Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

17.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51220

⸱

11 kwietnia 2014

 , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

W tym artykule

Podsumowanie

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Streszczenie

Chromatyna to wysoce dynamiczny kompleks nukleoproteinowy zbudowany z DNA i białek, który kontroluje różne procesy zależne od DNA. Struktura i funkcja chromatyny w określonych regionach jest regulowana przez lokalne wzbogacenie modyfikacji potranslacyjnych histonów (hPTM) i wariantów, białek wiążących chromatynę, w tym czynników transkrypcyjnych, oraz metylacji DNA. Proteomiczna charakterystyka składu chromatyny w różnych regionach funkcjonalnych była do tej pory utrudniona przez brak skutecznych protokołów wzbogacania takich domen w odpowiedniej czystości i ilości do późniejszej dogłębnej analizy za pomocą spektrometrii mas (MS). Opisujemy tutaj nowo zaprojektowaną strategię proteomiki chromatyny, nazwaną ChroP (Chromatin Proteomics), w której preparatywna immunoprecypitacja chromatyny jest stosowana do izolowania odrębnych regionów chromatyny, których cechy, pod względem hPTM, wariantów i współzwiązanych białek niehistonicznych, są analizowane przez MS. Ilustrujemy tutaj ustawienie ChroP do wzbogacania i analizy niemających transkrypcji regionów heterochromatycznych, oznaczonych obecnością trimetylacji lizyny 9 na histonie H3. Uzyskane wyniki pokazują potencjał ChroP w dokładnym charakterystyce proteomu heterochromatyny i udowadniają, że jest to potężna strategia analityczna pozwalająca zrozumieć, w jaki sposób różne białkowe determinanty chromatyny oddziałują i synergizują się w celu ustalenia specyficznych dla locus konfiguracji strukturalnych i funkcjonalnych.

Wprowadzenie

Chromatyna to wysoce dynamiczny kompleks nukleoproteinowy, który jest używany jako główny szablon dla wszystkich procesów zachodzących za pośrednictwem DNA. Nukleosom jest podstawową powtarzaną jednostką chromatyny i składa się z białkowego rdzenia oktamerycznego zawierającego dwie cząsteczki każdego kanonicznego histonu H2A, H2B, H3 i H4, wokół których owinięte jest1,2 pz DNA. Wszystkie histony rdzenia są zbudowane jako domena kulista i elastyczny N-końcowy "ogon", który wystaje na zewnątrz nukleosomu. Jednym z głównych mechanizmów regulacji struktury i dynamiki chromatyny jest oparcie na kowalencyjnych modyfikacjach potranslacyjnych (PTM), które zachodzą głównie na N-końcach histonów3,4. Modyfikacje histonów mogą funkcjonować albo poprzez zmianę struktury chromatyny wyższego rzędu, poprzez zmianę kontaktów między histonami-DNA lub między nukleosomami, a tym samym kontrolowanie dostępności białek wiążących DNA (mechanizmy cis), albo poprzez działanie jako miejsca dokowania dla białek regulatorowych, albo jako pojedyncze jednostki, albo osadzone w kompleksach multimerycznych. Takie białka regulacyjne mogą pełnić swoją funkcję na różne sposoby: poprzez bezpośrednią modulację ekspresji genów (tj. białka TAF) lub poprzez zmianę położenia nukleosomów (tj. kompleksy remodelujące chromatynę) lub poprzez modyfikację innych reszt histonów (tj. białek o aktywności metylotransferazy lub acetylotransferazy) (mechanizmy trans)5. Obserwacja, że różne wzorce PTM grupują się w określonych loci chromatyny, doprowadziła do opracowania hipotezy, że różne modyfikacje w różnych miejscach mogą działać synergicznie, aby wygenerować kod molekularny pośredniczący w stanie funkcjonalnym leżącego u podstaw DNA. "Hipoteza kodu histonowego" zyskała na przestrzeni lat duży konsensus, ale jej eksperymentalna weryfikacja została opóźniona przez ograniczenia techniczne6,7.

Proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) stała się potężnym narzędziem do mapowania wzorców modyfikacji histonów i charakteryzowania białek wiążących chromatynę8. MS wykrywa modyfikację jako właściwą masę Δ między eksperymentalną a teoretyczną masą peptydu. Na poziomie pojedynczych histonów MS zapewnia bezstronną i kompleksową metodę mapowania PTM, pozwalającą na wykrycie nowych modyfikacji i ujawnienie wzajemnych zależności między nimi9-14.

