pomocą aparatu próżniowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 tygodnie.
  3. Obserwacje hNPC
    1. Dwoma najważniejszymi czynnikami, które należy ocenić przed siekaniem, są średnica sfer oraz kondycja lub kolor pożywki. Pożywkę kondycjonowaną (CM) definiuje się jako pożywkę zmetabolizowaną przez hNPC w hodowli w warunkach inkubatora (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności). W miarę metabolizowania pożywki przez komórki czerwony fenol zmieni kolor z różowego na żółty, co oznacza bardziej kwaśne środowisko (Rysunek 5D).
    2. Podnieść kolbę(kolby) z hNPC pod światło, aby ocenić kolor pożywki (szczegóły w dyskusji).
    3. Przeskanować zawartość kolby za pomocą mikroskopu w celu obserwacji komórek. Użyć siatki pomiarowej do zbadania wielkości sfer. Jeśli wiele sfer ma średnicę 300 µm lub większą, przejść do procesu siekania. Siekać komórki co 7-10 dni.
    4. Jeśli siekanie nie jest uzasadnione, wymieniać 25-75% CM na świeżą pożywkę co 3-4 dni, w zależności od tego, jak szybko komórki metabolizują pożywkę. Kontynuować wymianę pożywki, aż sfery osiągną wielkość umożliwiającą pasażowanie.
    5. hNPC są zazwyczaj siekane w stosunku 1:2, z mniejszych kolb do większych. W celu zapoznania się z zaleceniami dotyczącymi wielkości i objętości kolb należy skorzystać z Tabeli 1.
KolbaObjętość całkowita pożywkiPrzed siekaniem→Po siekaniu
1 T12.55 ml1 T12.5→1 T25
1 T2510 ml1 T25→1 T75
1 T7520 ml1 T75→1 T175
1 T17540 ml1 T175→2 T175s
2 T175s80 ml2 T175s *→4 T175s
* 2 T175s to maksymalna liczba kolb, które można siekać jednocześnie. Siekać w seriach po 2 T175s i odnieść się do kroku 7.

Tabela 1. Paradygmat ekspansji hNPC. Opis typowego schematu ekspansji hNPC. Standardem jest dwukrotne zwiększenie objętości co 7-10 dni.

3. Konfiguracja przerywacza wiązki

Schemat siekacza do tkanek; widok z góry, z boku, z przodu; siła ostrza, zwolnienie stołu, przetwarzanie tkanek.
Rysunek 1. Siekacz do tkanek McIlwaina. A) Mikrometr do regulacji grubości cięcia, B) Podstawa ramienia siekacza i przymocowane ramię, C) Haczyk w uchwycie płytki do szalek Petriego, D) Pokrętło zwalniania stołu i tacka, E) Pokrętło kontroli siły ostrza, F) Przełącznik resetowania, G) Uchwyt płytki, H) Śruba mocująca ostrze, zacisk i nakrętka, I) Klucz do nakrętek dołączony do siekacza, J) Nakrętka ostrza/zacisku, K) Zacisk ostrza, L) Pokrętło automatycznej kontroli prędkości siekania, M) Pokrętło ręcznej obsługi ramienia siekającego, N) Włącznik zasilania.

  1. Podłącz urządzenie do rozdrabniania do gniazdka w BSC i włącz przełącznik zasilania (Rysunek 1N). Ustaw odległość cięcia na 200 µm (Rysunek 1A). Ustaw siłę ostrza na 270° lub godzinę 9:00, gdyby pokrętło było zegarem (Rysunek 1E). Potwierdź, że pokrętło automatycznej prędkości jest obrócone maksymalnie w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (Rysunek 1L).
  2. Przesuń blokadę stołu całkowicie w prawo i potwierdź, że uchwyt płytki jest stabilny (Rysunek 1D).
  3. Obróć ręczny manipulator ramienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby podnieść ramię do maksymalnego poziomu (Rysunek 1M). Ręczny manipulator ramienia należy obracać wyłącznie zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
  4. W sposób aseptyczny przenieś sterylną, dwukrawędziową ostrze do rozdrabniania na śrubę ramienia urządzenia za pomocą pęsety (Rysunek 1H).
  5. Wykonaj ten krok wyłącznie w przypadku pasażowania zgodnie z cGMP, ponieważ sama szalka Petriego jest wystarczająca do przetwarzania w standardzie badawczym. Jak wspomniano w kroku 2.1.4, w przypadku cGMP wymagane jest umieszczenie podkładek dystansowych w podstawie szalki Petriego. Podkładka dystansowa zapobiega wbudowywaniu się odłamków plastiku w sfery podczas procedury rozdrabniania. Dla każdego planowanego cięcia przenieś jedną podkładkę dystansową do podstawy każdej szalki Petriego i przykryj ją.
  6. W sposób aseptyczny nałóż zacisk (Rysunek 1K) nad ostrze, używając pęsety. Zakrzywiona część zacisku musi znajdować się nad górną krawędzią ramienia. Zacisk nie utrzyma się na ramieniu, dopóki nakrętka nie zostanie bezpiecznie zamocowana. Użyj pęsety, aby przytrzymać zacisk na ramieniu i dokręć nakrętkę (Rysunek 1J) na śrubie za pomocą sterylnego klucza do nakrętek. Pozostaw nakrętkę luźną o ¼ obrotu.

