Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Drosophila okazała się użytecznym modelem do analizy zachowania, w tym lotu. Początkowy test lotu polegał na wrzucaniu much do pokrytego olejem cylindra z podziałką; Wysokość lądowania stanowiła miarę osiągów lotu poprzez ocenę, jak daleko muchy spadną przed wytworzeniem ciągu wystarczającego do zetknięcia się ze ścianką cylindra. Poniżej opisujemy zaktualizowaną wersję testera lotu z czterema głównymi ulepszeniami. Po pierwsze, dodaliśmy "rurkę zrzutową", aby zapewnić, że wszystkie muchy wchodzą do cylindra lotu z podobną prędkością między próbami, eliminując zmienność między użytkownikami. Po drugie, zastąpiliśmy powłokę olejową zdejmowanymi arkuszami z tworzywa sztucznego pokrytymi Tangle-Trap, klejem przeznaczonym do wychwytywania żywych owadów. Po trzecie, używamy dłuższego cylindra, aby umożliwić dokładniejszą dyskryminację zdolności lotu. Po czwarte, używamy aparatu cyfrowego i oprogramowania do obrazowania, aby zautomatyzować ocenę wydajności lotu. Ulepszenia te pozwalają na szybką, ilościową ocenę zachowania podczas lotu, co jest przydatne w przypadku dużych zbiorów danych i badań genetycznych na dużą skalę.
Wprowadzenie
Drosophila od dawna jest wykorzystywana do badania genetycznych podstaw zachowania1, a badacze opracowali wiele sposobów na analizę różnych typów zachowań2-6. Muchy okazały się szczególnie przydatne w dostarczaniu użytecznych modeli zaburzeń nerwowo-mięśniowych7. Powszechnym testem stosowanym do badania zachowań lokomotorycznych jest wydajność lotu. Oryginalny tester lotu jest przydatny do identyfikacji mutantów z wadami lotu i do ilościowej oceny zdolności do lotu1, ale ma kilka wad, które ograniczają jego zastosowanie w przypadku przesiewaczy o wysokiej przepustowości: stosowanie cylindrów pokrytych olejem jest niechlujne i kłopotliwe, niektóre cechy, takie jak długość cylindra i wprowadzanie much do rurki ze zmienną siłą, zmniejszają dokładność ilościową; I trudno jest odzyskać żywe muchy z testera. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zmodyfikowaliśmy tester lotu tak, aby zawierał szereg ulepszeń. Dodaliśmy "rurkę zrzutową", aby wprowadzić muchy, aby wyeliminować zmienność między eksperymentami i użytkownikami. Używamy zdejmowanych arkuszy akrylowych pokrytych klejem, który pozwala na łatwiejsze czyszczenie i odzyskiwanie pojedynczych much. Zwiększyliśmy długość rury przelotowej, aby poprawić dokładność ilościową i niezawodność. Na koniec używamy aparatu cyfrowego i oprogramowania do obrazowania do obliczania wysokości lądowania much. Wierzymy, że te ulepszenia będą przydatne dla każdego laboratorium zainteresowanego przeprowadzaniem badań genetycznych na dużą skalę pod kątem defektów w locie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Montaż testera lotu
- Przymocuj cylinder rozruchu do stojaka pierścieniowego 1 za pomocą łańcucha clamps. (Pozostaw około 3 cm pod cylindrem na naczynie do ważenia.)
(Uwaga: Używany przez nas cylinder lotu ma 90 cm długości i średnicę 13,5 cm.) - Włóż szalkę wagową z cienką warstwą oleju mineralnego pod cylinder rozlotowy.
- Przymocuj lejek do stojaka pierścieniowego 2 za pomocą pierścienia clamp i pazur clamp. Wyreguluj wysokość lejka tak, aby dno lejka zlicowało się z górną częścią cylindra zgarniacza. (Uwaga: średnica końcówki lejka musi być mniejsza niż średnica zewnętrzna fiolek umieszczonych w probówkach wkraplanych, tak aby fiolki nie wypadły.)
- Włóż rurkę kroplową do górnej części lejka i zabezpiecz za pomocą zacisku pazurowego.
(Uwaga: Używamy rurki opadającej o długości 25 cm. Upuszczenie fiolek zawierających muchy z tej wysokości pozwala na konsekwentne wyrzucanie wszystkich much z jednolitą siłą. Wewnętrzna średnica rurki wkroplowej powinna być nieco większa niż zewnętrzna średnica fiolki, aby umożliwić swobodne opadanie fiolki.) - Przytnij arkusz(e) poliakryloamidu do odpowiedniego rozmiaru. (Uwaga: Aby ułatwić wkładanie i wyjmowanie arkusza, szerokość powinna być nieco mniejsza niż wewnętrzny obwód cylindra rozlotu).
- Nałóż cienką warstwę Tangle-Trap na arkusz. Pozostaw na 1 godzinę przed użyciem. (Uwaga: Pozostaw wystarczająco dużo miejsca na górze i na dole arkusza (około 3 cm) niepowlekanego, aby chwycić arkusz do włożenia/wyjęcia.)
- Włóż arkusz poliakryloamidu do cylindra wylotowego.
