Artykuł metodologiczny

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

DOI:

10.3791/51219

⸱

15 czerwca 2014

 ,  , 
1Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika ekspansji komórek w celu zgromadzenia dużej liczby komórek z pojedynczej próbki do eksperymentów badawczych i prób klinicznych byłaby bardzo korzystna dla społeczności komórek macierzystych. Wiele obecnych metod ekspansji jest pracochłonnych i kosztownych, a te obejmujące całkowitą dysocjację mogą powodować różnicowanie lub wczesne starzenie się kilku typów komórek macierzystych i progenitorowych. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy zautomatyzowaną metodę mechanicznego pasażowania, zwaną "siekaniem", która jest prosta i niedroga. Technika ta pozwala uniknąć chemicznej lub enzymatycznej dysocjacji na pojedyncze komórki, a zamiast tego pozwala na ekspansję na dużą skalę zawieszonych, sferoidalnych kultur, które utrzymują stały kontakt komórka/komórka. Metoda siekania była stosowana głównie w przypadku płodowych nerwowych komórek progenitorowych lub neurosfer pochodzących z mózgu, a ostatnio została opublikowana do stosowania z nerwowymi komórkami macierzystymi pochodzącymi z embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Procedura polega na wysiewie neurosfer na szalce Petriego w kulturze tkankowej, a następnie przepuszczeniu ostrego, sterylnego ostrza przez komórki, skutecznie automatyzując żmudny proces ręcznej mechanicznej dysocjacji każdej kuli. Zawieszenie komórek w hodowli zapewnia korzystny stosunek powierzchni do objętości; ponieważ ponad 500 000 komórek może być hodowanych w jednej neurosferze o średnicy mniejszej niż 0,5 mm. W jednej kolbie T175 ponad 50 milionów komórek może rosnąć w kulturach zawiesinowych, w porównaniu do zaledwie 15 milionów w kulturach przylegających. Co ważne, procedura rozdrabniania została zastosowana zgodnie z obecną dobrą praktyką produkcyjną (cGMP), co pozwala na masową produkcję produktów komórkowych klasy klinicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje długa historia ekspansji nerwowych komórek macierzystych gryzoni w hodowli jako monowarstwa1-3 lub zagregowane neurosfery4-7. Ponadto ludzkie neuronalne komórki progenitorowe (hNPC) wyizolowane z różnych regionów rozwijającego się ośrodkowego układu nerwowego8-17 zostały namnażone in vitro. Komórki te są bipotencjalne, zdolne do różnicowania się zarówno w astrocyty, jak i neurony, i są bardzo przydatnym narzędziem w badaniu rozwoju neuronalnego18,19 i mechanizmu choroby20,21. hNPC zostały również przeszczepione do wielu różnych modeli zwierzęcych choroby ośrodkowego układu nerwowego o różnym poziomie integracji, przeżycia i efektów funkcjonalnych22-24.

Tradycyjnie, NPC pochodzące od gryzoni lub ludzkich płodów są narażone na czynniki wzrostu - często naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) i/lub czynnik wzrostu fibroblastów-2 (FGF-2)25-28 - i zarówno przylegające29, jak i trójwymiarowe systemy sferoidalne są zazwyczaj pasażowane za pomocą dysocjacji enzymatycznej do zawiesiny jednokomórkowej30-34. Standardową metodą namnażania komórek do celów badawczych lub klinicznych jest adherentna monowarstwa ze względu na łatwą manipulację. Wykazaliśmy jednak, że pasażowanie jednowarstwowych i neurosferycznych hNPC z roztworami enzymatycznymi lub chemicznymi powodowało wczesne starzenie się35. Ponadto dysocjacja enzymatyczna może powodować zwiększony poziom różnicowania i nieprawidłowości kariotypowe na podstawie danych wykazanych na embrionalnych komórkach macierzystych36-38. Chociaż standardowa metoda pasażowania hNPC pozwoliła na opracowanie aktualnych produktów klasy dobrej praktyki wytwarzania (cGMP), które przeszły do badań klinicznych fazy 1 (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), metoda ta pozwoliła tylko na kilka rund amplifikacji komórek, co ograniczyło potencjał bankowania.

Oczywiście, duże eksperymenty badawcze i przyszłe próby kliniczne mogłyby skorzystać z możliwości masowego rozmnażania komórek i opóźnionego starzenia, co pozwoliłoby na wzrost na dużą skalę i bankowanie komórek. Aby odpowiedzieć na tę potrzebę, opracowaliśmy nowatorski i zautomatyzowany sposób mechanicznego przechodzenia nienaruszonych neurosfer poprzez "krojenie" ich na małe skupiska w celu utrzymania kontaktu między komórkami. Metoda ta znacznie wydłużyła ich żywotność39 , a hodowla zawiesinowa pozwala na bardziej efektywne wykorzystanie przestrzeni inkubatora w porównaniu z kulturami jednowarstwowymi, co widać w przypadku alternatywnej metody hodowli w bioreaktorze3D 40. Dostarczony protokół siekania pozwala na produkcję dużych banków z jednej próbki płodu większej niż pasaż 10, co jest mało prawdopodobnym wyczynem przy użyciu standardowych metod pasażowania. Chociaż ta metoda pasażowania hNPC jest niekonwencjonalna, zyskuje na popularności i została niedawno opublikowana z innymi typami komórek, takimi jak nerwowe komórki macierzyste pochodzące z ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, umożliwiając ekspansję na dużą skalę do różnych zastosowań, w tym modelowania chorób in vitro 41-46. Co ważne, przy użyciu metody siekania stworzono już bank komórek hNPC klasy cGMP, co pokazuje, że technika ta może być stosowana w przyszłych zastosowaniach klinicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Deklaracja etyczna i bezpieczeństwo

