Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51222

⸱

5 maja 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unité de Génomique Virale et Vaccination, Virology Department, Institut Pasteur, CNRS UMR3569, 2Unité de Chimie et Biocatalyse, Biochemistry and Structural Biology Department, Institut Pasteur, CNRS UMR3523, 3Unité des Interactions Moléculaires Flavivirus-Hôtes, Virology Department, Institut Pasteur

W tym artykule

Podsumowanie

Testy in vitro do pomiaru replikacji wirusa zostały znacznie ulepszone dzięki rozwojowi rekombinowanych wirusów RNA wyrażających lucyferazy lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji. W tym miejscu szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy takie rekombinowane szczepy wirusów odry i chikungunya w celu wyizolowania leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania z bibliotek chemicznych.

Streszczenie

Wirusy RNA są odpowiedzialne za główne choroby ludzkie, takie jak grypa, zapalenie oskrzeli, denga, wirusowe zapalenie wątroby typu C czy odra. Stanowią one również nowe zagrożenie ze względu na wzmożoną wymianę na całym świecie i populacje ludzkie penetrujące coraz więcej naturalnych ekosystemów. Dobrym przykładem takiej wyłaniającej się sytuacji są epidemie wirusa chikungunya w latach 2005-2006 na Oceanie Indyjskim. Ostatnie postępy w naszym zrozumieniu szlaków komórkowych kontrolujących replikację wirusa sugerują, że związki ukierunkowane na funkcje komórek gospodarza, a nie sam wirus, mogą hamować duży panel wirusów RNA. Niektóre związki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działania zostały zidentyfikowane za pomocą testów zorientowanych na cel gospodarza. Jednak pomiar zahamowania replikacji wirusa w hodowlach komórkowych przy użyciu redukcji efektów cytopatycznych jako odczytu nadal stanowi najważniejszą strategię badań przesiewowych. Takie funkcjonalne badania przesiewowe zostały znacznie ulepszone dzięki opracowaniu rekombinowanych wirusów wykazujących ekspresję enzymów reporterowych zdolnych do bioluminescencji, takich jak lucyferaza. W niniejszym raporcie szczegółowo opisujemy wysokoprzepustową linię badań przesiewowych, która łączy rekombinowane wirusy odry i chikungunya z testami żywotności komórek, w celu identyfikacji związków o profilu przeciwwirusowym o szerokim spektrum działania.

Wprowadzenie

Wirusy RNA są odpowiedzialne za wiele różnych infekcji u ludzi i mają ogromny wpływ na populacje na całym świecie, zarówno pod względem zdrowia publicznego, jak i kosztów ekonomicznych. Opracowano skuteczne szczepionki przeciwko kilku ludzkim wirusom RNA i są one szeroko stosowane w leczeniu profilaktycznym. Jednak nadal istnieje krytyczny brak leków terapeutycznych przeciwko infekcjom wirusem RNA. Rzeczywiście, nie są dostępne skuteczne szczepionki przeciwko głównym patogenom u ludzi, takim jak wirus dengi, wirus zapalenia wątroby typu C lub ludzki syncytialny wirus oddechowy (hRSV). Poza tym wirusy RNA są odpowiedzialne za większość pojawiających się chorób, których częstotliwość wzrosła ze względu na globalną wymianę i wpływ człowieka na systemy ekologiczne. Wobec tego zagrożenia, jakim są wirusy RNA, nasz arsenał terapeutyczny jest niezwykle ograniczony i stosunkowo mało skuteczny1-3. Obecne terapie opierają się zasadniczo na rekombinowanych interferonach typu I (IFN-α/β) w celu stymulacji odporności wrodzonej lub podawaniu rybawiryny. Chociaż sposób działania tego analogu rybonukleozydu jest kontrowersyjny i prawdopodobnie opiera się na różnych mechanizmach, hamowanie komórkowego IMPDH (dehydrogenazy monofosforanu inozyny), która wyczerpuje wewnątrzkomórkowe pule GTP, jest wyraźnie niezbędne4. Rybawiryna, w skojarzeniu z pegylowanym IFN-α, jest głównym lekiem przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C. Jednak leczenie IFN-α/β i rybawiryną ma stosunkowo niską skuteczność in vivo przeciwko większości wirusów RNA, ponieważ skutecznie tępią sygnalizację IFN-α/β poprzez ekspresję czynników wirulencji5 i często uciekają rybawiryny3. Przyczyniło się to do faktu, że leczenie rybawiryną rodzi poważne problemy związane z toksycznością, chociaż niedawno została zatwierdzona przeciwko ciężkiej chorobie hRSV z kontrowersyjnymi korzyściami6. Ostatnio wprowadzono na rynek niektóre terapie specyficzne dla wirusa, w szczególności przeciwko wirusowi grypy wraz z opracowaniem inhibitorów neuraminidazy3. Jednak duża różnorodność i trwałe pojawianie się wirusów RNA uniemożliwia opracowanie specyficznych metod leczenia każdego z nich w stosunkowo bliskiej przyszłości. Ogólnie rzecz biorąc, podkreśla to potrzebę opracowania skutecznych strategii identyfikacji i rozwoju silnych cząsteczek przeciwwirusowych w najbliższej przyszłości.