W ostatnich latach opracowano szereg strategii analizowania składu proteomicznego chromatyny, w tym charakterystykę nienaruszonych chromosomów mitotycznych15, identyfikację rozpuszczalnych białek wiążących hPTM16-18 oraz izolację i analizę specyficznych regionów chromatyny (tj. telomerów)19,20. Jednak badanie specyficznych dla locus synergii między histonowymi PTM, wariantami i białkami związanymi z chromatyną jest nadal niekompletne. W tym miejscu opisujemy nowe podejście, nazwane ChroP (Chromatin Proteomics)21, które opracowaliśmy w celu skutecznego scharakteryzowania funkcjonalnie odrębnych domen chromatyny. Podejście to adaptuje immunoprecypitację chromatyny (ChIP), dobrze znany protokół stosowany w badaniach epigenetycznych, do wydajnej analizy proteomicznej wzbogaconej próbki opartej na stwardnieniu rozsianym. Opracowaliśmy dwa różne protokoły, w zależności od rodzaju chromatyny użytej jako dane wejściowe i pytania, na które zwraca uwagę MS; w szczególności: 1) ChIP nieutrwalonej natywnej chromatyny trawionej MNazą jest stosowany do oczyszczania mononukleosomów i do preparacji współasocjujących hPTM (N-ChroP); 2) ChIP usieciowanej chromatyny rozdrobnionej przez sonikację stosuje się w połączeniu ze strategią interaktomiki opartą na SILAC w celu scharakteryzowania wszystkich współwzbogacających białek wiążących chromatynę (X-ChroP). Ilustrujemy tutaj kombinację N- i X-ChroP do wzbogacania i badania heterochromatyny, używając H3K9me3 jako przynęty dla etapów immunoprecypitacji. Zastosowanie ChroP można rozszerzyć o badanie odrębnych regionów chromatyny lub zmian w składzie chromatyny w tym samym regionie podczas przejścia do innego stanu funkcjonalnego, torując w ten sposób drogę do różnych zastosowań w epigenetyce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

  1. Nośnik w warstwie Standardowa dla natywnego protokołu ChIP
    1. Hoduj komórki HeLa w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% glutaminą, 1% Pen/Strep i 10 mM HEPES pH 7,5.
  2. Oznakowanie SILAC do sieciowania ChIP
    1. Hodować komórki HeLa w pożywce SILAC DMEM, pozbawionej lizyny i argininy, uzupełnionej 10% dializowanym FBS, 1% glutaminy, 1% Pen/Strep, 10 mM HEPES pH 7,5 i lekkiej L-lizyny (Lys 0) i L-argininy (Arg 0) lub ich ciężkich odpowiedników, L-lizyny (Lys 8) i L-argininy (Arg 10) (Tabela materiałów), w końcowych stężeniach 73 mg/L i 42 mg/L, odpowiednio.
    2. Hoduj komórki przez maksymalnie osiem pokoleń w pożywce SILAC, aby zapewnić pełną inkorporację aminokwasów kodowanych izotopami. Przepuszczaj komórki co dwa dni, gdy osiągną gęstość 1,0-1,5 x 106 komórek/ml, wysiewając je w stężeniu 3 x 105 komórek/ml.
    3. Oceń wzrost i żywotność komórek w pożywce SILAC, aby zindywidualizować wszelkie możliwe zmiany w fizjologii, które mogą wynikać z gorszego składu pożywki SILAC; w tym celu:
      1. Codziennie podczas znakowania sprawdzaj wizualnie morfologię komórek pod mikroskopem.
      2. Policz komórki i wykreśl krzywe wzrostu komórek rosnących w SILAC w porównaniu ze standardowym podłożem.