  1. Procedura ta polega na wykorzystaniu produktów hodowli komórkowych pochodzących od ludzi lub zwierząt. Wszystkie pobrane tkanki muszą zostać zatwierdzone przed użyciem przez odpowiednią Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (Instytucjonalne Komisje) Rewizyjne i/lub Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania.
  2. Wszystkie odpady niebezpieczne biologicznie muszą być utylizowane zgodnie z przepisami bezpieczeństwa ustalonymi przez odpowiednią instytucję. Zapoznaj się ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa i utylizacji i postępuj zgodnie z nimi podczas całej tej procedury.

2. Przygotowanie sprzętu, zapasów, odczynników i obserwacji

  1. preparat
    1. Zaopatrz się w szklaną szalkę Petriego, kółka z bibuły filtracyjnej o średnicy 8,5 cm i ostrza do przygotowywania z podwójną krawędzią.
    2. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej na szalce Petriego i przenieś kilka nieosłoniętych ostrzy na bibułę filtracyjną na szalce Petriego.
    3. Kilkakrotnie układaj bibułę filtracyjną i ostrza, aż szalka Petriego będzie wypełniona w około 75%, przykryj pokrywką szalki Petriego i autoklawem. Przechowywać w sterylnym lub zamkniętym środowisku w celu zachowania sterylności.
    4. Autoklaw: kleszczyki 18 cm i nakrętko-wkrętak do sterylizacji w autoklawie, w woreczku do sterylizacji. W celu produkcji cGMP należy sterylizować w autoklawie kilka krążków podkładkowych ze stali nierdzewnej w woreczkach do sterylizacji. Aby uzyskać więcej informacji na temat podkładki regulacyjnej, zobacz krok 3.5.
    5. Zdezynfekuj komorę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) 70% alkoholem izopropylowym (IPA).
    6. Wszystkie zabiegi muszą być wykonywane w BSC, aby zachować sterylność. Do BSC należy przenieść w sposób aseptyczny następujące elementy:
      1. Rozdrabniacz tkanek McIlwaina (rozdrabniacz). Przetrzyj wszystkie powierzchnie 70% IPA, zwłaszcza ramię rozdrabniacza (Rysunek 1B). W razie potrzeby cały rozdrabniacz można odkazić za pomocą tlenku etylenu.
      2. Jeden autoklawizowany klucz nasadowy lub klucz do nakrętek (w zestawie z rozdrabniaczem, Rysunek 1I), jeden szczypiec 18 cm, jeden zestaw mikropipetorów o standardowych rozmiarach (20 μl-1 000 μl), jeden stojak na pipety i probówki.
      3. Sterylne jednorazowe pipety serologiczne, barierowe końcówki do pipet, probówki stożkowe o pojemności 15 ml, szalki Petriego o średnicy 60 mm, ostrza z podwójną krawędzią i kolby T o odpowiedniej wielkości. UWAGA: Ostrych ostrzy należy obchodzić wyłącznie kleszczami.
  2. Odczynniki
    1. Ekspandować hNPC w pożywce podtrzymującej (MM) składającej się z pożywki do eksplandowania nerwowych komórek macierzystych, EGF w stężeniu 100 ng/ml i czynnika hamującego białaczkę (LIF) w stężeniu 10 ng/ml. Przenieść odczynniki i urządzenia filtracyjne wymagane do przygotowania pożywki do BSC.
    2. Ponownie zawiesić liofilizowany EGF za pomocą pożywki do ekspansji neuronalnych komórek macierzystych i przygotować porcje w stężeniu 100 μg/ml do przechowywania w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku. LIF jest przechowywany w takiej postaci, w jakiej został zakupiony, w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy lub do daty ważności podanej przez producenta.
    3. Przenieść odczynniki MM do BSC. Połącz wszystkie odczynniki w urządzeniu filtrującym o odpowiedniej wielkości i przefiltruj za pomocą aparatu próżniowego. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni.
  3. Obserwacje hNPC
    1. Dwa najważniejsze czynniki, na które należy zwrócić uwagę przed siekaniem, to średnica kuli i kondycjonowanie podłoża lub kolor. Pożywka kondycjonowana (CM) jest definiowana jako pożywka, która została zmetabolizowana przez hNPC w hodowli w warunkach inkubatora (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności). Gdy komórki metabolizują pożywkę, składnik czerwieni fenolowej zmieni kolor z różowego na żółty, co oznacza bardziej kwaśne środowisko (ryc. 5D).
    2. Trzymaj kolby (kolby) hNPC pod światło, aby odnieść się do koloru podłoża (zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje).
    3. Przeskanuj kolbę za pomocą mikroskopu, aby obserwować komórki. Użyj siatki, aby zbadać rozmiar kuli. Jeśli wiele kulek ma średnicę 300 μm lub większą, kontynuuj proces siekania. Siekaj komórki co 7-10 dni.
    4. Jeśli chop nie jest uzasadniony, wymieniaj 25-75% CM na świeże podłoże co 3-4 dni, w zależności od tego, jak szybko komórki metabolizują pożywkę. Kontynuuj wymianę mediów, aż kule będą wystarczająco duże, aby przejść.
    5. hNPC są zazwyczaj siekane w stosunku 1:2, z mniejszych kolb do większych. Tabelę 1 należy wykorzystać jako przewodnik referencyjny dla zaleceń dotyczących rozmiaru i objętości kolby.
TGL TGL TGL
kolbaObjętość wszystkich nośnikówWstępne siekanie→Po siekaniu
1 Zobacz materiał T12.5Pojemność 5 ml1 Zobacz materiał T12.5→1 szt. T25
1 szt. T25Pojemność 10 ml1 szt. T25→1 szt. T75
1 szt. T75Pojemność 20 ml1 szt. T75→1 Zobacz materiał T175
1 Zobacz materiał T175Pojemność 40 ml1 Zobacz materiał T175→2 czołgi T175
2 czołgi T175Pojemność 80 ml2 czołgi T175 *→4 czołgi T175
* 2 T175s to maksymalna liczba kolb, które można posiekać na raz. Rozdrobnij w zestawach po 2 T175 i przejdź do kroku 7.