Trywialne jest stwierdzenie, że inhibitor o szerokim spektrum działania przeciwko dużej liczbie wirusów RNA rozwiązałby ten problem. Chociaż taka cząsteczka jest nadal marzeniem wirusologa, nasze lepsze zrozumienie mechanizmów obrony komórkowej i wrodzonego układu odpornościowego sugeruje, że istnieją pewne możliwości7,8. Kilka laboratoriów akademickich i przemysłowych poszukuje obecnie cząsteczek, które stymulują określone aspekty komórkowych mechanizmów obronnych lub szlaków metabolicznych w celu osłabienia replikacji wirusa. Chociaż takie związki prawdopodobnie będą wykazywać znaczące skutki uboczne, leczenie ostrych infekcji wirusowych będzie stosowane przez stosunkowo krótki czas, co czyni je akceptowalnymi pomimo pewnej potencjalnej toksyczności w dłuższej perspektywie. Opracowano różne strategie identyfikacji takich cząsteczek przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania. Niektóre programy badawcze mają na celu znalezienie cząsteczek, które są ukierunkowane na określone szlaki obronne lub metaboliczne. Obejmuje to na przykład receptory rozpoznające patogeny w celu wywołania ekspresji genów przeciwwirusowych9 i aktywacji czynników przeciwwirusowych, takich jak RNaza10, maszyneria autofagii sprzyjająca degradacji wirusa11, szlaki syntezy nukleozydów12,13 lub kaskady apoptotyczne w celu przyspieszenia śmierci komórek zakażonych wirusem14. Inne grupy opracowały fenotypowe badania przesiewowe, które nie są oparte na celu13,15-17. W takim przypadku cząsteczki przeciwwirusowe są po prostu identyfikowane na podstawie ich zdolności do blokowania replikacji wirusa w danym systemie komórkowym. Ogólne założenie jest takie, że związek hamujący 2-3 niespokrewnione wirusy RNA miałby odpowiedni profil dla cząsteczki przeciwwirusowej o szerokim spektrum działania. Sposób działania związków trafionych wybranych przy takim podejściu empirycznym jest określany dopiero po raz drugi i ostatecznie może doprowadzić do identyfikacji nowych celów komórkowych dla leków przeciwwirusowych. Co ciekawe, retrospektywna analiza nowych leków zatwierdzonych przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków w latach 1999-2008 wykazała, że ogólnie rzecz biorąc, takie fenotypowe badania przesiewowe zwykle osiągają lepsze wyniki niż podejścia celowe w celu odkrycia pierwszych w swojej klasie leków małocząsteczkowych18.

