Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

34.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51228

⸱

14 września 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Structural Biology, Max Planck Institute of Biophysics

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Streszczenie

Kriotomografia elektronowa to potężne narzędzie w biologii strukturalnej, zdolne do wizualizacji trójwymiarowej struktury próbek biologicznych, takich jak komórki, organelle, pęcherzyki błonowe czy wirusy na szczegółach molekularnych. Aby to osiągnąć, wodna próbka jest szybko zeszklona w ciekłym ETANIE, który zachowuje ją w stanie zbliżonym do natywnego, zamrożonego i uwodnionego. W mikroskopie elektronowym rejestrowane są serie nachylenia w temperaturze ciekłego azotu, na podstawie których rekonstruowane są tomogramy 3D. Stosunek sygnału do szumu objętości tomograficznej jest z natury niski. Rozpoznawalne, powtarzające się cechy są wzmacniane przez uśrednianie subtomogramowe, za pomocą którego poszczególne podobjętości są wycinane, wyrównywane i uśredniane w celu zmniejszenia szumu. W ten sposób można uzyskać mapy 3D o rozdzielczości 2 nm lub lepszej. Dopasowanie dostępnych struktur o wysokiej rozdzielczości do objętości 3D tworzy następnie modele atomowe kompleksów białkowych w ich naturalnym środowisku. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystujemy kriotomografię elektronową do badania organizacji in situ dużych kompleksów białek błonowych w mitochondriach. Odkrywamy, że syntazy ATP są zorganizowane w rzędy dimerów wzdłuż silnie zakrzywionych wierzchołków błony wewnętrznej, podczas gdy kompleks I jest losowo rozmieszczony w regionach błony po obu stronach rzędów. Poprzez uśrednianie subtomogramu uzyskano strukturę mitochondrialnego dimeru syntazy ATP w błonie grzebieniowej.

Wprowadzenie

Mitochondria to elektrownie komórki. Przekształcając elektrochemiczny gradient protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną w energię wiązania chemicznego, mitochondrialna syntaza ATP wytwarza większość ATP, która napędza procesy komórkowe. Aby zrozumieć mechanizmy stojące za konwersją energii mitochondrialnej, musimy określić strukturę syntazy ATP in situ oraz dowiedzieć się, w jaki sposób jest ona ułożona i rozprowadzona w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Chociaż dostępne są struktury o wysokiej rozdzielczości większości mitochondrialnych składników syntazy ATP1-3 i mapy o niskiej rozdzielczości całego kompleksu4, ważne jest ustalenie struktury i konformacji enzymu roboczego w błonie. Powszechnie zakłada się, że rozkład syntazy ATP w wewnętrznej błonie mitochondrialnej jest losowy, ale wczesneodkrycie5 i nasze własne wstępnewyniki6 wskazują, że tak nie jest. Późniejsze badania naszej grupy i innych7 potwierdziły, że syntaza ATP jest ułożona w długich rzędach dimerów wzdłuż ciasno zakrzywionych grzbietów wewnętrznej błony mitochondrialnej cristae8, podczas gdy pompy protonowe łańcucha transportu elektronów wydają się znajdować po obu stronach rzędów9. Taki układ ma ważne implikacje dla mechanizmów mitochondrialnej konwersji energii.

Techniką, której użyliśmy do określenia tego układu, jest kriotomografia elektronowa (cryo-ET). Cryo-ET jest obecnie jedyną metodą, która zapewnia dokładne trójwymiarowe (3D) objętości komórek, przedziałów komórkowych lub organelli w rozdzielczości molekularnej. Cryo-ET jest szczególnie przydatny do badania dużych kompleksów w błonach biologicznych, ponieważ błony pojawiają się z dobrym kontrastem i są łatwe do prześledzenia w objętościach tomograficznych 3D.