2. Natywna immunoprecypitacja chromatyny (N-ChIP)

  1. Przygotowanie jąder z hodowanych komórek
    1. Użyj 1-2 x 108 nieoznakowanych komórek HeLaS3 na eksperyment. Zebrać komórki, zrobić porcję 50 x 106 komórek w probówkach o pojemności 50 ml i odwirować przy 340 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, przemyć je lodowatym PBS.
    2. Zawiesić ponownie każdą komórkę w 8 ml buforu do lizy (tabela 1) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C na obracającym się kole. Ostrożnie wylać każdy lizat komórkowy na poduszkę z sacharozą (tabela 1) i odwirować w odchylanym wirniku, przy 3,270 x g, przez 20 minut w temperaturze 4 °C, w celu oddzielenia jąder od cytoplazmy.
    3. Odrzucić supernatanty, przechowywać granulki jądrowe i umyć je dwukrotnie w lodowatym PBS przez odwirowanie, odrzucić supernatant przy każdym płukaniu.
  2. Trawienie nukleazą mikrokokkową (MNazy) (mała skala) i kontrola jakości chromatyny po trawieniu
    1. Zawiesić przemyte osady jądrowe w 1 ml buforu wytrawiającego (tabela 1); podzielić na dwie porcje po 500 μl i przechowywać na lodzie.
    2. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) przy 260 nm podwielokrotności, rozcieńczonej w stosunku 1:200 w 0,2% dodecylosiarczanie sodu (SDS). Uwaga: OD = 1 odpowiada około 50 μg/ml DNA chromatyny. Zazwyczaj, zaczynając od 2 x 108 komórek, OD mieści się w zakresie 40-60.
    3. Pobrać 1% jąder, dodać enzym MNazę do końcowego stężenia 0,005 U enzymu/μl jąder i inkubować w temperaturze 37 °C przez różne upływy czasu (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. W każdym punkcie czasowym zbierz 4 μl strawionych jąder i dodaj 1 mM EDTA, aby zatrzymać reakcję MNazy. Trzymaj na lodzie.
    5. Ekstrahować próbki DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i eluować je w 50 μl buforu TE (Tabela 1).
    6. Pobrać 20 μl każdej próbki DNA, dodać 10 μl buforu ładującego (Tabela 1) i załadować próbki na 1% (w/v) żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny, z markerem PCR jako kontrolą wielkości.
    7. Sprawdź trawienie, oceniając drabinę nukleosomów chromatyny wytworzoną przez inkubację MNazy.
    8. Wybierz optymalny czas trawienia, na podstawie występowania mononukleosomów w preparacie. Typowo dla 0,005 U enzymu/μl jąder optymalny czas trawienia MNazy wynosi 60 minut (ryc. 1B, lewy panel). Uwaga: Optymalne stężenie MNazy/czas trawienia można dostosować w zależności od pożądanego typu komórki i wielkości rozciągliwych nukleosomów.
  3. Wielkoskalowe/preparatywne trawienie MNazy i odzyskiwanie rozpuszczalnych frakcji chromatyny
    1. Dodać do każdej podwielokrotności (patrz ppkt 2.2.1) 5 μl MNazy, odpowiadającej końcowemu stężeniu 0,005 j. enzymu/μl jąder; delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut (lub ogólnie dla optymalnego przedziału czasu, w oparciu o badanie na małą skalę).
    2. Dodaj 1 mM EDTA, aby zatrzymać reakcję i trzymać na lodzie. Strawione jądra osadzać przez odwirowanie w temperaturze 7 800 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Przenieść supernatanty (frakcja S1) do nowej probówki i przechowywać w temperaturze 4 °C. Uwaga: S1 zawiera pierwszą rozpuszczalną frakcję chromatyny, składającą się z mononukleosomów. Dodać inhibitory proteazy (Tabela 1).
    3. Ostrożnie zawiesić granulki w 1 ml buforu do dializy (Tabela 1) i dializować przez noc w temperaturze 4 °C (odcięcie rurki dializacyjnej wynosi 3,5 kDa), w 3 l buforze do dializy, stale delikatnie mieszając. Zebrać dializowany materiał i odwirować przy 7 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant (frakcję S2) do nowej probówki Eppendorfa i przechowywać w temperaturze 4 °C. Uwaga: S2 składa się z nukleosomów di- do epta, w zależności od stopnia trawienia MNazy.
  4. Kontrola jakości chromatyny przed immunoprecypitacją