Tabela 1.Paradygmat ekspansji hNPC. Opis typowego schematu rozbudowy dla hNPC. Standardem jest dwukrotna ekspansja objętościowa co 7-10 dni.

3. Konfiguracja śmigłowca

figure-protocol-1
Rysunek 1. Rozdrabniacz tkanek McIlwaina. A) Mikrometr regulacji grubości siekania, B) Podstawa ramienia rozdrabniacza i dołączone ramię, C) Haczyk na uchwycie talerza na szalkę Petriego, D) Pokrętło zwalniające stół i taca, E) Pokrętło regulacji siły ostrza, F) Przełącznik resetowania, G) Uchwyt na płytkę, H) Mocowanie do ostrza, zapięcia i nakrętki, I) Klucz do nakrętek w zestawie z rozdrabniaczem, J) Nakrętka ostrza/zatrzasku, K) Zapięcie ostrza, L) Pokrętło automatycznej regulacji prędkości siekania, M) Pokrętło obsługi ręcznego ramienia tnącego, N) Włącznik zasilania.

  1. Podłącz rozdrabniacz do gniazdka w BSC i włącz wyłącznik zasilania (Rysunek 1N). Ustaw odległość cięcia na 200 μm (Rysunek 1A). Ustaw siłę ostrza na 270° lub 9:00, jeśli pokrętło było zegarem (Rysunek 1E). Upewnij się, że pokrętło automatycznej prędkości jest obrócone tak daleko, jak to możliwe w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. (Rysunek 1L).
  2. Przesuń zwalniacz stołu maksymalnie w prawo, upewniając się, że uchwyt płyty jest stabilny (Rysunek 1D).
  3. Obróć manipulator ramienia ręcznego zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby podnieść ramię do maksymalnego poziomu (Rysunek 1M). Manipulator ramienia ręcznego można obracać wyłącznie zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
  4. Przeprowadzić aseptycznie sterylne, obosieczne ostrze do siekania na ramienia rozdrabniacza za pomocą kleszczy (Rysunek 1H).
  5. Wykonaj ten krok tylko w przypadku pasażowania cGMP, ponieważ sama szalka Petriego jest wystarczająca do przetwarzania na poziomie badawczym. Jak zauważono w kroku 2.1.4, do cGMP wymagane są podkładki hamulcowe umieszczone wewnątrz podstawy szalki Petriego. Tarcza podkładki regulacyjnej zapobiega przedostawaniu się odłamków tworzywa sztucznego do kulek podczas procesu siekania. Dla każdego planowanego kotleta przenieś jedną tarczę podkładki na dno każdej szalki Petriego i przykryj.
  6. W aseptyki umieść zapięcie (Rysunek 1K) na ostrzu za pomocą kleszczy. Zakrzywiona część zapięcia musi znajdować się nad górną krawędzią ramienia. Zapięcie nie pozostanie na ramieniu, dopóki nakrętka nie zostanie bezpiecznie ukształtowana. Użyj kleszczyków, aby przytrzymać zatrzask na ramieniu i przymocuj nakrętkę (Rysunek 1J) do za pomocą sterylnego klucza do nakrętek. Pozostaw nakrętkę luźną o 1/4 obrotu.

4. Procedura przed siekaniem

  1. Przenieść sugerowaną objętość MM do nowej kolby (kolb) zgodnie z tabelą 2, kolumna C.
  2. Przeprowadzić aseptycznie przenieść komórki z inkubatora do BSC. Oprzyj kolbę (kolby) na stojaku na probówki (Rysunek 2A) i pozwól kulkom osiąść w kolbie (kolbach).
  3. Po ustabilizowaniu się, odessać do 12 ml supernatantu za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml lub 10 ml i wypłukać wszystkie luźno przylegające kulki z powierzchni kolby. Powtórz w razie potrzeby i osadź kulki między płukaniami.
  4. Przenieść sugerowaną objętość CM do nowej kolby (kolb) zgodnie z tabelą 2 w kolumnie D. W przypadku przechodzenia przez dwie lub więcej kolb T175, patrz krok 7.1.
  5. Przenieś wszystkie pozostałe CM i kulki do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pozwolić, aby kulki opadły i wyrzucić zużytą kolbę (kolby).
  6. Krok krytyczny: Powoli przenieś kulki z probówki stożkowej o pojemności 15 ml na szalkę Petriego o średnicy 60 mm lub krążek podkładkowy w najmniejszej możliwej objętości; zalecane jest 0,1-0,5 ml (rysunek 2B). Zachowaj pozostałą objętość CM, ponieważ zostanie ona wykorzystana do wypłukania komórek z naczynia po posiekaniu . Staraj się zminimalizować powierzchnię pokrytą przez media i kulki na naczyniu (Rysunek 2C).