4. Procedura przed rozdrobnieniem

  1. Przenieś sugerowaną objętość MM do nowej kolby (kolb) zgodnie z Tabelą 2, Kolumną C.
  2. Aseptycznie przenieś komórki z inkubatora do BSC. Oprzyj kolbę (kolby) o statyw na probówki (Rycina 2A) i poczekaj, aż sferoidy osiądą w kolbie (kolbach).
  3. Po osiadaniu odessij do 12 ml supernatantu za pomocą pipety serologicznej 5 ml lub 10 ml i wypłucz wszystkie słabo przylegające sferoidy z powierzchni kolby (kolb). Powtórz w razie potrzeby, pozwalając sferoidom osiąść pomiędzy płukaniami.
  4. Przenieś sugerowaną objętość CM do nowej kolby (kolb) zgodnie z Tabelą 2, Kolumną D. W przypadku pasażowania dwóch lub więcej kolb T175, przejdź do kroku 7.1.
  5. Przenieś całą pozostałą objętość CM oraz sferoidy do nowej probówki stożkowej 15 ml. Pozostaw sferoidy do osiadania, a zużytą kolbę (kolby) wyrzuć.
  6. Krok krytyczny: Powoli przenieś sferoidy z probówki stożkowej 15 ml na szalkę Petriego 60 mm lub dysk dystansowy w najmniejszej możliwej objętości; zalecane jest 0,1-0,5 ml (Rycina 2B). Zachowaj pozostałą objętość CM, ponieważ zostanie ona wykorzystana do wypłukania komórek z szalki po posiekaniu. Staraj się zminimalizować powierzchnię szalki zajmowaną przez medium i sferoidy (Rycina 2C).

Proces hodowli komórkowej w szalkach Petriego, przygotowanie pożywki i nakładanie żelu; kroki eksperymentalne.
Rysunek 2. Przygotowanie sfer do siekania. A) Oprzyj kolbę(kolby) o statyw na probówki lub podobny przedmiot, aby sfery osiadły w narożniku kolby. B) Przenieś sfery z probówki stożkowej do szalki Petriego tak gęsto, jak to możliwe. C) Zbierz sfery z probówki stożkowej w środku szalki Petriego. D) Usuń jak najwięcej nadsączu z powierzchni zgromadzonych sfer. E) Rozprowadź sfery, używając boku plastikowego końcówki do mikropipety. F) Delikatnie przesuń sfery na jedną stronę skupiska. G) Przykład sfer przesuniętych na jedną stronę skupiska w celu ułatwienia usunięcia pożywki. H) Skondensowane sfery rozprowadzone na szalce Petriego, gotowe do siekania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