    1. Pobrać podwielokrotność odpowiadającą 5 μg frakcji chromatyny S1 i S2 (określoną ilościowo przez pomiar OD przy 260 nm w systemie NanoDrop). Ekstrahować DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i eluować w 50 μl buforu TE (Tabela 1).
    2. Weź 20 μl DNA S1 i S2, wymieszaj z 10 μl buforu ładującego (Tabela 1) i załaduj je 1% (w/v) żelu agarozowego. Sprawdź jakość i wydajność trawienia MNazy poprzez oględziny drabinki nukleosomów. nuta: Frakcja S1 jest wysoce wzbogacona w mononukleosomy, podczas gdy frakcja S2 zawiera głównie polinukleosomy (ryc. 1B, prawy panel).
  5. Inkubacja chromatyny z przeciwciałem
    1. Przechowywać w temperaturze -20 °C 50 μl frakcji S1 do późniejszej analizy metodą spektrometrii mas.
    2. Dodać 1 objętość buforu rozcieńczającego ChIP (Tabela 1) do frakcji S1.
    3. Dodać przeciwciało przeciwko badanemu hPTM (lub białku); inkubować przez noc na obracającym się kole w temperaturze 4 °C. Uwaga: Zazwyczaj stosuje się od 10 μg do 20 μg przeciwciała na 2 x 108 komórek. Optymalny stosunek między ilością przeciwciała a liczbą komórek wyjściowych musi być starannie ustalony indywidualnie dla każdego przypadku, w zależności od obfitości hPTM/białka użytego jako przynęta w próbce oraz od skuteczności przeciwciała. Optymalizacja ma charakter eksperymentalny i opiera się na następujących testach:
      1. Porównaj ilość hPTM/białka będącego przedmiotem zainteresowania między wejściem a przepływem (FT, patrz 2.7.2) przez Western Blot lub MS, aby sprawdzić, czy immunoprecypitacja wzbogaca znaczną część określonego regionu chromatyny. nuta: Zazwyczaj osiąga się to, gdy co najmniej 50% przynęty hPTM/białkowej jest wyczerpane w FT (ryc. 1C).
      2. Sprawdzić, czy białko immunoprecypitowane będące przedmiotem zainteresowania jest wykrywalne na żelu SDS-PAGE, co zapewnia dostępność wystarczającej ilości materiału do analizy SM. nuta: Obecność na żelu prążków odpowiadających czterem histonom rdzenia przy prawidłowej stechiometrii wskazuje, że nienaruszony nukleosom został immunoprecypitowany przez N-ChroP (ryc. 1D). Brak prawidłowej stechiometrii w rzeczywistości wskazuje na częściowe rozerwanie/rozwinięcie nukleosomu.
    4. Równolegle przygotować białkowe kulki magnetyczne sprzężone z G (patrz 2.6).
  6. Równoważenie i blokowanie kulek magnetycznych sprzężonych z białkami G
    1. Zrównoważyć 100 μl zawiesiny kulek magnetycznych sprzężonych z białkami G w roztworze blokującym (tabela 1), przemywając je trzykrotnie i inkubując przez noc w temperaturze 4 °C na obracającym się kole. nuta: Podążając za zdolnością wiązania kulek, użyj 100 μl gnojowicy na 2-20 μg przeciwciała.
    2. Umyć zablokowane kulki raz roztworem blokującym, a następnie dwukrotnie buforem rozcieńczającym ChIP (Tabela 1).
  7. Izolacja chromatyny za pomocą kulek magnetycznych
    1. Dodać 100 μl zablokowanych kulek do próbki chromatyny S1 i inkubować je na obracającym się kole w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. Wirować przy 340 x g przez 1 minutę, aby odwirować próbkę z pokrywki końcówek. Umieść w stojaku magnetycznym, aby granulować koraliki.
    2. Przenieść supernatant do nowej probówki Eppendorfa. Jest to przepływ przez (FT), czyli frakcję chromatyny, która nie wiązała się z przeciwciałem.
    3. Umyj kulki czterokrotnie w buforze myjącym (tabela 1), zwiększając stężenie soli przy każdym płukaniu (75, 125 i 175 mM NaCl).
    4. Aby wymyć immunoprecypitowaną chromatynę, inkubuj kulki w 30 μl buforu do próbek LDS, uzupełnionego 50 mM ditiotreitolem (DTT) przez 5 minut w temperaturze 70 °C. Oddziel eluowane białka na 4-12% akryloamidu Bis-Tris SDS-PAGE wstępnie obsadzonym żelu gradientowym i zabarwić żel za pomocą koloidalnego zestawu do barwienia Coomassie (ryc. 1D).