Inne metody badania struktury 3D komórek lub organelli nie dostarczają szczegółów molekularnych. Mikroskopia świetlna o wysokiej rozdzielczości10,11 doskonale ujawnia położenie lub odległości między znacznikami emitującymi światło przyczepionymi do interesujących białek z dokładnością do dziesiątek nm, ale nie ujawnia struktury samego białka, nawet w niskiej rozdzielczości. Transmisyjna mikroskopia elektronowa odcinków szeregowych12 lub obrazowanie blokowe za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej13 próbek biologicznych osadzonych w tworzywach sztucznych zapewnia widoki objętości komórkowych o niskiej rozdzielczości, ale również nie ujawnia szczegółów molekularnych. Mikroskopia sił atomowych14 może w zasadzie zapewnić rozdzielczość molekularną, a nawet atomową, ale tylko na powierzchni obiektów na atomowo płaskim, stałym podłożu. Wreszcie, tomografiarentgenowska15 lub rozpraszanie intensywnych impulsów promieniowania rentgenowskiego z laserów na swobodnychelektronach16 prawdopodobnie nie ujawni struktury dużych, złożonych, aperiodycznych obiektów, takich jak całe komórki lub organelle w rozdzielczości molekularnej w dającej się przewidzieć przyszłości. W związku z tym obecnie nie ma alternatywy dla cryo-ET do badań struktury 3D komórek lub organelli w rozdzielczości nanometrowej.

Cryo-ET to metoda z wyboru do badania struktury i konformacji zespołów białek związanych z błoną, w tym kompleksu porów jądrowych17, kompleksów kolców grypy18 i białek motorycznych wici22,23, ale także organizacji całych komórek bakteryjnych19 i wnikania wirusów chorobotwórczych, takich jak HIV, do komórek20-23. Cryo-ET jest nieoceniony w wizualizacji białek nitkowatych i ich interakcji w komórce, w tym filamentów aktynowych24 lub aksonemów25. Rozdzielczość można zwiększyć do 2 nm lub lepiej przez subtomogram o średniej26, przy czym podobjętości powtarzających się, regularnych cech są wycinane z objętości tomograficznej i uśredniane za pomocą technik przetwarzania obrazu pojedynczej cząstki.

Cryo-ET polega na pozyskiwaniu serii obrazów projekcyjnych cienkiej próbki (<250nm) wykonanych pod różnymi kątami nachylenia w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM). Próbka musi być cienka, aby elektrony, które silnie oddziałują z materią, były rozpraszane nie więcej niż raz. Wielokrotne rozpraszanie sprawia, że powstałe obrazy są trudne do interpretacji i zmniejsza kontrast. Obrazy wybranego obszaru próbki są wyrównywane względem siebie i rzutowane w przestrzeń 3D przez odpowiedni program komputerowy, generując objętość 3D próbki. Wyrównanie obrazów jest wspomagane przez złote znaczniki referencyjne, które są mieszane z próbką przed zamrożeniem. Idealnie byłoby, gdyby na każdym obrazie znajdowało się 10 lub więcej równomiernie rozmieszczonych znaczników odniesienia, aby uzyskać dobre wyrównanie.

Aby obserwować szczegóły molekularne, próbki są zamrażane w ciekłym etanie, który zachowuje ich naturalny stan uwodnienia. Zamrażanie w ciekłym etanie jest tak szybkie (~105 °C/s)27, że woda nie krystalizuje, ale pozostaje w stanie zeszklonym, podobnym do szklistego. Tworzenie się kryształków lodu uszkadza wrażliwe struktury biologiczne. Ponieważ próbki biologiczne cierpią z powodu uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, istnieje ograniczenie całkowitej liczby zdarzeń rozpraszania, które próbka może tolerować. Obrazy są zatem pozyskiwane w trybie niskiej dawki: obszar zainteresowania jest identyfikowany przy małym powiększeniu (1 500X) z dawką elektronów poniżej 1 e-/nm2 (tryb wyszukiwania). Obraz jest następnie ustawiany pod kątem większego powiększenia, poza obszarem zainteresowania (tryb ostrości). Dopiero po uzyskaniu obrazu obszar zainteresowania jest naświetlany wyższą dawką elektronów (tryb ekspozycji).

Tutaj prezentujemy przegląd sposobu zbierania i przetwarzania kriotomogram elektronowych, używając jako przykładu dimerów syntazy ATP w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Poniższy protokół opisuje, jak przygotować mitochondria do krio-ET, jak skonfigurować i zebrać serię pochylenia z określoną całkowitą dawką elektronów oraz jak przetworzyć serię przechyłu w celu uzyskania objętości 3D obszaru zainteresowania. Przegląd procedury przedstawiono na rysunku 1.