  1. Następnie należy zagęścić sferoidy poprzez usunięcie nadsączu przeniesionego w kroku 4.6. Przenieś nadsącz z powrotem do probówki stożkowej 15 ml za pomocą mikropipety z końcówkami z filtrem (Rysunek 2D), unikając pobrania sferoidów. Zacznij od usunięcia jak największej ilości pożywki z górnej warstwy mieszaniny pożywki i komórek. Gdy usunięcie pożywki bez sferoidów nie będzie już możliwe, przejdź do następnego kroku.
Kolumna AKolumna BKolumna CKolumna DKolumna EKolumna F
Rozmiar kolby przed siekaniem→Rozmiar kolby (kolb) po odcięciuSugerowana objętość MM do przeniesienia do nowej kolby (koleb) przed cięciemSugerowana objętość pożywki warunkowej (CM) do przeniesienia do nowej kolby/kolb przed etapem siekaniaSugerowana objętość sfer/pożywki do przeniesienia do nowej kolby/kolb po rozdrobnieniuKońcowa objętość wysiewu/kolba
T12.5→T255 ml0 ml5 ml10 ml
T25→T7510 ml 0 ml10 ml20 ml
T75→T17520 ml10 ml10 ml40 ml
1 T175→2 T175s20 ml na kolbę15 ml na kolbę5 ml na kolbę40 ml
2 kolby T75→4 T175s20 ml na kolbę17,5 ml na kolbę2,5 ml na kolbę40 ml

Tabela 2. Przewodnik po transferze mediów przed i po rozdrabnianiu. Sugerowane objętości do wykorzystania podczas procesu rozdrabniania.

  1. Rozprowadź skupisko za pomocą boku końcówki pipety, aby zwiększyć powierzchnię (Rysunek 2E).
  2. Krok krytyczny: Lekko przechyl szalkę Petriego w swoją stronę i za pomocą boku końcówki pipety ostrożnie przesuń wszystkie sferoidy na jedną stronę skupiska (Rysunek 2F,G).
  3. Krok krytyczny: Gdy wszystkie komórki zostaną przeniesione, powoli przechyl szalkę Petriego w przeciwnym kierunku. W tym procesie sama pożywka odpłynie od sferoidów. Przenieś pożywkę z powrotem do stożkowej probówki 15 ml. Dopuszczalne jest usunięcie minimalnej ilości sferoidów.
  4. Użyj boku końcówki pipety, aby ostrożnie przesunąć wszystkie sferoidy z powrotem na środek szalki Petriego, tak aby skupisko miało średnicę 0,5-2,4 cm (Rysunek 2H). Ważne jest, aby głębokość skupiska sferoidów pozostała niewielka. Jeśli skupisko będzie zbyt głębokie, sferoidy zostaną po prostu odepchnięte na boki podczas siekania. UWAGA: Średnica skupiska sferoidów nie może przekraczać 2,5 cm, w przeciwnym razie ostrze zetknie się z krawędziami szalki Petriego, omijając komórki.

5. Procedura Chop

  1. Przenieś szalkę Petriego na uchwyt do płytek (Rycina 1G) i upewnij się, że szalka jest zabezpieczona pod hakami uchwytu do płytek (Rycina 1C).
  2. Pokrętło zwalniające stół posiada nacięcia, w których zazębia się z mechanizmem. Użyj pokrętła zwalniającego stół, aby przesunąć uchwyt do płytek w lewo, tak aby ostrze znajdowało się poza sferami i było zablokowane w mechanizmie (Rycina 1D).
  3. Krok krytyczny: Opuść ramię siekacza, obracając ręczne pokrętło manipulatora (Rycina 1M) zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż ostrze przylgnie płasko do szalki Petriego. Jedną ręką dociśnij mocowanie ramienia (Rycina 1B), dokręcając jednocześnie nakrętkę za pomocą klucza do nakrętek.
  4. Naciśnij raz przycisk resetu (Rycina 1F). Stabilizuj szalkę Petriego jedną ręką, obracając automatyczne pokrętło manipulatora ramienia (Rycina 1L) zgodnie z ruchem wskazówek zegara do pozycji 90° lub godziny 12:00, gdyby pokrętło było zegarem. OSTROŻNIE: Przez cały czas trzymaj palce z dala od ruchomego ostrza.
  5. Przeprowadź ostrze całkowicie przez skupisko sfer. Obróć uchwyt do płytek o 90°.
  6. Poluzuj śrubę i powtórz kroki 5.3-5.5.
  7. W warunkach aseptycznych przenieś szalkę Petriego z uchwytu do płytek na obszar roboczy w BSC.