- Zamontuj szynę kamery za pomocą sosnowych wsporników. (Uwaga: upewnij się, że dolna część szyny może podeprzeć kamerę bez blokowania obiektywu. Patrz rysunek 1B.)
- Dodaj korki i przykręć. (Uwaga: umieść korki w miejscach, które pozwolą aparatowi view cały plastikowy arkusz w trybie panoramicznym.)
2. Uruchom eksperyment
- Zbierz fiolki z muchami do testu. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy użyć nie więcej niż 20 much na fiolkę.
- Delikatnie postukać muchy w dno fiolki, odłączyć, a następnie włożyć do rurki spustowej i zwolnić fiolkę.
(Uwaga: Fiolka spada w dół rurki właściwej, aż uderzy w wąski otwór lejka. Kiedy fiolka uderza w lejek, muchy są wyrzucane do cylindra lotowego.) - Podnieść rurkę właściwą, aby wyjąć pustą fiolkę.
(Uwaga: Wiele fiolek z muchami z tej samej grupy testowej można oznaczyć na jednym arkuszu poliakryloamidu. Okazuje się, że do 200 much (10 fiolek po 20 much każda) można łatwo przetestować i zobrazować na jednym arkuszu. - Usuń plastikowy arkusz i połóż go na płaskiej białej powierzchni.
(Uwaga: biała tablica plakatowa może być użyta, jeśli blaty są w ciemnym kolorze.) - Zamontuj szynę kamery na plastikowym arkuszu. Kamera powinna znajdować się wystarczająco wysoko nad arkuszem, aby zarówno górna, jak i dolna część arkusza znajdowała się w polu widzenia.
- Przesuń kamerę po ścieżce, przytrzymując przycisk "przechwytywania", aby uzyskać zdjęcie panoramiczne.
- Liczba much lądujących w oleju może być liczona ręcznie dla każdej próby.
- Powtórz kroki 2.2-2.7 dla wszystkich warunków w danym eksperymencie. Muchy można usunąć z prześcieradła między każdą próbą. Alternatywnie można użyć kilku arkuszy, z nowym arkuszem dla każdej próby.
3. Zbieranie danych
- Otwórz pliki obrazów za pomocą oprogramowania ImageJ.
- W razie potrzeby przytnij obrazy, aby uwzględnić tylko obszar lądowania. (To jest obszar pokryty Tangle-Trap.)
- Konwertuj obrazy na 8-bitową skalę szarości.
- Utwórz "Próg", aby odfiltrować białe tło.
(Obraz → Dostosuj próg →). - Ustaw parametry, aby zidentyfikować każdą muchę za pomocą menu "analizuj cząstki".
(Analizuj → analizuj cząstki) Zdefiniuj parametry używane do identyfikacji cząstki. Po naszej konfiguracji stwierdziliśmy, że użycie obszaru 5-90 pikseli2 i okrągłości 0,4-1,0 pozwoli dokładnie zidentyfikować wszystkie próbki. - Zmierz położenie każdej muchy, korzystając z wygenerowanej listy współrzędnych dla każdej cząstki. Współrzędną x w pikselach można przekonwertować na centymetry, aby obliczyć wysokość spocznika.
- Zaimportuj tabelę do arkusza kalkulacyjnego (takiego jak Microsoft Excel).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1A przedstawia schemat zaktualizowanego zestawu do testowania lotu. Rysunek 1B ilustruje konstrukcję szyny umożliwiającą kamerze wykonanie obrazu panoramicznego bez blokowania pola widzenia. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 2, gdzie porównano wydajność lotu much mutantów slowpoke, u których występuje znana wada lotu8-10, z muchami typu dzikiego Canton-S. Muchy kontrolne konsekwentnie lądują w pobliżu górnej części cylin...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Korzystając z opisanych tutaj metod, byliśmy w stanie szybko ocenić wydajność lotu dużej liczby mutantów Drosophila , zapewniając większą wydajność niż było to wcześniej możliwe. W naszych eksperymentach rutynowo oddzielamy samce i samice i hodujemy je w niskiej gęstości (mniej niż 20 much na fiolkę), aby ograniczyć agresję, która mogłaby uszkodzić skrzydła. Inną ważną kwestią jest prawidłowa kontrola różnic w osiągach lotu wynikających z różnic w pochodzeniu genetycznym. Odkryliśmy również, że pomaga to pozwoli...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health F32 NS078958 (DTB) i R01 AG033620 (BG).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szpachelka | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Formowanie tylnej taśmy sosnowej (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Powłoka | BioControl Network | 268941www.biconet.com | |
| Laptop | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Olej mineralny | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| Biała tablica plakatowa | Staples | 247403www.staples.com | |
| Polistyrenowe naczynie wagowe | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Aparat cyfrowy | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Kleszcze Fine | Science Tools | www.finescience.com | |
| Butla z poliwęglanu (rura kroplowa) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Cylinder lotny (akrylowy) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Płyty poliwęglanowe | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| stojak na pierścienie (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Wspornik pierścieniowy | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Zaciski przedłużające z trzema bolcami (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Lejek | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| zaciski łańcuchowe (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Fiolki szklane | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
Bibliografia
- Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504(2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192(2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155(2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795(2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193(2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