Protokół

1. Przygotowanie mitochondriów z komórek lub tkanek przez wirowanie różnicowe

Ta sekcja opisuje ogólną procedurę izolacji nienaruszonych mitochondriów od różnych organizmów eukariotycznych. Precyzyjne składniki buforowe i prędkości wirowania muszą być zoptymalizowane dla każdej badanej tkanki/gatunku.

  1. Rozbij komórki w buforze izotonicznym (np. 250 mM sacharozy, 10 mM HEPES pH 7,4), używając młynka z kulkami szklanymi (grzybnia)28, enzymatycznego trawienia ściany komórkowej (Saccharomyces cerevisiae)29, homogenizatora z łożyskiem kulkowym (jednokomórkowe eukarionty/komórki hodowlane/nicienie)30 lub mieszalnika (tkanki zwierzęce lub roślinne)31.
  2. Usunąć resztki komórek przez filtrację przez muślin, a następnie odwirowanie na niskiej prędkości (2 000 x g, 4 °C, 10 min).
  3. Zebrać mitochondria sklarowanego osadu i osadu przez szybkie wirowanie (9 000 x g, 4 °C, 10 min).
  4. W razie potrzeby należy zastosować stopniowy gradient gęstości izotonicznej w celu dodatkowego oczyszczenia frakcji mitochondrialnej32.

2. Przygotowanie mitochondriów do kriotomografii elektronowej

Poniższa sekcja opisuje, jak uzyskać zamrożone próbki do cryo-ET. UWAGA: Metoda polega na użyciu bardzo zimnego ciekłego azotu i etanu, które mogą powodować poważne oparzenia skóry. Należy nosić okulary ochronne i rękawice krioochronne. Ciekły etan, który jest również łatwopalny, musi być przenoszony w dygestorium.

  1. Zawiesić granulowane mitochondria w 250 mM trehalozie, 10 mM buforze HEPES o pH 7,4 do stężenia około 5 mg/ml białka całkowitego.
  2. Żarowo-wyładowcze dziurawe siatki węglowe EM, stroną węglową do góry, w urządzeniu próżniowym zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Skroplić kilka mililitrów etanu, kierując strumień gazowego etanu na wewnętrzną stronę aluminiowego pojemnika chłodzonego ciekłym azotem.
  4. Zmieszaj zawiesinę fiducialną złota sprzężoną z białkiem A w stosunku 1:1 z zawiesiną mitochondrialną i natychmiast nałóż 3 μl na siatkę EM z wyładowaniami jarzeniowymi trzymaną w pęsetie.
  5. Umieść pęsetę w urządzeniu do witryfikacji, np. domowej gilotynie. Zetrzyj nadmiar cieczy klinem bibuły filtracyjnej (~5 sekund lub do momentu, gdy ciecz przestanie się rozprzestrzeniać) i natychmiast zanurz siatkę w ciekłym etanie, zwalniając spust.
  6. Przenieś siatkę z ciekłego etanu na ciekły azot. Podczas przenoszenia usuń nadmiar etanu z siatki za pomocą bibuły filtracyjnej. Umieść końcówkę kawałka bibuły filtracyjnej w kształcie klina w ciekłym etanie. Gdy ciekły etan unosi się, delikatnie przeciągnij siatkę w górę bibuły filtracyjnej, ale utrzymuj ją poniżej czoła cieczy. Ciekły etan jest usuwany z siatki przez działanie kapilarne, a po usunięciu całego ciekłego etanu natychmiast przenosi siatkę do ciekłego azotu.
  7. Umieść zeszkloną siatkę w siatkowym pojemniku do przechowywania i przechowuj w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania, jeśli jest to właściwe.

3. Nagrywanie serii tomograficznych pochyleń

Poniższa sekcja opisuje, jak skonfigurować i zebrać serię tomografii mitochondrium za pomocą mikroskopu elektronowego Polara wyposażonego w filtr energetyczny po kolumnie i kamerę CCD. Podobne protokoły są stosowane we wszystkich kriomikroskopach elektronowych wyposażonych w kamery CCD lub bezpośrednie detektory elektronów.