6. Procedura po rozdzieleniu (post-chop)

  1. Napełnij pipetę serologiczną 10 ml medium CM z probówki stożkowej z kroku 4.6, a następnie przenieś 1 ml na posiekane sferoidy. Delikatnie resuspenduj i przenieś do nowej probówki stożkowej 15 ml. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza i powtarzaj czynność tyle razy, ile jest konieczne, aby zebrać wszystkie posiekane sferoidy.
    WSKAZÓWKA: Ogranicz skrobanie dna naczynia, ponieważ mogą odrywać się fragmenty plastiku. Nie dotyczy to sytuacji, w których stosowane są podkładki z nierdzewnej stali. Należy uważać na przywieranie komórek do wewnętrznych ścianek plastikowej pipety serologicznej. Jeśli tak się stanie, okresowo odsysaj pęcherzyki powietrza przez medium w pipecie, aby odczepić komórki.
  2. Zmierz objętość CM i posiekanych sferoidów. Dodaj odpowiednią objętość MM, aby uzyskać objętość wskazaną w Tabeli 2, Kolumna E.
  3. Wykonaj tryturację sferoidów 2-3 razy, aby rozbić luźno połączone grupy sferoidów.
  4. Krok krytyczny: Rozdziel zawiesinę sferoidów do poszczególnych nowych kolb. Przenoś zawiesinę sferoidów do jednej kolby na raz i resuspenduj sferoidy pomiędzy kolejnymi transferami. Rozdzielanie do wielu kolb jednocześnie prowadzi do nieproporcjonalnej liczby sferoidów w każdej z nich. Objętość końcowa w każdej kolbie powinna być zgodna z objętościami w Tabeli 2, Kolumna F. W przypadku wysiewania do więcej niż dwóch kolb T175 przejdź do kroku 7.2.
  5. Odkręć nakrętkę za pomocą klucza, a następnie zdejmij zacisk za pomocą sterylnej pęsety. Odkaź odpowiednio 70% IPA lub zamiennikiem. OSTROŻNIE: Zużyte ostrze do siekania usuwaj wyłącznie pęsetą i utylizuj w pojemniku na odpady medyczne (ostre narzędzia).
  6. Odkaź wszystkie powierzchnie siekarki 70% IPA.

7. Zmienność procesu – wiele kolb

Istnieje kilka różnic w przypadku pasażowania więcej niż dwóch naczyń T175. Poniższe kroki stanowią modyfikacje odniesionego etapu.

  1. Odniesienia do kroku 4.4:
    1. Podczas pasażowania dwóch naczyń T175, należy połączyć całe medium oraz sfery w jednym naczyniu T175. Pozostawić sfery do osadzenia, a następnie odmierzyć odpowiednią objętość CM do każdego z nowych naczyń, zgodnie z Tabelą 2, Kolumna D. Przejść do kroku 4.5.
    2. Podczas pasażowania więcej niż dwóch naczyń T175, należy przygotować nowe naczynie T175 i oznaczyć je jako naczynie z CM. Wykonać krok 7.1.1, ale przenieść CM do naczynia z CM. Przechowywać naczynie z boku BSC w celu zbierania CM ze wszystkich naczyń, aż wszystkie zostaną poddane rozdrabnianiu. Następnie CM zostanie równomiernie rozdzielony do każdego z nowych naczyń.
  2. Odniesienie do kroku 6.4 – Podczas wielokrotnego rozdrabniania tej samej linii komórkowej, należy przenieść zawiesinę rozdrobnionych sfer do nowego naczynia T75 oznaczonego jako sfery po rozdrabnianiu i zapisać przeniesioną objętość. Kontynuować łączenie komórek w tym naczyniu po każdym rozdrabnianiu i przechowywać naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności. Po zakończeniu wszystkich etapów rozdrabniania, należy rozdzielić zawiesinę sfer objętościowo do każdego nowego naczynia. Przejść do kroku 6.5.

8. Kriokonserwacja

Poniższy protokół służy do kriokonserwacji hNPC.

  1. Rozmrozić medium do zamrażania komórek w czystej kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C, a następnie przechowywać na lodzie. Medium do zamrażania komórek można rozdzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -80 ˚C do 6 miesięcy.
  2. Wypalić szklane pipety Pasteura, obracając otwór pipety w płomieniu. Przygotować co najmniej dwie duże i dwie małe pipety wypalane (Rysunek 3). Sferoidy zostaną rozdzielone poprzez przenoszenie ich z pipet o dużej średnicy do pipet o małej średnicy.
  3. Umieścić TrypLE Select w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C na 5 min. Wyjąć i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu użycia.