figure-protocol-2
Rysunek 2. Przygotowanie kuli do siekania. A) Oprzyj kolbę (kolby) o stojak na probówki lub podobny przedmiot, aby osadzić kulki w rogu kolby. B) Przenieść kulki tak gęsto, jak to możliwe, z rurki stożkowej na szalkę Petriego. C) Połącz kulki ze stożkowej rurki w środku szalki Petriego. D) Usuń jak najwięcej supernatantu z górnej części połączonych kul. E) Rozłóż kulki za pomocą plastikowej końcówki do mikropipety. F) Delikatnie przesuń kulki na jedną stronę basenu. G) Przykład sfer, które zostały przesunięte na jedną stronę basenu w celu ułatwienia usuwania nośników. H) Skondensowane kulki rozłożone na szalce Petriego, gotowe do siekania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większy obraz.

  1. Następnie kulki muszą zostać zagęszczone poprzez usunięcie supernatantu przeniesionego w kroku 4.6. Przenieść supernatant z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą mikropipetora z barierą aerozolową (rysunek 2D), unikając usuwania kulek. Zacznij od usunięcia jak największej ilości nośnika z górnej części puli nośników/komórek. Jeśli nie jest możliwe usunięcie nośnika bez kulek, przejdź do następnego kroku.
TGL
Kolumna AKolumna BKolumna CKolumna DKolumna EKolumna F
Rozmiar kolby do wstępnego siekania→Rozmiar kolby po rozdrobnieniuSugerowana objętość MM do przeniesienia do nowej kolby (kolb) wstępnie rozdrobnionejSugerowana objętość CM do przeniesienia do nowej kolby (kolb) do wstępnego rozdrobnieniaSugerowana objętość kulek/pożywki do przeniesienia do nowej kolby (kolb) po rozdrobnieniuKońcowa objętość wysiewana/kolba
T12.5→Zobacz materiał T25Pojemność 5 mlIlość 0 mlPojemność 5 mlPojemność 10 ml
Zobacz materiał T25→Zobacz materiał T75Pojemność 10 ml Ilość 0 mlPojemność 10 mlPojemność 20 ml
Zobacz materiał T75→Zobacz materiał T175Pojemność 20 mlPojemność 10 mlPojemność 10 mlPojemność 40 ml
1 Zobacz materiał T175→2 czołgi T17520 ml na kolbę15 ml na kolbę5 ml na kolbęPojemność 40 ml
2 czołgi T75→4 czołgi T17520 ml na kolbę17,5 ml na kolbę2,5 ml na kolbęPojemność 40 ml

Tabela 2. Przewodnik po przenoszeniu nośników przed/po siekaniu. Sugerowane objętości do użycia podczas procesu siekania.

  1. Rozłóż pulę, używając boku końcówki pipety, aby zwiększyć powierzchnię (Rysunek 2E).
  2. Krok krytyczny: Przechyl szalkę Petriego lekko do siebie i użyj boku końcówki pipety, aby delikatnie przesunąć wszystkie kulki na jedną stronę basenu (Rysunek 2F, G).
  3. Krok krytyczny: Gdy wszystkie komórki zostaną przeniesione, powoli przechyl szalkę Petriego w przeciwnym kierunku. Podczas tego procesu same media będą odpływać z kul. Przenieść pożywkę z powrotem do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dopuszczalne jest minimalne usuwanie kuli.
  4. Użyj boku końcówki pipety, aby delikatnie przesunąć wszystkie kulki z powrotem do środka szalki Petriego, tak aby kałuża miała średnicę 0,5-2,4 cm (Rysunek 2H). Ważne jest, aby głębokość basenu kulowego była płytka. Jeśli basen jest zbyt głęboki, kule zostaną po prostu zepchnięte na bok podczas siekania. UWAGA: Średnica puli kuli nie może być większa niż 2.5 cm, w przeciwnym razie ostrze będzie stykać się z krawędziami szalki Petriego, omijając komórki.

5. Procedura siekania

  1. Przenieś szalkę Petriego na uchwyt talerza (Rysunek 1G) i upewnij się, że szalka jest zamocowana pod haczykami uchwytu talerza (Rysunek 1C).
  2. Pokrętło zwalniające stół posiada nacięcia, w których będzie pasować do biegu. Użyj pokrętła zwalniającego stół, aby przesunąć uchwyt płyty w lewo, tak aby ostrze znalazło się z dala od kulek i zostało zablokowane w biegu (Rysunek 1D).
  3. Krok krytyczny: Opuść ramię rozdrabniacza, obracając pokrętło manipulatora ręcznego (Rysunek 1M) zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aż ostrze zatrzaśnie się płasko na szalce Petriego. Jedną ręką dociśnij uchwyt ramienia (Rysunek 1B), jednocześnie dokręcając nakrętkę za pomocą klucza.
  4. Naciśnij raz przycisk resetowania (Rysunek 1F). Ustabilizuj szalkę Petriego jedną ręką, obracając pokrętło manipulatora ramienia automatycznego (Rysunek 1L) zgodnie z ruchem wskazówek zegara do pozycji 90° lub 12:00, jeśli pokrętło było zegarem. UWAGA: Trzymaj palce z dala od poruszającego się ostrza przez cały czas.
  5. Przełóż ostrze całkowicie przez kałużę kul. Obróć uchwyt płyty o 90°.
  6. Poluzuj i powtórz krok 5.3-5.5.
  7. Przeprowadzić w sposób aseptyczny szalkę Petriego z uchwytu płytki do przestrzeni roboczej w BSC.