Replikacja wirusa w wysokoprzepustowych testach komórkowych jest zwykle określana na podstawie efektów cytopatycznych wirusa. Komórki są zakażone i hodowane na płytkach 96- lub 384-dołkowych w obecności badanych związków. Po kilku dniach warstwy komórkowe są utrwalone i zabarwione barwnikami, takimi jak fiolet krystaliczny. Na koniec absorbancję określa się za pomocą czytnika płytkowego, a związki hamujące replikację wirusa identyfikuje się na podstawie ich zdolności do ochrony warstw komórkowych przed efektem cytopatycznym wywołanym przez wirusa. Alternatywnie, efekty cytopatyczne za pośrednictwem wirusa ocenia się za pomocą standardowych testów żywotności, takich jak redukcja MTS. Takie testy są bardzo wykonalne i opłacalne, ale mają trzy główne ograniczenia. Po pierwsze, wymagają one kombinacji wirus-komórka, w której replikacja wirusa jest cytopatyczna w ciągu zaledwie kilku dni, ale nie zawsze jest to możliwe, co wymaga alternatywnych podejść19. Po drugie, są one słabo ilościowe, ponieważ opierają się na pośredniej mierze replikacji wirusa. Wreszcie, związki toksyczne mogą być oceniane jako trafienia dodatnie, a zatem muszą być eliminowane za pomocą ekranu licznika mierzącego żywotność komórek. Aby przezwyciężyć niektóre z tych przeszkód, rekombinowane wirusy lub replikony zostały zmodyfikowane za pomocą genetyki odwrotnej w celu ekspresji białek reporterowych, takich jak EGFP lub lucyferaza, z dodatkowej jednostki transkrypcyjnej lub w ramce z genami białka wirusowego (kilka przykładów to 20-23). Kiedy te wirusy się replikują, białka reporterowe są wytwarzane razem z samymi białkami wirusowymi. Zapewnia to bardzo ilościowy test do pomiaru replikacji wirusa i oceny aktywności hamującej cząsteczek kandydujących. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku rekombinowanych wirusów eksprymujących lucyferazy (lub inne enzymy zdolne do bioluminescencji), ponieważ ten system reporterowy wykazuje szeroki zakres dynamiki z wysoką czułością i praktycznie bez tła. Ponadto nie ma źródła światła wzbudzającego, co zapobiega interferencji z fluorescencją związków24.

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół o wysokiej przepustowości do przeszukiwania bibliotek chemicznych pod kątem inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum. Związki są najpierw testowane na komórkach ludzkich zakażonych rekombinowanym wirusem odry (MV) eksprymującym lucyferazy świetlika25 (rMV2 / Luc, ryc. 1, pierwotne badanie przesiewowe). MV należy do rzędu Mononegavirales i jest często uważany za prototypowego członka wirusów o ujemnej nici RNA. W związku z tym genom MV jest wykorzystywany jako matryca przez polimerazę wirusa do syntezy cząsteczek mRNA kodujących białka wirusowe. W rekombinowanym szczepie MV o nazwie rMV2 / Luc ekspresja lucyferazy ulega ekspresji z dodatkowej jednostki transkrypcyjnej wstawionej między geny P i M (Figura 2A). Równolegle związki są testowane pod kątem ich toksyczności na komórkach ludzkich przy użyciu komercyjnego odczynnika na bazie lucyferazy, który ocenia, poprzez kwantyfikację ATP, liczbę metabolicznie aktywnych komórek w hodowli (ryc. 1, podstawowe badanie przesiewowe). Za pomocą tych dwóch testów można łatwo przebadać całe biblioteki chemiczne w celu wybrania związków, które nie są toksyczne i skutecznie blokują replikację MV. Następnie trafienia są ponownie testowane pod kątem zahamowania replikacji MV dawka-odpowiedź, braku toksyczności, a także ich zdolności do upośledzenia replikacji wirusa chikungunya (CHIKV) (Figura 1, badanie wtórne). CHIKV należy do rodziny Togaviridae, a jego genom jest dodatnią jednoniciową cząsteczką RNA. W związku z tym jest całkowicie niezwiązany z odrą, a związki hamujące zarówno MV, jak i CHIKV mają wielką szansę na zahamowanie dużego panelu wirusów RNA. Białka niestrukturalne CHIKV są bezpośrednio translowane z genomu wirusa, podczas gdy białka strukturalne są kodowane przez transkrypcję i translację subgenomowej cząsteczki mRNA. Nasz test replikacji in vitro dla CHIKV opiera się na rekombinowanym szczepie o nazwie CHIKV / Ren, który wyraża enzym lucyferazy Renilla jako rozszczepioną część niestrukturalnej poliproteiny poprzez insercję genu reporterowego między sekwencjami nsP3 i nsP426 (Figura 2B). Pomiar aktywności lucyferazy Renilla pozwala na monitorowanie replikacji wirusa na wczesnym etapie cyklu życiowego CHIKV.