3. Immunoprecypitacja chromatyny sieciującej (X-ChIP)

  1. Sieciowanie komórek formaldehydem
    1. Dodaj 0,75% formaldehydu do komórek znakowanych SILAC, krótko wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ugasić formaldehyd, dodając 125 mM glicyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Podzielić komórki na 5 x 107 podwielokrotności; przepłukać je trzykrotnie lodowatym PBS, odwirowując przy 430 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucając supernatanty po każdym przemyciu. Przy ostatnim praniu wyrzucić supernatant i zachować osad. Uwaga: Po usieciowaniu ogniwa można je przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.
  2. Przygotowanie jąder
    1. Zawiesić każdą komórkę w 10 ml buforu do lizy (Tabela 1). Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C z rotacją. Wirować przy 430 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatanty; Zachowaj granulki jądrowe.
    2. Zawiesić każdą pastylkę jądrową w 10 ml buforu do przemywania (Tabela 1). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut na obracającym się kole.
    3. Wirować przy 430 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatanty i zebrać granulki.
    4. Zawiesić każdą pastylkę jądrową w 3 ml buforze do inkubacji ChIP (Tabela 1). Trzymaj na lodzie.
  3. Sonikacja chromatyny i kontrola jakości
    1. Sonikować chromatynę przy 200 W (cykle 30 sekund "włączenia" i 1 minuty "wyłączenia"), w schłodzonym Bioruptorze, w celu fragmentacji chromatyny. Uwaga: liczba cykli i interwałów sonikacji zależy od typu komórki i od średniej długości pożądanego rozciągnięcia nukleosomów. Zazwyczaj 30 minut sonikacji jest niezbędne do wytworzenia fragmentów DNA o długości 300-500 pz, odpowiadających di- i trinukleosomom. Wybór wielkości fragmentów zależy od rodzaju badanej domeny chromatyny.
    2. Pobrać 2% całkowitego wkładu, odwrócić sieciowanie przez inkubację w temperaturze 65 °C przez co najmniej 1 godzinę w buforze inkubacyjnym ChIP. Wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, eluuj w 50 μl buforu TE i załaduj DNA na żel agarozowy, aby sprawdzić fragmentację chromatyny.
  4. Inkubacja chromatyny z przeciwciałem
    1. Dodaj 1/10 objętości 10% Triton X-100 do sonikowanej chromatyny. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia zanieczyszczeń.
    2. Zaoszczędź 50 μl chromatyny wprowadzanej z ciężkich komórek w celu zbadania poziomu włączenia aminokwasów SILAC w znakowanych komórkach i do profilowania białek.
    3. Dodać wybrane przeciwciało do pozostałej ciężkiej i lekko znakowanej sonikowanej chromatyny i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na obracającym się kole. W kanale świetlnym dodaj również nadmiar fałdu rozpuszczalnego peptydu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na obracającym się kole. Notatki: Optymalny stan między μg przeciwciała a materiałem wyjściowym komórek jest wybierany indywidualnie dla każdego przypadku, jak omówiono w ppkt 2.5.3. Optymalna molowość nadmiernego krotnego fałdowania rozpuszczalnego peptydu w stosunku do przeciwciała musi być starannie miareczkowana dla każdego przypadku.
  5. Izolacja chromatyny za pomocą kulek magnetycznych
    1. Zrównoważyć i zablokować kulki magnetyczne sprzężone z białkami G, postępując zgodnie z krokami opisanymi w ppkt 2.6 i używając bufora inkubacyjnego ChIP.
    2. Dodać 100 μl zablokowanych kulek do próbek chromatyny i inkubować na obracającym się kole przez 3 godziny w temperaturze 4 °C. Wirować przy 340 x g przez 1 minutę, aby odwirować próbkę z pokrywki końcówek. Umieść w stojaku magnetycznym, aby granulować koraliki. Supernatant to przepływ (FT), zawierający niezwiązane nukleosomy. Przemyć kulki czterokrotnie w buforze płuczącym (tabela 1) ze zwiększonym stężeniem soli (dwa płukania przy 150 mM i dwa przy 300 mM NaCl).
    3. Inkubować kulki w 30 μl buforu do ładowania próbek SDS-PAGE (Tabela 1) i przez 25 minut w temperaturze 95 °C w celu elucji i odsieciowania białek wytrąconych immunologicznie. Oddziel białka na 4-12% akryloamidach Bis-Tris SDS-PAGE prefabrykowanych żelach (ryc. 3D).