6. Procedura po rozdrobnieniu

  1. Zalać 10 ml pipetą serologiczną z CM w stożkowej probówce z kroku 4.6, a następnie przenieść 1 ml na rozdrobnione kulki. Delikatnie zawiesić ponownie i przenieść do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Unikaj bąbelków i powtarzaj tyle razy, ile to konieczne, aby zebrać posiekane kulki.
    WSKAZÓWKA: Zminimalizuj skrobanie naczynia, ponieważ fragmenty plastiku mogą się oderwać. Nie stanowi to problemu w przypadku korzystania z tarcz regulacyjnych ze stali nierdzewnej. Należy uważać na komórki przyczepiające się do wnętrza plastikowej pipety serologicznej. W takim przypadku należy okresowo odsysać pęcherzyki przez pożywkę w pipecie, aby odłączyć komórki.
  2. Zmierz objętość CM i posiekanych kulek. Dodać odpowiednią objętość MM, aby uzyskać objętość wymienioną w tabeli 2, kolumna E.
  3. Rozerć kule 2-3x, aby rozbić luźno połączone kule.
  4. Krok krytyczny: Podwielokrotnić zawiesinę kulki do każdej nowej kolby. Przenoś zawiesinę kulki tylko do jednej kolby na raz i ponownie zawieszaj kulki między transferami. Podawanie wielu kolb na raz powoduje nieproporcjonalną liczbę kulek w każdej kolbie. Końcowa objętość w każdej kolbie powinna być równa objętościom w tabeli 2 w kolumnie F. Patrz krok 7.2 w przypadku wysiewu większych niż dwie kolby T175.
  5. Odkręć nakrętkę za pomocą klucza nasadowego, a następnie zapięcie za pomocą sterylnych kleszczyków. Odpowiednio odkazić za pomocą 70% IPA lub równoważnego. UWAGA: Zużyte ostrze do siekania należy wyjmować wyłącznie kleszczami i wyrzucać do pojemnika na ostre przedmioty stanowiące zagrożenie biologiczne.
  6. Odkaż wszystkie powierzchnie rozdrabniacza za pomocą 70% IPA.

7. Wariacje procesu – wiele kolb

Istnieje kilka różnic podczas przechodzenia więcej niż dwóch T175. Poniższe kroki są zmianami w kroku, do którego się odwołuje.

  1. Odniesienia do kroku 4.4:
    1. Podczas przechodzenia dwóch T175 połącz wszystkie media i kule w jedną kolbę T175. Pozwolić, aby kulki się osiądły, a następnie wsypać odpowiednią objętość CM do każdej z nowych kolb, jak podano w tabeli 2, kolumna D. Przejdź do kroku 4.5.
    2. W przypadku przechodzenia większej niż dwie kolby T175 należy zaopatrzyć się w nową kolbę T175 i oznaczyć ją jako kolbę CM. Wykonać krok 7.1.1, ale przenieść CM do kolby CM. Kolbę należy przechowywać z boku BSC, która ma być użyta do zebrania CM ze wszystkich kolb, aż wszystkie kolby zostaną posiekane. Następnie CM zostanie równo podzielony na każdą z nowych kolb.
  2. Krok referencyjny 6.4 – Podczas wielokrotnego siekania tej samej linii komórkowej, przenieś zawiesinę rozdrobnionej kulki do nowej kolby T75 oznaczonej kulkami po rozdrobnieniu i zapisz przeniesioną objętość. Kontynuować łączenie komórek w tej kolbie po każdym rozdrobnieniu i przechowywać kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności 95%. Po zakończeniu wszystkich siekań, porcjować objętość zawiesiny kulki do każdej nowej kolby. Przejdź do kroku 6.5.

8. Kriokonserwacja

Następujący protokół służy do kriogenicznego przechowywania hNPC.

  1. Rozmrozić pożywkę do zamrażania komórek w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, a następnie przechowywać na lodzie. Pożywkę do zamrażania komórek można porcjować i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Polerowanie szkła ogniowego Pipety Pasteura poprzez obracanie otworu pipety w płomieniu. Przygotuj co najmniej dwie duże i dwie polerowane ogniowo pipety o małym otworze (Rysunek 3). Kule zostaną rozdzielone poprzez przejście z pipet o dużych otworach na małe otwory.
  3. Umieść TrypLE Select w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut. Wyjmij i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.

figure-protocol-3
Rysunek 3. Pipety Pasteura do polerowania ogniowego. A) Przytrzymaj pipetę w górnej części płomienia i obracaj, aby równomiernie zaokrąglić krawędzie szklanej pipety. B) Przykład pipety ze szkła polerowanego ogniowo o dużej średnicy. C) Przykład pipety ze szkła polerowanego ogniowo o małym otworze.