Proces wyginania szklanych rurek, przykładanie ciepła z palnika Bunsena, schemat różnych rozmiarów otworu.
Rycina 3. Wypalanie końcówek szklanych pipet Pasteura. A) Trzymaj pipetę w górnej części płomienia i obracaj ją, aby równomiernie zaokrąglić krawędzie szklanej pipety. B) Przykład wypalonej szklanej pipety o dużym przekroju. C) Przykład wypalonej szklanej pipety o małym przekroju.

  1. Aseptycznie przenieś neurosfery do BSC. Pozostaw sfery do osiadania, opierając kolbę(kolby) o statyw na probówki, a następnie przepłucz dno kolby, aby usunąć słabo przylegające sfery. Pozostaw sfery do ponownego osiadania.
  2. Przenieś całą objętość CM poza 5-10 ml do sterylnej butelki i zmierz całkowitą objętość. Pozostałe sfery wraz z medium przenieś do probówki stożkowej.
  3. Po osiadnięciu wszystkich komórek przenieś całą objętość CM, poza niewielkim meniskiem, do butelki i zsumuj objętość.
  4. Aseptycznie przenieś 5-10 ml ogrzanego TrypLE Select do probówki stożkowej i resuspenduj pellet komórkowy. Umieść probówkę stożkową w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15-20 min. Po 7,5-10 min delikatnie potrząśnij probówką stożkową w celu wymieszania.
  5. Wykorzystując zmierzoną objętość CM z kroku 8.5, przygotuj równą objętość MM. Połącz i przefiltruj roztwór składający się w 50% z CM i 50% z MM (roztwór CM/MM).
  6. Aseptycznie umieść sitko 40 µm w probówce stożkowej 50 ml.
  7. Po zakończeniu inkubacji wiruj probówki stożkowe 15 ml przez 15 sek przy 100 x g.
  8. Ostrożnie odessij i odrzuć TrypLE Select oraz wszelkie włókniste zanieczyszczenia. Pozostaw niewielki menisk. Delikatnie dodaj 2–4 ml CM/MM, aby rozcieńczyć pozostały TrypLE Select, nie naruszając pelletu. Pozostaw ewentualne oderwane komórki do ponownego osiadania przed usunięciem płuczki.
  9. Dodaj do probówki ze sferami 2-5 ml roztworu CM/MM. Rozdziel sfery za pomocą pipety 5 ml, tryturując maksymalnie 10x. Pozostaw nierozdzielone sfery do osiadania na 1-2 min. Przenieś zawiesinę rozdzielonych komórek na sitko 40 µm, aby usunąć całkowicie nierozdzielone skupiska.
  10. Powtórz krok 8.12, używając wypalanej szklanej pipety o dużej średnicy, a następnie szklanej pipety o małej średnicy.
  11. Przepłucz sitko 2-5 ml roztworu CM/MM.
  12. Wymieszaj zawiesinę komórkową i pobierz próbki do analizy żywotności.
  13. Rozcieńcz próbki błękitem trypanu z odpowiednim współczynnikiem rozcieńczenia i dokonaj zliczenia. Użyj poniższego standardowego równania, aby obliczyć średnie stężenie żywych komórek oraz całkowitą liczbę żywych komórek.
    Wzór na liczbę żywych komórek, obliczanie gęstości komórek, równanie, analiza eksperymentu mikrobiologicznego.
  14. Oblicz całkowitą objętość medium do mrożenia komórek wymaganą do resuspendowania komórek w stężeniu 5.0 x 106 komórek/ml. Do każdej krioprobówki zostanie naniesione 1 ml komórek. Przenieś krioprobówki do BSC.
  15. Aby uzyskać najlepszą wydajność, wiruj zawiesinę komórkową w probówkach stożkowych 15 ml przy 200 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. W przypadku użycia probówek stożkowych 50 ml do mrożenia na większą skalę, zwiększ prędkość i czas do 400 x g przez 10 min.
  16. Resuspenduj pellet komórkowy w medium do mrożenia komórek w stężeniu 5.0 x 106 komórek/ml. Odmierz 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej krioprobówki. Aby zapewnić równomierny rozkład, odessij 6 ml zawiesiny i rozdziel do 5 krioprobówek po 1 ml. Pozostały 1 ml zawiesiny przenieś z powrotem do puli komórek. Powtarzaj do momentu wypełnienia wszystkich probówek.
  17. Aseptycznie zamknij wszystkie wypełnione krioprobówki i przenieś je na lód na 5-10 min.
  18. W celu kriokonserwacji hNPC zastosuj jedną z następujących strategii:Komora z alkoholem izopropylowym
    1. Wypełnij wymaganą liczbę komór 100% IPA w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieś wypełnione krioprobówki z lodu do komory(komór), a następnie umieść komorę(komory) w zamrażarce -80 °C na noc. Komórki są stabilne do jednego tygodnia w temperaturze -80 °C, jednak zaleca się przeniesienie probówek do długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie następnego dnia.
      Zamrażarka z kontrolowaną szybkością chłodzenia
    3. Wgraj odpowiedni program mrożenia do oprogramowania zamrażarki z kontrolowaną szybkością chłodzenia. Przykładowy program znajduje się w Tabeli 3. Rysunek 4 przedstawia typową krzywą mrożenia dla hNPC. Dokładny program będzie się jednak różnił w zależności od modelu zamrażarki. Standardowa ogólna szybkość chłodzenia próbek powinna wynosić około -1 °C/min aż do osiągnięcia -40 °C, po czym szybkość mrożenia może zostać znacznie zwiększona do co najmniej -80 °C.
KrokSzybkość (°C)Temperatura końcowa (°C)Czas utrzymania (min sek)Wyzwalacz
1----5 min 0 sKomora
2- 1.3- 5--Próbka
3----1 min 0 sKomora
4- 45- 58--Komora
5+ 10- 26--Komora
6+ 3- 23--Komora
7- 0.8- 40--Próbka
8- 10- 100--Komora
9- 35- 160--Komora