  1. Wyrównaj mikroskop
    1. Umieść próbkę do badań, np. grafit i złote wyspy na dziurawej folii węglowej.
    2. Wybierz tryb wyszukiwania w systemie niskiej dawki mikroskopu.
    3. Doprowadź próbkę na wysokość eucentryczną. Jest to punkt minimalnego ruchu xy podczas przechylania uchwytu próbki. Wyśrodkuj punkt zainteresowania przy nachyleniu 0°, przechyl stół montażowy pod kątem 20° i ponownie wyśrodkuj punkt, zmieniając wysokość z. Wróć do 0° i powtarzaj, aż przesunięcie boczne zostanie zminimalizowane.
    4. Wybierz tryb ekspozycji. Wybierz żądane powiększenie do pobrania tomogramu (np. 25 000X na detektorze ≈ rozmiar piksela próbki 0,6 nm).
    5. Wybierz małą aperturę kondensora (50-70 mm) i wybierz rozmiar plamki oraz intensywność wiązki tak, aby wiązka była nieco szersza niż urządzenie do obrazowania i dawała odczyt pikseli na poziomie 60 e-/piksel (CCD) lub 14 e-/piksel/s (bezpośredni detektor elektronów, tryb zliczania).
    6. Centralna apertura kondensatora.
    7. Znajdź ostrość gaussowską, np. punkt o minimalnym kontraście. Zresetuj odczyt rozmycia mikroskopu i popraw punkty obrotu oraz środek obrotu zgodnie z instrukcjami producenta.
    8. Wybierz żądaną koncentrację do nagrywania tomogramu. UWAGA: Wysokie rozmycie (8 μm) zwiększa kontrast, ale zmniejsza rozdzielczość, podczas gdy niskie rozmycie (2-4 μm) zwiększa rozdzielczość kosztem kontrastu.
    9. Nad pustym otworem wygeneruj nowe odniesienie wzmocnienia i ustaw filtr energii zgodnie z instrukcjami producenta.
    10. Dostosuj tryby wyszukiwania i ekspozycji. W trybie ekspozycji wyśrodkuj punkt zainteresowania i przełącz się w tryb wyszukiwania. Wybierz powiększenie 1,500X (0,033 μm/piksel próbki na detektorze) i rozmycie 100 μm (dla zwiększenia kontrastu). Przenieś punkt zainteresowania z powrotem na środek za pomocą cewek przesunięcia obrazu.
    11. W trybie wyszukiwania dostosuj rozmiar plamki i intensywność wiązki tak, aby wiązka była nieco szersza niż urządzenie do obrazowania i dawała odczyt pikseli na poziomie ~20 e-/piksel (CCD) lub ~8 e-/piksel/s (bezpośredni detektor elektronów, tryb zliczania).
  2. Znajdowanie dobrego obszaru próbki
    1. Włóż siatkę z zamrożonymi mitochondriami uwodnionymi do mikroskopu elektronowego w temperaturze ciekłego azotu (patrz instrukcje producenta EM).
    2. W trybie wyszukiwania przeszukaj siatkę w poszukiwaniu obszarów o odpowiedniej grubości lodu i jakości próbki. Zrób 6-sekundowe wyszukiwanie obrazu obiecujących obszarów, aby określić przydatność do zbierania tomografów. Zarówno wewnętrzna, jak i zewnętrzna błona mitochondrialna powinny być widoczne w tym powiększeniu.
  3. Nagrywanie serii tomograficznych pochyleń
    1. Po znalezieniu dobrego obszaru próbki przechyl stolik ±60°, aby określić maksymalny zakres nachylenia, który jest dostępny bez żadnych przeszkód w ekspozycji lub obszarze ostrości przez paski siatki lub bryły lodu.
    2. Na pobliskiej wypełnionej lodem o podobnym wyglądzie zmień tryb ekspozycji na tryb ekspozycji i dostosuj intensywność wiązki lub czas akwizycji obrazu tak, aby każdy zarejestrowany obraz miał dawkę elektronów 30-50 e-/piksel dla CCD lub 6-8 e-/pixel/s bezpośrednich detektorów elektronów, tryb zliczania.
    3. Obliczyć stosunek rozkładu dawki (I0/I60), dzieląc średnią liczbę elektronów dla obrazu uzyskanego w ciągu 1 sekundy w temperaturze 0° przez liczbę elektronów uzyskanego w obrazie 60°. Współczynnik ten opisuje wydłużenie czasu ekspozycji wymaganego do utrzymania stałej liczby elektronów na obraz wraz ze wzrostem kąta nachylenia (czas ekspozycji = 1/cos(α)n, gdzie (I0/I60)=2n). Stosunek ten służy również jako dobry wskaźnik grubości lodu. Dobre tomogramy mitochondriów są zwykle rejestrowane z I0/I60 = 2,3-2,6.
    4. Nad pustym otworem uzyskaj obraz z 1 sekundy w trybie ekspozycji i zanotuj liczbę elektronów na A2. Biorąc pod uwagę stosunek rozkładu dawki, należy obliczyć całkowitą liczbę obrazów, które można zarejestrować dla określonej całkowitej dawki elektronów (np. <40 e-/Å2 dla określenia struktury i ~160 e-/Å2 dla morfologii).
    5. Określić odpowiedni przedział pochylenia dla zbierania tomogramu, dzieląc całkowity zakres pochylenia (np. 120° dla ±60°) przez całkowitą liczbę obrazów obliczoną w ppkt 3.3.4.
  4. Ustawić i zapisać tomogram o parametrach określonych powyżej za pomocą odpowiedniego oprogramowania do automatycznego zbierania danych33,34. Serie pochylenia są zwykle rozpoczynane pod kątem ±20° i przechodzą przez 0° przed osiągnięciem wysokich pochyleń, aby zmaksymalizować zawartość informacyjną obrazów o niskim nachyleniu, które są niszczone przez zwiększanie dawki elektronów.