4. Przygotowanie próbki przed MS

  1. Trawienie histonów w żelu wzbogacone o N-ChIP
    nuta: Podczas etapów trawienia białek i ekstrakcji peptydów należy zwrócić uwagę na zminimalizowanie zanieczyszczeń keratynowych, które zakłócają LC-MS/MS, jak opisano wcześniej22,23.
    1. Wytnij plastry żelu odpowiadające pasmom histonów rdzenia (ryc. 1D). Odbarwić kawałki żelu 50% acetonitrylem (ACN) w ddH2O, na przemian ze 100% ACN, aby obkurczyć żel. Powtarzaj, aż kawałki żelu zostaną całkowicie odbarwione i wysusz je w wirówce próżniowej.
    2. Dodać bezwodnik6-octowy D w stosunku 1:9 (v/v) w 1 M wodorowęglanie amonu (NH4HCO3) (zazwyczaj końcowa objętość wynosi 60-100 μl) i 3 μl octanu sodu (CH3COONa) jako katalizator. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, mocno wstrząsając. Uwaga: Próbka może wytwarzać pęcherzyki już w pierwszych minutach po wystąpieniu reakcji: ważne jest, aby obchodzić się z nią ostrożnie i uwalniać wytworzony gaz, otwierając od czasu do czasu probówki podczas inkubacji.
    3. Kawałki żelu kilkakrotnie przepłukać NH4HCO3, naprzemiennie z ACN w rosnącym procencie (od 50% do 100%), aby całkowicie wyeliminować pozostałości bezwodnika D6-octowego.
    4. Skurcz kawałki żelu w 100% ACN; wysusz je w wirówce próżniowej, aby zapewnić całkowite odwodnienie. Ponownie uwodnić kawałki żelu lodowatym roztworem trypsyny o stężeniu 100 ng/μl w 50 mM NH4HCO3 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Uwaga: Połączenie chemicznej modyfikacji lizyn przy użyciu deuterowanego bezwodnika octowego i trawienia trypsyny generuje "podobny do Arg-C" we wzorze trawienia żeluhistonów 21,24.
    5. Odrzucić nadmiar roztworu i dodać objętość 50 mM NH4HCO3 w celu całkowitego pokrycia kawałków żelu; inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    6. Zbierz rozpuszczalne, strawione peptydy w nowej probówce Eppendorfa. Peptydy liofilizowane. Zawiesić je ponownie w 0,5% kwasie octowym/0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA). Odsalać i zagęszczać peptydy na odwróconej fazie C18/Węgiel "kanapkowy" i chromatografia jonowymienna (SCX) na ręcznie wykonanych mikrokolumnach (StageTip) 25.
    7. Przygotuj mikrokolumny StageTip, umieszczając krążki z siatki teflonowej zawierające unieruchomione kulki C18/Carbon ("sandwich") i SCX w końcówkach o pojemności 200 μl. Uzyskaj "kanapkę", ładując mikrokolumnę C18 na drugą końcówkę załadowaną filtrem węglowym. nuta: Bardzo krótkie peptydy, które nie są zatrzymywane na filtrze C18, przechodzą przez przepływ, który jest ładowany bezpośrednio na końcówkę węglową, która zazwyczaj je wychwytuje. SCX StageTips może wzbogacać określone peptydy, takie jak peptyd H3(3-8), które nie są skutecznie zatrzymywane przez chromatografię z odwróconymi fazami.
    8. Załaduj 50% peptydów na "sandwich StageTip" C18/Carbon i 50% na SCX StageTips. Eluuj je z końcówek C18/Carbon za pomocą 80% ACN/0,5% kwasu octowego, a z końcówek SCX za pomocą 5% wodorotlenku amonu (NH4OH)/30% metanolu. Po liofilizacji ponownie zawiesić peptydy w 0,1% FA i przeanalizować za pomocą LC-MS/MS.
  2. Trawienie białek oczyszczonych immunologicznie w żelu
    Trawienie białek w żelu odbywa się zgodnie z wcześniejszym opisem 22, z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Pokrój każdy pas na dziesięć plasterków (Rysunek 3D), a każdy plasterek w małą kostkę o średnicy 1 mm3. Odbarwić kawałki żelu za pomocą 50 mM NH4HCO3/50% etanolu i dodać etanol absolutny, aby obkurczyć żele. Powtarzaj, aż żele zostaną całkowicie odbarwione.
    2. Dodać bufor redukcyjny (tabela 1) do kawałków żelu przez 1 godzinę w temperaturze 56 °C, a następnie dodać bufor alkilacyjny (tabela 1) przez 45 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności. Umyj i osusz kawałki żelu w wirówce próżniowej.
    3. Ponownie nawodnić kawałki żelu lodowatym roztworem trypsyny o stężeniu 12,5 ng/μl w 50 mM NH4HCO3 i inkubować na lodzie aż do całkowitego uwodnienia kawałków żelu. Usuń trypsynę w nadmiarze.
    4. Dodaj 50 mM NH4HCO3, aby całkowicie pokryć kawałki żelu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    5. Zebrać płynną część. Dodać bufor ekstrakcyjny (tabela 1) do kawałków żelu; inkubować z silnym mieszaniem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz dwa razy.
    6. Inkubować kawałki żelu w ACN przez 10 minut, mocno mieszając. Powtórzyć dwa razy i zebrać wszystkie supernatanty.
    7. Liofilizuj peptydy. Ponownie zawiesić wysuszone peptydy w 0,5% kwasie octowym/0,1% TFA.
    8. Odsolić i skoncentrować peptydy na odwróconej fazie C18 StageTip, jak opisano26,27.
    9. Elute peptydy z C18 StageTip przy użyciu 80% ACN/0,5% kwasu octowego. Usunąć rozpuszczalnik organiczny przez odparowanie w wirówce próżniowej i ponownie zawiesić peptydy w 0,1% FA (zwykle 5-10 μl), gdy będą gotowe do analizy MS.