  1. Aseptycznie przenieś neurosfery do BSC. Pozwolić, aby kulki opadły, opierając kolbę (kolby) o stojak na probówki i przepłukać dno kolby, aby usunąć wszelkie luźno przylegające kulki. Pozwól kulom ponownie się osiąść.
  2. Przenieś wszystko oprócz 5-10 ml CM do sterylnej butelki i zmierz całkowitą objętość. Umieść pozostałe kulki i media w stożkowej probówce.
  3. Po ustabilizowaniu się wszystkich komórek przenieś wszystkie oprócz małego menisku CM do butelki i zsumuj objętość.
  4. Przenieść aseptycznie 5-10 ml podgrzanego TrypLE Select do stożkowej probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy. Przenieść rurkę stożkową do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 15-20 minut. Po 7,5-10 minutach delikatnie wstrząsnąć rurką stożkową do wymieszania.
  5. Użyj zmierzonej objętości CM z kroku 8.5 i przygotuj równą objętość MM. Połącz i przefiltruj 50% roztwór CM i 50% MM (roztwór CM/MM).
  6. Przeprowadzić w asepcie sitko o pojemności 40 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  7. Po zakończeniu inkubacji obracać stożkowe probówki o pojemności 15 ml przez 15 sekund przy 100 x g.
  8. Ostrożnie zassać i wyrzucić TrypLE Select oraz wszelkie żylaste podłoże. Zostaw małą łąkotkę. Delikatnie dodaj 2 – 4 ml CM/MM, aby rozcieńczyć pozostały TrypLE Select, nie naruszając przy tym granulatu. Pozwól, aby wszelkie usunięte komórki ponownie się uspokoiły przed wyrzuceniem prania.
  9. Dodać 2-5 ml roztworu CM/MM do kulek probówki. Oddzielić kulki za pomocą pipety o pojemności 5 ml, rozcierając maksymalnie 10 razy. Pozwól nierozdzielonym kulom osiąść na 1-2 minuty. Przenieś zdysocjowaną zawiesinę komórek na sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć całkowicie niezdysocjowane klastry.
  10. Powtórzyć krok 8.12 z polerowaną ogniowo szklaną pipetą o dużej średnicy, a następnie pipetą szklaną o małej średnicy.
  11. Przepłukać sitko 2-5 ml roztworu CM/MM.
  12. Wymieszać zawiesinę komórek i usunąć próbki do analizy żywotności.
  13. Rozcieńczyć próbki błękitem trypanowym przy odpowiednim współczynniku rozcieńczenia i policzyć. Użyj poniższego standardowego równania, aby obliczyć średnie stężenie komórek żywotnych i obliczyć całkowitą liczbę komórek żywotnych.
    figure-protocol-4
  14. Obliczyć całkowitą objętość pożywki do zamrażania komórek wymaganą do ponownego zawieszenia komórek przy 5,0 x 106 komórek/ml. 1 ml komórek zostanie wysiew do każdego kriowialu. Przenieś kriowiale do BSC.
  15. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml w celu uzyskania najlepszej wydajności. Jeśli do zamrożenia na dużą skalę używa się probówek stożkowych o pojemności 50 ml, zwiększ szybkość i czas do 400 x g przez 10 minut.
  16. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki do zamrażania komórek o stężeniu 5,0 x 106 komórek/ml. Podwielokrotność 1 ml zawiesiny komórek do każdego kriowialu. W celu równomiernego rozprowadzenia należy odessać 6 ml zawiesiny i podać 5 kriowialiów x 1 ml. Przenieść pozostały 1 ml zawiesiny z powrotem do puli komórek. Powtarzać tę czynność, aż wszystkie fiolki zostaną napełnione.
  17. Aseptyczne zamknięcie wszystkich zasianych kriowiali i przeniesienie ich na lód na 5-10 minut.
  18. Użyj jednego z poniższych narzędzi do strategii kriokonserwacji, aby zachować hNPC:Komora na alkohol izopropylowy
    1. Napełnij wymaganą liczbę komór 100% IPA w temperaturze pokojowej.
    2. Przenieś zasiane kriowiale z lodu do komory (komór) i przenieś komorę (komory) do zamrażarki o temperaturze -80 °C na noc. Komórki są stabilne przez okres do jednego tygodnia w temperaturze -80 °C, jednak sugeruje się przeniesienie fiolek do długotrwałego przechowywania ciekłym azotem następnego dnia.
      Zamrażarka z kontrolowaną szybkością
    3. Prześlij odpowiedni program zamrażania do oprogramowania zamrażarki z kontrolowaną szybkością. Przykładowy program znajduje się w tabeli 3. Rysunek 4 przedstawia typową krzywą zamarzania dla hNPC. Jednak dokładny program będzie się różnić dla każdego modelu zamrażarki. Standardowa ogólna częstotliwość pobierania próbek powinna być bliska -1 °C/min aż do osiągnięcia -40 °C, przy czym szybkość zamrażania może być znacznie zwiększona do co najmniej -80 °C.
Rozdział Rozdział okrążeń Rozdział Rozdział Rozdział szt. Rozdział szt.
krokSzybkość (°C)Temperatura końcowa (°C)Przytrzymanie (min s)spust
1----5 min 0 sekizba
cyfra arabska- 1.3- 5--próbka
3----1 min 0 sekizba
4- 45- 58--izba
5+ 10- 26--izba
6+ 3- 23--izba
7- 0,8- 40--próbka
8- 10- 100--izba
9- 35- 160--izba

Tabela 3. Kroki zamrażania hNPC w zamrażarce o kontrolowanej szybkości. Sugerowany program do kriokonserwacji hNPC w zamrażarce o kontrolowanej szybkości.

figure-protocol-5
Rysunek 4. Krzywa zamarzania próbki. Typowa krzywa zamarzania dla hNPC na zamrażarce o kontrolowanej szybkości.