Ten protokół o wysokiej przepustowości został wykorzystany do szybkiej identyfikacji związków o odpowiednim profilu dla leków przeciwwirusowych o szerokim spektrum działania w komercyjnej bibliotece 10 000 cząsteczek wzbogaconych o różnorodność chemiczną. Związki były zasadniczo zgodne z regułą pięciu Lipińskiego, z masami cząsteczkowymi w zakresie od 250 do 600 daltonów i wartościami logarytmu D poniżej 5. Większość z tych cząsteczek to nowe jednostki chemiczne niedostępne w innych komercyjnych bibliotekach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie 96-dołkowych płytek potomnych ze związkami

  1. Przenieść 96-dołkowe płytki macierzyste zawierające 10 mM roztwory podstawowe związków chemicznych w DMSO z -20 °C do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć związki 5x w DMSO, aby otrzymać pośrednie 96-dołkowe płytki rozcieńczające w 2 mM. Rozcieńczenie uzyskuje się przez pipetowanie 5 μl do 20 μl DMSO i mieszanie.
  2. Odpipetować 1 μl z płytek rozcieńczających do suchych studzienek z białymi, 96-dołkowymi płytkami z kulturą tkankową oznaczoną kodem kreskowym. Pierwszy zestaw płytek pochodnych (D1) zostanie wykorzystany do oceny toksyczności związków przy końcowym stężeniu 20 μM. Płytki pochodne należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  3. Rozcieńczyć związki ponownie w stosunku 1:10, pipetując 4 μl z płytek rozcieńczających do 36 μl DMSO i mieszając. Odpipetować 1 μl do suchych studzienek z białymi, płaskodennymi, 96-dołkowymi płytkami z kulturą tkankową z kodem kreskowym. Ten drugi zestaw płytek pochodnych (D2) zostanie wykorzystany do oceny zahamowania replikacji MV przez związki o końcowym stężeniu 2 μM. Płytki potomne należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.

2. Przygotowanie kultur komórkowych w celu określenia toksyczności związków

  1. Hoduj komórki HEK-293T w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco ze stabilizowaną L-glutaminą i uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), streptomycyną (100 μg / ml) i penicyliną (100 IU / ml). Komórki są pasażowane przez trypsynizację co 4-5 dni i rozcieńczane w stosunku 1:10 do świeżej kolby. Komórki powinny znajdować się w fazie logarytmicznej do eksperymentów.
  2. W dniu eksperymentu odzyskaj komórki przez trypsynizację i przeprowadź liczenie komórek. Osadzać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić je w stężeniu 3 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej. Należy wziąć pod uwagę, że na każdą płytkę przesiewową wymagane jest 12,5 ml zawiesiny komórek.
  3. Przenieś komórki do koryta i dozuj 100 μl zawiesiny komórek w płytkach D1 zawierających wzbogacone związki chemiczne. Zawiesina komórkowa w korycie jest regularnie mieszana, aby uniknąć sedymentacji.
  4. Studzienki kontrolne A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 i G12 z 1 μl DMSO. Odpowiednie studzienki zostaną wykorzystane jako odniesienie dla żywych komórek (brak toksyczności). Studzienki kontrolne B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 i H12 z 1 μl DMSO i 2,5 μl 0,5% roztworu IGEPAL do zabijania komórek. Odpowiednie studzienki zostaną wykorzystane jako odniesienie dla martwych komórek (wysoka toksyczność).
  5. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