Tabela 3. Etapy zamrażania hNPC w zamrażarce z kontrolowaną szybkością chłodzenia. Sugerowany program kriokonserwacji hNPC w zamrażarce z kontrolowaną szybkością chłodzenia.

Wykres procesu chłodzenia kriogenicznego z programem, temperaturą komory i próbki w funkcji czasu; dane eksperymentalne.
Rycina 4. Krzywa zamrażania próbki. Typowa krzywa zamrażania dla hNPCs w zamrażarce z kontrolowaną szybkością chłodzenia.

  1. Przenieś krioprobówki z lodu do koszyków przeznaczonych do zamrażarki z kontrolowaną szybkością chłodzenia. Należy pamiętać, aby jedną krioprobówkę wypełnić wyłącznie medium do mrożenia komórek, która posłuży jako pojemnik dla sondy temperatury próbek. Przenieś koszyki do komory mrożącej i umieść sondę pomiarową w probówce kontrolnej. Uruchom program.
  2. Po zakończeniu protokołu przenieś probówki do długoterminowego przechowywania w ciekłym azocie.

9. Procedura rozmrażania

Poniższy protokół dotyczy rozmrażania kriokonserwowanych hNPC.

  1. Przenieś krioprobetki z przechowywania w ciekłym azocie bezpośrednio na suchy lód. OSTROŻNIE: Probówki mogą mieć pęknięcia lub niedokręcone nakrętki, co pozwala na dostanie się ciekłego azotu do wnętrza. Po wyjęciu z warunków głębokiego mrożenia ciecz może gwałtownie wrzeć, co prowadzi do natychmiastowego rozsadzenia probówki. Podczas wyjmowania probówek stosuj odpowiednie Środki Ochrony Indywidualnej.
  2. Przygotuj wcześniej wszystkie poniższe odczynniki i materiały. Po rozpoczęciu procesu rozmrażania kluczowe jest sprawne przeprowadzenie kolejnych kroków.
    1. Przenieś do BSC Neural Stem Cell Expansion Medium, MM, probówkę stożkową 15 ml oraz jedną pipetę serologiczną 2 ml i jedną 10 ml dla każdej krioprobetki.
    2. Dla każdej probówki wymagane jest minimum 9 ml Neural Stem Cell Expansion Medium oraz 5 ml MM. W razie potrzeby przygotuj większą ilość każdego z mediów.
  3. Rozmrażaj tylko jedną probówkę hNPCs naraz. Przenieś zamrożone komórki z suchego lodu do czystej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i stale mieszaj probówkę w łaźni. Monitoruj ilość roztopionego lodu. Gdy w probówce pozostanie fragment lodu o wielkości około 0.5 cm, spryskaj ją i przetrzyj 70% alkoholem izopropylowym, a następnie przenieś do BSC.
  4. Przenieś zawartość krioprobetki do probówki stożkowej 15 ml za pomocą pipety serologicznej 2 ml. Do pustej krioprobetki dodaj 1 ml Neural Stem Cell Expansion Medium, a następnie powoli, kroplami, dodawaj 8 ml Neural Stem Cell Expansion Medium do rozmrożonych komórek, delikatnie potrząsając probówką. Wykonuje się to w celu zmniejszenia ryzyka szoku osmotycznego.
  5. Przenieś płuczkę z krioprobetki do 9 ml zawiesiny komórkowej. Przenieś probówkę stożkową na lód i powtórz kroki 9.4-9.5 dla wszystkich pozostałych probówek.
  6. Wirowarkuj probówki stożkowe przy 200 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania przygotuj odpowiednią liczbę kolb do wysiewu zgodnie z Table 4.
Liczba fiolekCałkowita objętość wysiewu (ml)Kolba
15T12.5
210T25
315T75
420T75
525T75
630T175
735T175
840T175
8 +--Kombinacja kolb