5. Analiza LC-MS

  1. Analiza metodą chromatografii cieczowej
    1. Umieścić kolumnę analityczną w 15-centymetrowym emiterze stopionej krzemionki (średnica wewnętrzna 75 μm, średnica zewnętrzna 350 μm), przy użyciu żywicy o odwróconych fazach (RP) C18, 3 μm w metanolu, przy stałym ciśnieniu helu (50 barów) przy użyciu urządzenia ładującego bomby, jak opisano wcześniej28.
    2. Połączyć wypełniony emiter (kolumna C18 RP) bezpośrednio z wylotem 6-portowego zaworu HPLC za pomocą stopionej krzemionki o długości 20 cm (25 μm średnicy wewnętrznej) bez użycia kolumny wstępnej lub urządzenia dzielonego.
    3. Załadować strawione peptydy do kolumny C18 RP przy przepływie 500 nl/min ruchoma faza A (0,1% FA/5% ACN w ddH2O).
    4. Po załadowaniu próbki należy rozdzielić peptydy, stosując następujące gradienty:
      1. Zastosować 0–40% ruchomą fazę B (0,1% FA/99% ACN w ddH2O) przy 250 nl/min przez 90 minut, a następnie gradient 40-60% w ciągu 10 minut i 60-80% w ciągu 5 minut, w celu elucji peptydów pochodzących z histonów (patrz 2).
      2. Zastosować 0-36% ruchomą fazę B przy 250 nl/min przez 120 minut, a następnie gradient 36-60% w ciągu 10 minut i 60-80% przez 5 minut, w celu elucji peptydów pochodzących z białek oczyszczonych immunologicznie (patrz 3).
  2. Analiza spektrometrii mas za pomocą spektrometru mas LTQ-FT-ICR-Ultra
    1. Działaj w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA), aby automatycznie przełączać się między akwizycją MS i MSMS. Uzyskuje się pełne widma skanowania MS, zwykle w zakresie m/z od 200-1 650, z rozdzielczością R = 100 000 przy 400 m/z. Pięć (Top5) najbardziej intensywnych jonów jest izolowanych w celu fragmentacji w liniowej pułapce jonowej przy użyciu dysocjacji wywołanej zderzeniem (CID) przy wartości docelowej 5000.
    2. Użyj parametrów wymienionych w Tabeli 2 dla pliku akwizycji "Tuning".
    3. Ustaw standardowe ustawienia akwizycji zgodnie z tabelą 2.