3. Przygotowanie kultur komórkowych zakażonych przez rMV2/Luc

  1. Hodować i odzyskiwać komórki zgodnie z opisem w 2.1 i 2.2. Ponownie zawieś komórki w stężeniu 3 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej. Należy wziąć pod uwagę, że na każdą płytkę przesiewową wymagane jest 12,5 ml zawiesiny komórek.
  2. Opcjonalnie: uzupełnić pożywkę hodowlaną urydyną w ilości 20 μg/ml.
    Uwaga: Podczas badań przesiewowych bibliotek chemicznych pod kątem inhibitorów replikacji wirusa wydaje się, że związki ukierunkowane na wczesne etapy szlaku biosyntezy pirymidyny są często izolowane13,16,27,28. Dodanie urydyny do pożywki hodowlanej służy do odfiltrowania takich cząsteczek przeciwwirusowych. Rzeczywiście, skutecznie przywraca to replikację wirusa, gdy enzymy poprzedzające szlak biosyntezy pirymidyny są zablokowane.
  3. Zaoszczędź 1:10 zawiesiny komórek na studzienki kontrolne z niezainfekowanymi komórkami i przystąp do infekcji pozostałą objętością.
  4. Rozmrozić odpowiednią objętość roztworu podstawowego rMV2/Luc. Roztwory podstawowe MV mają zwykle 106-10 8 zakaźnych cząstek na ml. Hodowla musi być zakażona 0,1 zakaźnymi cząstkami rMV2/Luc na komórkę docelową, co odpowiada 0,1 wielokrotności infekcji (MOI). Uwaga: rMV2/Luc pochodzi ze szczepionki MV (szczep Schwarz) i jest manipulowany w środowisku BSL2.
  5. Dodaj wirusa do zawiesiny komórkowej i delikatnie wymieszaj. Przenieść zakażone komórki do koryta i dozować 100 μl zawiesiny zakażonych komórek w kolumnach od 2 do 11 płytek D2 zawierających wzbogacone związki chemiczne. Zawiesina komórkowa w korycie jest regularnie delikatnie mieszana.
  6. W kolumnach 1 i 12 dozować 100 μl niezakażonych komórek na dwa. Zainfekowane komórki są dozowane w pozostałych studzienkach.
  7. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .

4. Pomiary aktywności lucyferazy i analiza danych

  1. Wyjąć płytki D1 z inkubatora i określić żywotność komórkową, dodając 50 μl odczynnika żywotności na bazie lucyferazy bezpośrednio do dołków hodowlanych. Mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Czytaj tabliczki za pomocą luminometru. Czas integracji jest ustawiony na 100 ms na studzienkę.
  2. Wyjmij płytki D2 z inkubatora i określ aktywność lucyferazy, dodając 50 μl substratu lucyferazy bezpośrednio do dołków hodowlanych. Inkubować przez 6 minut w temperaturze pokojowej i czytać płytki za pomocą luminometru, jak opisano powyżej.
  3. Obliczyć współczynnik Z' dla każdej płytki D1 testu toksyczności, aby zagwarantować jakość badania przesiewowego29. Z' = 1-3*(σ+ + σ-)/(μ+ - μ-), gdzie μ+ i σ+ odpowiadają średnim wskaźnikom luminescencji, a odchylenia standardowe dla komórek HEK-293T z samym DMSO (brak toksyczności), a μ- i σ- są średnimi luminescencji i odchyleń standardowych dla studzienek hodowlanych poddanych działaniu IGEPAL w celu zabicia komórek. Oczekuje się, że Z' będzie powyżej 0,5 lub odpowiednia tabliczka zostanie odrzucona.
  4. Ustaw próg toksyczności na μ+/2. Odrzuć związki o wartościach luminescencji poniżej tej granicy odcięcia (rysunek 3A).
  5. Obliczyć współczynnik Z' dla każdej płytki D2 testu przeciwwirusowego. Tutaj μ+ i σ+ odpowiadają średnim wskaźnikom luminescencji i odchyleniom standardowym dla zakażonych komórek hodowanych za pomocą samego DMSO, a μ- i σ- są średnimi luminescencji i odchyleń standardowych dla komórek niezakażonych. Również w tym przypadku płytki z wartościami Z' poniżej 0,5 są odrzucane.
  6. Oblicz zahamowanie replikacji wirusa w następujący sposób: procent zahamowania = (μ+ - aktywność lucyferazy dla związku X)/(μ+ - μ-)*100. Ustaw próg inhibicji na poziomie 75% i wybierz związki, które zarówno zmniejszają wartości luminescencji poniżej tego punktu odcięcia (rysunek 3B), jak i nie są toksyczne zgodnie z kryteriami opisanymi w 4.4.