Tabela 4. Wielkość kolb w zależności od liczby rozmrożonych krioprobek. Sugerowana objętość i wielkość kolby do wysiewu hNPC po rozmrożeniu.

  1. Resuspendować i połączyć zawartość wszystkich probówek w odpowiedniej objętości MM zgodnie z Tabelą 4. Dobrze wymieszać i pobrać próbkę do oceny żywotności. Szczegóły dotyczące liczenia znajdują się w krokach 8.15-8.16. Standardowy zakres wysiewu wynosi od 160 000 do 320 000 komórek/cm2.
  2. Dobrze wymieszać komórki i rozdzielić je do kolb. Przenieść kolby do inkubatora z 5% CO2/37 °C/95% wilgotności. Wymieszać zawartość kolby, delikatnie potrząsając nią w przód i w tył, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  3. Komórki utworzą sfery w ciągu 24-48 h. Czasami komórki mogą przytwierdzić się do plastikowej powierzchni i utworzyć kolonie o strukturze przypominającej plaster miodu. W takim przypadku pozostawić komórki na 3 dni, a następnie wypłukać je, aby pomóc w formowaniu sfer. Płukać co 1-3 dni, aż do całkowitego usunięcia komórek przylegających. W razie potrzeby przenieść komórki do nowej kolby.
  4. Wymieniać 25-75% pożywki na świeże MM co 3-4 dni, aż komórki będą gotowe do cięcia, co zazwyczaj następuje od 7 do 14 dni po rozmrożeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Porównanie metod wzrostu komórek; wykres, mikroskopia morfologii komórek przed i po rozdrabnianiu; fluorescencja.
Rycina 5. Reprezentatywne dane. A) Przewidywana liczba komórek hNPC zamrożonych w p19, a następnie rozmrożonych i namnożonych jako adherentna monowarstwa z wykorzystaniem dysocjacji en...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Schemat procesu hodowli neuralnych komórek macierzystych; izolacja kory płodowej, grupowanie, etapy pasażowania mediów.
Rycina 6. Schemat siekania. Namnażanie sferoidalnych komórek macierzystych/progenitorowych w hodowli z wykorzystaniem mechanicznej metody siekania.