  1. Przenieś kriowiale z lodu do koszy związanych z zamrażarką z kontrolną szybkością. Upewnij się, że załadowałeś jeden kriowial tylko z pożywką do zamrażania komórek, która ma być używana do sample sonda temperatury. Przenieś kosze do komory zamrażania i umieść sondę do pobierania próbek w fiolce z sondą. Uruchom program.
  2. Po zakończeniu protokołu przenieś fiolki do długotrwałego przechowywania ciekłego azotu.

9. Procedura rozmrażania

Następujący protokół służy do rozmrażania kriogenicznie zakonserwowanych hNPC.

  1. Przenieść kriowiale z magazynu ciekłego azotu natychmiast na suchy lód. UWAGA: Fiolki mogą mieć pęknięcia lub luźne pokrywki, które umożliwiają przedostanie się ciekłego azotu do fiolki. Po wyjęciu z warunków głębokiego zamrażania płyn może się zagotować, natychmiast eksplodując fiolkę. Podczas wyjmowania fiolek należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej.
  2. Przygotuj wszystkie poniższe odczynniki i materiały z wyprzedzeniem. Po rozpoczęciu procesu rozmrażania bardzo ważne jest, aby skutecznie go przeprowadzić.
    1. Przenieść pożywkę do ekspandowania nerwowych komórek macierzystych, MM, stożkową probówkę o pojemności 15 ml, jedną pipetę serologiczną o pojemności 2 ml i jedną pipetę serologiczną o pojemności 10 ml dla każdego kriowialu do BSC.
    2. Na każdą fiolkę wymagane jest co najmniej 9 ml pożywki do namnażania neuronalnych komórek macierzystych i 5 ml MM. W razie potrzeby przygotuj więcej każdego podłoża.
  3. Rozmrażaj tylko jedną fiolkę hNPC na raz. Przenieść zamrożone komórki z suchego lodu do czystej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i ciągle mieszać fiolkę w łaźni wodnej. Monitoruj objętość lodu, który się stopił. Gdy w fiolce pozostanie kawałek lodu o długości około 0,5 cm, spryskaj i przetrzyj 70% alkoholem izopropylowym i przenieś do BSC.
  4. Przenieść zawartość kriowialu do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml. Dodać 1 ml pożywki do ekspandowania nerwowych komórek macierzystych do pustego kriowialu, a następnie przenieść 8 ml pożywki do ekspandowania nerwowych komórek macierzystych na rozmrożone komórki w powolny, kroplowy sposób, delikatnie potrząsając probówką. Ma to na celu zmniejszenie ryzyka wstrząsu osmotycznego.
  5. Przenieść płukanie z kriowialu do 9 ml zawiesiny komórkowej. Przenieść stożkową probówkę na lód i powtórzyć czynności 9.4-9.5 dla wszystkich pozostałych fiolek.
  6. Odwirować stożkowe probówki o masie 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Podczas wirowania należy przygotować odpowiednią liczbę kolb do wysiewu w oparciu o tabelę 4.
Rozdział
# fiolekCałkowita objętość wysiewu (ml)kolba
15T12.5
cyfra arabska10Zobacz materiał T25
315Zobacz materiał T75
420Zobacz materiał T75
525Zobacz materiał T75
6Rozdział 30Zobacz materiał T175
735Zobacz materiał T175
8Rozdział 40Zobacz materiał T175
8 +--Kombinacja kolb

Tabela 4. Rozmiary kolb w zależności od liczby rozmrożonych kriowialiów. Sugerowana objętość i wielkość kolby do wysiewu hNPC po rozmrożeniu.

  1. Ponownie zawiesić i połączyć wszystkie probówki w odpowiedniej objętości MM zgodnie z tabelą 4. Dobrze wymieszać i usunąć próbkę w celu policzenia żywotności. Zobacz kroki 8.15-8.16, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat liczenia. Standardowy zakres wysiewu wynosi od 160 000 do 320 000 komórek/cm2.
  2. Dobrze wymieszać komórki i podzielić je na porcje do kolb. Przenieść kolby do inkubatora o wilgotności 5% CO2/37 °C/95%. Wymieszać kolbę, delikatnie potrząsając w przód i w tył, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
  3. Komórki utworzą kule w ciągu 24-48 godzin. Czasami komórki przylegają do plastikowej powierzchni i tworzą rozkład kolonii przypominający plaster miodu. Jeśli tak się stanie, pozostaw komórki na 3 dni przed spłukaniem komórek, pomagając w tworzeniu kul. Spłukuj co 1-3 dni, aż nie będzie przylegających komórek. W razie potrzeby przenieść komórki do nowej kolby.
  4. Wymieniaj 25-75% pożywki z MM co 3-4 dni, aż komórki będą gotowe do rozdrobnienia, zwykle 7-14 dni po rozmrożeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 5. Dane reprezentatywne. A) Przewidywana liczba komórek hNPC zamrożonych w p19, a następnie rozmrożonych i rozdwojonych jako przylegająca monowarstwa za pomocą dysocjacji enzymatycznej w porównaniu z neurosferami pasażowanymi metodą siekania. Dzień 0 oznacza, kiedy komórki zostały rozmrożone w temperaturze p20. B) R...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neural stem cell isolation process diagram; fetal cortex to cluster passages in media.
Rysunek 6. Schemat siekania. Namnażanie sferoidalnych komórek macierzystych/progenitorowych w hodowli metodą mechanicznego siekania.