5. Wtórne badanie przesiewowe pod kątem toksyczności i szerokiego spektrum działania przeciwwirusowego

  1. Wykonać seryjne rozcieńczenia 1:2 dla każdego trafionego związku w DMSO, zaczynając od 500 μM do 4 μM (8 rozcieńczeń). Białe płytki do hodowli tkankowych z kodem kreskowym należy wypełnić 50 μl pożywki hodowlanej. Dodać 1 μl każdego rozcieńczenia związku do studzienek hodowlanych. Powtórz dwukrotnie, aby uzyskać 3 płytki hodowlane z podwójnymi seryjnymi rozcieńczeniami dla każdego trafionego związku.
  2. Przygotować 37,5 ml zawiesiny komórek HEK-293T w stężeniu 6 x 105 komórek/ml w pożywce hodowlanej, jak opisano powyżej (w ppkt 2.1 i 2.2). Dozować 2x 12,5 ml w probówkach sokoła i zainfekować komórki rMV2/Luc przy MOI = 0,1 lub rekombinowanym CHIKV z ekspresją lucyferazy Renilla (CHIKV/Ren) przy MOI = 0,2. Mieszać przez odwrócenie.
    Uwaga: CHIKV/Ren pochodzi od dzikiego szczepu CHIKV i dlatego powinien być manipulowany w środowisku BSL3. Płytki można przenieść z BSL3 do BSL1 po dodaniu substratu Renilla do dołków hodowlanych (patrz poniżej).
  3. Dozować 50 μl komórek niezakażonych, zakażonych rMV2/Luc lub zakażonych CHIKV/Ren na płytkach hodowlanych zawierających seryjne rozcieńczenia związków trafionych. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 50 μl substratu lucyferazy świetlika, aby określić aktywność lucyferazy świetlika w studzienkach zakażonych rMV2/Luc. Dodać 50 μl substratu lucyferazy Renilla, aby określić aktywność lucyferazy Renilla w studzienkach zakażonych CHIKV/Ren. Na koniec dodaj 50 μl odczynnika do oznaczania żywotności na bazie lucyferazy do niezakażonych komórek, aby określić żywotność komórkową.
  5. Wykreślić dane (rysunek 4) i określić stężenia związków trafionych, które hamują replikację MV i CHIKV o 50%. Zignoruj związek wykazujący pewną toksyczność w tym teście.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ta ścieżka przesiewowa opiera się w pierwszej kolejności na wyborze związków, które hamują replikację MV i nie wykazują istotnej toksyczności komórkowej (Rysunek 1, przesiew pierwotny). Wykorzystuje ona testy oparte na lucyferazie do określania toksyczności komórkowej oraz stopnia zahamowania replikacji wirusa. Wszystkie etapy pipetowania i akwizycji danych mogą być realizowane w warunkach wysokoprzepustowych z wykorzystaniem platformy robotycznej.