Kluczowe etapy

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Soshanie Svendsen za krytyczną recenzję i redakcję tego raportu. Do tej pracy przyczynili się NIH/NINDS 1U24NS078370-01 i CIRM DR2A-05320.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka, 50 mlFisherbrandFB-100-50wielu producentów/dostawców
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa IIBakerSG-603AModel 4 stopy lub 6 stóp.  Zalecany model 6 stóp; wielu producentów/dostawców
Ostrza, Przygotowanie dwukrawędziowePersonna74-0002wielu producentów / dostawców.  UWAGA: Sharp
Cell Freezing MediaSigma-AldrichC6295-50MLDMSO, wirówka bez surowicy
, wiadro wahadłowe z wkładkami 15 mlEppendorf5810 Rwielu producentów/dostawców
Probówki stożkowe, 15 mlFisherbrandS50712wielu producentów / dostawców
Probówki stożkowe, 50 mlBD Falcon352074wielu producentów/ dostawcy
Strugarkado zamrażarek o kontrolowanej szybkościKryo 750wielu producentów/dostawców
Kriowiale 2 mlCorning430488wielu producentów/dostawców
Kolba hodowlana, wentylowana, T12.5BD Falcon353107wielu producentów/dostawców
Kolba hodowlana, wentylowana, T25BD Falcon353081wielu producentów/dostawców
Kolba hodowlana, wentylowana, T175BD Falcon353045wielu producentów/dostawców
Kolba hodowlana, wentylowana, T75 BD Falcon353110wielu producentów/dostawców
Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 1 LMilliporeSCGPU11REwielu producentów/dostawców
Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 150 mlMilliporeSCGVU01REwielu producentów/dostawców
Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 500 mlMilliporeSCGPU05REwielu producentów/dostawców
Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 50 mlMilliporeSCGP00525wielu producentów/dostawców
Bibuła filtracyjna, koła 8,5 cmWhatman/GE1001-085
, wzór standardowy - ząbkowane/zakrzywione/18 cmFine Science Tools11001-18
Komora zamrażania, alkohol izopropylowyNalgene5100-0001"Mr. Frosty"
Inkubator, 37 & C/5% CO2Forma370 serieswielu producentów/dostawców
Hemacytometr, fazaHausser Scientific1475wielu producentów/dostawców
McIlwain Tissue ChopperLafayette InstrumentsTC752-PD  Wymagana modyfikacja szalki Petriego.    UWAGA:  Ruchome, ostre ostrze.
Mikropipettor, 1-10 μ lGilsonF144562wielu producentów / dostawców
Mikropipettor, 100-1,000 μ l (zestaw startowy)GilsonF167700wielu producentów / dostawców
Mikropipettor, 2-20 i mu; l (zestaw startowy)GilsonF167700wielu producentów / dostawców
Mikropipettor, 20-200 μ l (zestaw startowy)GilsonF167700wielu producentów / dostawców
Kluczokręt, autoklawowalny, 5/16"Steritool10302
Pasteur Pipety, zaślepione bawełnąFisherbrand13-678-8Bwielu producentów / dostawców
szalka Petriego, szkło, autoklawowalneCorning3160-100
Pomoc do pipetDrummond4-000-101wielu producentów/dostawców
Podkładka regulacyjnaMcMaster-CarrVARIABLEwielu producentów/dostawców
Sterylne końcówki do pipet barierowych, 10 μ lAvantGuardAV10R-Hwielu producentów / dostawców
Sterylne końcówki do pipet barierowych, 1,000 μ lAvantGuardAV1000wielu producentów / dostawców
Sterylne końcówki do pipet barierowych, 20 i mu; lAvantGuardAV20-Hwielu producentów / dostawców
Sterylne końcówki do pipet barierowych, 200 i mu; lAvantGuardAV200-Hwielu producentów/dostawców
Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 10 mlFisherbrand13-676-10Jwielu producentów/dostawców
Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 2 mlFisherbrand13-675-3Cwielu producentów/dostawców
Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 25 mlFisherbrand13-676-10Kwielu producentów/dostawców
Sterylne Pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 5 mlFisherbrand13-676-10Hwielu producentów / dostawców
Woreczki do sterylizacji, 19 x 33 cmCrosstexSCLwielu producentów/dostawców
Sitko, 40 i mikro; mBD Falcon352340
Naczynia do hodowli tkankowych, 60 mmStojaki351007
, blokujące czterokierunkoweFisherbrand03-448-17
Kąpiel wodnaFisherbrandS52602Qwielu producentów / dostawców
Progenitor neuronalny Odczynniki
Nerwowe komórki macierzyste Podłoże ekspandacyjne (Stemline)Sigma-AldrichS3194-500MLWażne jest, aby używać marki Stemline
Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)MilliporeGF316wielu producentów / dostawców
Rekombinowany czynnik hamujący białaczkę ludzką (LIF)MilliporeLIF1010wielu producentów / dostawców
Błękit trypanowy (0,4%)Sigma-AldrichT8154-100MLwielu producentów / dostawców
TrypLE Select (1x)Life Technologies12563-011
Kleszcze na probówki BD Falcon do przetwarzania specyficzne dla komórek

Bibliografia

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. , 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. , 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. , 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45 (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. , (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. , 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

Tagi

neurony macierzystetechnika siekaniahodowla neurosferpasa owanie mechanicznezgodno z cGMPkontakt mi dzykom rkowyhodowle zawiesinoweautomatyczna dysocjacjaekspansja sferoid w
Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.