Kroki krytyczne

Przegląd paradygmatu ro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Soshanie Svendsen za krytyczną recenzję i redakcję tego raportu. Do tej pracy przyczynili się NIH/NINDS 1U24NS078370-01 i CIRM DR2A-05320.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zlewka, 50 mlFisherbrandFB-100-50wielu producentów/dostawców
Szafa bezpieczeństwa biologicznego, klasa IIBakerSG-603AModel 4 stopy lub 6 stóp.  Zalecany model 6 stóp; wielu producentów/dostawców
Ostrza, Przygotowanie dwukrawędziowePersonna74-0002wielu producentów / dostawców.  UWAGA: Sharp
Cell Freezing MediaSigma-AldrichC6295-50MLDMSO, wirówka bez surowicy
, wiadro wahadłowe z wkładkami 15 mlEppendorf5810 Rwielu producentów/dostawców
Probówki stożkowe, 15 mlFisherbrandS50712wielu producentów / dostawców
Probówki stożkowe, 50 mlBD Falcon352074wielu producentów/ dostawcy
Strugarkado zamrażarek o kontrolowanej szybkościKryo 750wielu producentów/dostawców
Kriowiale 2 mlCorning430488wielu producentów/dostawców
Kolba hodowlana, wentylowana, T12.5BD Falcon353107wielu producentów/dostawców
Kolba hodowlana, wentylowana, T25BD Falcon353081wielu producentów/dostawców
Kolba hodowlana, wentylowana, T175BD Falcon353045wielu producentów/dostawców
Kolba hodowlana, wentylowana, T75 BD Falcon353110wielu producentów/dostawców
Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 1 LMilliporeSCGPU11REwielu producentów/dostawców
Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 150 mlMilliporeSCGVU01REwielu producentów/dostawców
Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 500 mlMilliporeSCGPU05REwielu producentów/dostawców
Filtr, 0,22 i mikro; m, dołączony kubek, 50 mlMilliporeSCGP00525wielu producentów/dostawców
Bibuła filtracyjna, koła 8,5 cmWhatman/GE1001-085
, wzór standardowy - ząbkowane/zakrzywione/18 cmFine Science Tools11001-18
Komora zamrażania, alkohol izopropylowyNalgene5100-0001"Mr. Frosty"
Inkubator, 37 & C/5% CO2Forma370 serieswielu producentów/dostawców
Hemacytometr, fazaHausser Scientific1475wielu producentów/dostawców
McIlwain Tissue ChopperLafayette InstrumentsTC752-PD  Wymagana modyfikacja szalki Petriego.    UWAGA:  Ruchome, ostre ostrze.
Mikropipettor, 1-10 μ lGilsonF144562wielu producentów / dostawców
Mikropipettor, 100-1,000 μ l (zestaw startowy)GilsonF167700wielu producentów / dostawców
Mikropipettor, 2-20 i mu; l (zestaw startowy)GilsonF167700wielu producentów / dostawców
Mikropipettor, 20-200 μ l (zestaw startowy)GilsonF167700wielu producentów / dostawców
Kluczokręt, autoklawowalny, 5/16"Steritool10302
Pasteur Pipety, zaślepione bawełnąFisherbrand13-678-8Bwielu producentów / dostawców
szalka Petriego, szkło, autoklawowalneCorning3160-100
Pomoc do pipetDrummond4-000-101wielu producentów/dostawców
Podkładka regulacyjnaMcMaster-CarrVARIABLEwielu producentów/dostawców
Sterylne końcówki do pipet barierowych, 10 μ lAvantGuardAV10R-Hwielu producentów / dostawców
Sterylne końcówki do pipet barierowych, 1,000 μ lAvantGuardAV1000wielu producentów / dostawców
Sterylne końcówki do pipet barierowych, 20 i mu; lAvantGuardAV20-Hwielu producentów / dostawców
Sterylne końcówki do pipet barierowych, 200 i mu; lAvantGuardAV200-Hwielu producentów/dostawców
Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 10 mlFisherbrand13-676-10Jwielu producentów/dostawców
Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 2 mlFisherbrand13-675-3Cwielu producentów/dostawców
Sterylne pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 25 mlFisherbrand13-676-10Kwielu producentów/dostawców
Sterylne Pipety jednorazowe, folia w całości z tworzywa sztucznego, 5 mlFisherbrand13-676-10Hwielu producentów / dostawców
Woreczki do sterylizacji, 19 x 33 cmCrosstexSCLwielu producentów/dostawców
Sitko, 40 i mikro; mBD Falcon352340
Naczynia do hodowli tkankowych, 60 mmStojaki351007
, blokujące czterokierunkoweFisherbrand03-448-17
Kąpiel wodnaFisherbrandS52602Qwielu producentów / dostawców
Progenitor neuronalny Odczynniki
Nerwowe komórki macierzyste Podłoże ekspandacyjne (Stemline)Sigma-AldrichS3194-500MLWażne jest, aby używać marki Stemline
Rekombinowany ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)MilliporeGF316wielu producentów / dostawców
Rekombinowany czynnik hamujący białaczkę ludzką (LIF)MilliporeLIF1010wielu producentów / dostawców
Błękit trypanowy (0,4%)Sigma-AldrichT8154-100MLwielu producentów / dostawców
TrypLE Select (1x)Life Technologies12563-011
Kleszcze na probówki BD Falcon do przetwarzania specyficzne dla komórek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. , 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. , 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. , 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45 (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. , (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. , 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

Tagi

neurony macierzystetechnika siekaniahodowla neurosferpasa owanie mechanicznezgodno z cGMPkontakt mi dzykom rkowyhodowle zawiesinoweautomatyczna dysocjacjaekspansja sferoid w

Powiązane artykuły