Toksyczność komórkową związk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana tu procedura badań przesiewowych ma na celu wyselekcjonowanie związków o odpowiednim profilu jako inhibitory wirusów RNA o szerokim spektrum działania. Gdy za pomocą tego protokołu przebadano bibliotekę 10 000 związków i zastosowano wyżej wymienione kryteria filtrowania, tj. hamowanie replikacji MV powyżej 75%, 40 związków (0,4%) uzyskało wynik pozytywny. Poza tym około połowa z nich wykazała pewną toksyczność w teście żywotności opartym na lucyferazie i z tego powodu została zignorowana. Na koniec ponow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy dr Yves L. Janin za jego owocne komentarze i sugestie. Chcielibyśmy podziękować J.H. za CHIK/Ren i C. Combredet za wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez Instytut Pasteura, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale (INSERM), Institut Carnot - Pasteur Maladies Infectieuses (Program STING do P.O.V i H.M.-L), Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Program STING 2.0 do P.O.V), oraz "Conseil Régional d'Ile-de-France" (Projekt Biblioteki Chemicznej, dotacje nr I 06-222/R i I 09-1739/R dla H.M.-L.). Prace nad CHIKV/Ren były wspierane przez projekt ArbOAS (grant ANR 2010-INTB-1601-02).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Platforma Freedom EVOTECANPlatforma robotyczna
96-dołkowe mikropłytki do hodowli komórek polistyrenowych, białeGreiner Bio One655083
Test żywotności komórek luminescencyjnych CellTiter-Glona bazie lucyferazyPromegaG7570
System oznaczania lucyferazy Bright-Glo PromegaE2610Odczynnik zawierający lucyferazy świetlika substrat
System oznaczania lucyferazy Renilla-GloPromegaE2710Odczynnik zawierający substrat lucyferazy Renilla
Britelite plus Reporter Gene Assay SystemPerkin-Elmer6016761Odczynnik zawierający substrat lucyferazy świetlika. Może być stosowany jako alternatywa dla odczynnika Brigh-Glo do określania aktywności lucyferazy.
Test żywotności

Bibliografia

  1. De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
  2. Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
  3. Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).
  4. Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virol. 79, 1943-1947 (2005).
  5. Wang, B. X., Fish, E. N. The yin and yang of viruses and interferons. Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).
  6. Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).
  7. Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. Systems biology and the host response to viral infection. Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).
  8. Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics. Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).
  9. Connolly, D. J., O'Neill, L. A. New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics. Curr Opin Pharmacol. , (2012).
  10. Thakur, C. S., et al. Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).
  11. Shoji-Kawata, S., et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature. 494, 201-206 (2013).
  12. Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).
  13. Bonavia, A., et al. Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV). Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).
  14. Rider, T. H., et al. Broad-spectrum antiviral therapeutics. PLoS One. 6, (2011).
  15. Krumm, S. A., et al. Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases. PLoS One. , (2011).
  16. Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).
  17. Harvey, R., et al. GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity. Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).
  18. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).
  19. Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE. J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).
  20. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).
  21. Panchal, R. G., et al. Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens. J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).
  22. Pohjala, L., et al. Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays. PLoS One. 6, (2011).
  23. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).
  24. Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol. 17, 646-657 (2010).
  25. Komarova, A. V., et al. Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses. Mol Cell Proteomics. , (2011).
  26. Henrik Gad, H., et al. The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry. Virology. 434, 27-37 (2012).
  27. Wang, Q. Y., et al. Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis. J Virol. 85, 6548-6556 (2011).
  28. Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).
  29. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
  30. Qing, M., et al. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).
  31. Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses. J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).
  32. Yoon, J. J., et al. High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors. J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).
  33. Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , Springer. (2011).
  34. Gentzsch, J., et al. Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity. Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).
  35. Caignard, G., et al. The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells. PLoS One. 8, (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

leki przeciwwirusowe o szerokim spektrum działaniahamowanie wirusów RNAtesty z wykorzystaniem wirusów rekombinowanychsystem reporterowy lucyferazytest żywotności komórekanaliza zależności dawka-odpowiedźprzesiewanie bibliotek związków chemicznychidentyfikacja związków przeciwwirusowychredukcja efektu cytopatycznego
Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w kierunku chemicznych inhibitorów wirusów RNA o szerokim spektrum działania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.