6. Analiza danych

  1. Kwantyfikacja bez znaczników modyfikacji histonów współwzbogaconych w domeny chromatyny
    1. Przekonwertuj uzyskane pliki RAW na pliki mgf za pomocą oprogramowania Raw2msm (wersja 1.10)29.
    2. Wyszukaj modyfikacje histonów za pomocą Mascot Deamon (wersja 2.2.2), ustawiając parametry opisane w Tabeli 3.
    3. Z listy peptydów wyjściowych Mascot usuń peptydy z wynikiem niższym niż 15 lub z więcej niż 5 przypuszczalnymi PTM29. nuta: Dla każdego pojedynczego identyfikatora peptydu wybierz peptyd z najwyższym wynikiem maskotki i odfiltruj wszystkie inne nadmiarowe peptydy o tym samym identyfikatorze.
    4. Skonstruuj chromatogramy wyekstrahowanych jonów (XIC) dla każdego prekursora odpowiadającego każdemu zmodyfikowanemu peptydom, w oparciu o wartość m/z, korzystając z QualBrowser. Obliczyć pole pod krzywą (AUC) dla każdego piku (rysunek 2A).
    5. Zweryfikuj każdy zidentyfikowany peptyd zawierający modyfikacje poprzez oględziny widm MS/MS za pomocą QualBrowser (Rysunek 2B).
    6. Oblicz względną obfitość dla każdego zmodyfikowanego peptydu. Oblicz względne wzbogacenie każdej modyfikacji w materiale ChIP-ed. nuta: Obfitość względna jest obliczana jako stosunek AUC każdego specyficznego zmodyfikowanego peptydu do sumy AUC wszystkich zmodyfikowanych i niezmodyfikowanych form tego samego peptydu, podczas gdy względne wzbogacenie jako stosunek względnej obfitości określonej modyfikacji w ChIP w stosunku do wejścia (rysunek 2C).
  2. Ilościowa analiza proteomiczna białek współzwiązanych w domenach chromatyny
    1. Do identyfikacji białek i oznaczania ilościowego należy użyć opakowania MaxQuant (http: //www. maxquant.org/)30. Skonfiguruj wbudowaną wyszukiwarkę "Andromeda" za pomocą AndromedaConfig.exe31 i ustaw parametry wyszukiwania wymienione w Tabeli 3.
  3. Test inkorporacji
    1. Oszacuj stopień włączenia ciężkich aminokwasów do białek w wejściu chromatyny znakowanej ciężko, używając oprogramowania MaxQuant, w następujący sposób:
      1. Ustaw parametry zgodnie z opisem w 6.2, ale wyłączając opcję ponownego określania ilościowego.
      2. Obliczyć procent inkorporacji, stosując następujący wzór do nieredundantnych współczynników peptydów: Włączenie (%) = stosunek (H/L) / stosunek (H/L) + 1 × 100 (Rysunek 3B). nuta: Zaakceptuj tylko wtedy, gdy inkorporacja >95%.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Immunoprecypitacja chromatyny jest potężną techniką stosowaną do profilowania lokalizacji białka lub modyfikacji histonów w obrębie genomu. W odpowiedniku proteomicznym po ChIP następuje analiza proteomiczna oparta na MS, aby jakościowo i ilościowo zidentyfikować hPTM, warianty histonów oraz białka wiążące chromatynę, które zostały immunoprecypitowane wraz z modyfikacją lub białkiem docelowym, pełniącym rolę „przynęty”. W podejściu N-ChroP, przedstawionym na Rysunku 1A, natywny ChIP, w którym chromatyna ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niedawno opisaliśmy ChroP, ilościową strategię charakterystyki na dużą skalę składników białkowych chromatyny. ChroP łączy w sobie dwa uzupełniające się podejścia stosowane w dziedzinie epigenetyki, ChIP i MS, wykorzystując ich mocne strony i pokonując odpowiednie ograniczenia. ChIP sprzężony z głębokim sekwencjonowaniem (ChIP-Seq) umożliwia mapowanie modyfikacji histonów w całym genomie z rozdzielczością kilku nukleosomów35. Chociaż korzystne ze względu na ich czułość, testy oparte na przeciwciałach mają ogra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Badania te zostały pierwotnie opublikowane w Mol Cell Proteomics. Soldi M. i Bonaldi T. Badanie proteomiczne domen funkcjonalnych chromatyny ujawnia nowe synergizmy między różnymi składnikami heterochromatyny MCP. 2013; 12: 64-80. © Amerykańskie Towarzystwo Biochemii i Biologii Molekularnej. Dziękujemy Roberze Noberini (Włoski Instytut Technologii i IEO, Włochy) za krytyczną lekturę manuskryptu. Prace nad gruźlicą są wspierane przez granty z Programu Rozwoju Kariery Fundacji Giovanniego Armenise-Harvarda, Włoskiego Stowarzyszenia Badań nad Rakiem oraz włoskiego Ministerstwa Zdrowia. Prace nad stwardnieniem rozsianym były wspierane przez stypendium FIRC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
Dializowany FBSInvitrogen26400-044
Lizyna 0 (12C6 14N2 L-lizyna)Sigma AldrichL8662
Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)Sigma AldrichA6969
Lizyna 8 (13C6 15N2 L-lizyna)Sigma Aldrich68041
Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)Sigma Aldrich608033
Nukleaza mikrokokkowaRoche10 107 921 001
Kompletne, wolne od EDTA tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazyRoche04 693 132 001
Rurka do dializy Spectra/Por 3, 3,5K MWCO, płaska szerokość 18 mm, długość50 stópSpectrumlabs132720
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQIAGEN28104
Anti-Histone H3 tri-metylowany K9-ChIP klasyAbcamab8898
Peptyd histonowy H3 trimetylo-metylowy K9 Abcamab1773
Dynabeads Białko GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                                                      Żel Bis-Tris InvitrogenNP0335BOX
Zestaw do barwienia na kolor koloidalny w kolorze niebieskimInvitrogenLC6025
LDS Bufor do próbekInvitrogenNP0007
FormaldheydeSigma AldrichF8775
Bezwodnik acetyczny-d6Sigma Aldrich175641-1G
[nagłówek]
Kwas mrówkowySigma Aldrich94318-50ML-F
Jodoacetamid ≥ 99% (HPLC), krystalicznaSigma AldrichI6125
DL-DithiothreitolSigma Aldrich43815
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania, mrożona 100 μ g (5 & razy; 20 μ g)PromegaV5113
Nanospray OD 360μ m x ID 75μ m, końcówki ID 8 i mu; m niepowlekany Pk 5Mikrokolumna SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &mikro; m    15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
Węglowa tarcza ekstrakcyjna, 47 mmAgilent Technologies12145040
Tarcza do ekstrakcji kationówAgilent Technologies66889-U

Bibliografia

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
  3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
  5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
  8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
  9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
  10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
  11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
  12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
  13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
  14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
  15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
  16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
  17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
  18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
  19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
  21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
  22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
  23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
  24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
  25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
  26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
  27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
  28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
  29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
  30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
  31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
  32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
  33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
  34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
  35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
  36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
  37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
  38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
  39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
  40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Proteomika chromatynyspektrometria mas ChIPmodyfikacje histonówimmunoprecypitacja chromatynyprzygotowanie jąder komórkowychtrawienie enzymatyczneanaliza SDS-PAGEchromatografia cieczowaanaliza spektrometrycznaznakowanie izotopami stabilnymi
Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.