4. Tworzenie i segmentacja tomograficznych objętości

Ta sekcja opisuje, jak objętości tomograficzne mitochondriów są generowane z serii pochyleń i jak te objętości są obecne do ogólnego oglądania.

  1. Zapisz serię pochyleń tomograficznych w odpowiednim katalogu. Wygeneruj stos obrazów i przekonwertuj go na odpowiedni format pliku za pomocą oprogramowania typu open source, takiego jak dm2mrc lub tif2mrc (pakiet IMOD), które konwertuje pliki .dm3, .dm4 lub .tif na stosy mrc. Do rekonstrukcji tomograficznej za pomocą IMOD35 wymagane są stosy mrc. Inne pakiety wymagają różnych formatów.
  2. Wyrównaj obrazy i wygeneruj tomogram, wykonując czynności opisane w samouczku IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html).
  3. Zwiększ kontrast tomogramu za pomocą nieliniowego anizotropowego filtra dyfuzyjnego rozprowadzanego za pomocą IMOD. Filtr ten działa dobrze w przypadku membran i cząstek związanych z błoną, takich jak syntaza ATP.
  4. W celu wizualizacji należy ręcznie podzielić tomogram na segmenty za pomocą dostępnych na rynku programów, np. Amira. Przypisz woksele odpowiadające błonie wewnętrznej lub zewnętrznej i wygeneruj powierzchnię. Korzystając z opcji clicker we wtyczce EM-package dla AMIRA36, zaznacz lokalizację cząsteczek syntazy ATP.

5. Subtomogram: Uśrednianie dimerów syntazy ATP i dopasowywanie struktur rentgenowskich

Poniższa sekcja opisuje, jak można uzyskać średnie subtomogramowe dimerów syntazy ATP.

  1. Korzystając z oznaczonych cząstek jako danych wejściowych i odpowiedniego pakietu oprogramowania, takiego jak program "Szacowanie cząstek dla tomografii elektronowej", oblicz średnią subtomogramową.
  2. Aby uzyskać oszacowanie rozdzielczości, porównaj dwie niezależnie wyznaczone średnie subtomogramu za pomocą korelacji powłoki Fouriera37.
  3. Jeśli to możliwe, zadokuj znane struktury rentgenowskie do średniej subtomogramu za pomocą dopasowania korpusu sztywnego, ręcznie lub przy użyciu automatycznych procedur sekwencyjnego dokowania, takich jak te w programie Chimera38.

Wyniki

Kriotomogramy elektronowe mitochondriów wyraźnie ukazują morfologię 3D tego organellum (Rysunek 2). Ręczna segmentacja błon w wolumenie tomograficznym ilustruje strukturę grzebieni w mitochondrium. Poprzez obrazowanie mitochondriów z różnych szczepów drożdży z nokautem, którym brakuje określonych komponentów białkowych, można ocenić wpływ tych białek na morfologię grzebieni. Rysunek 3 przedstawia mitochondrium ze szczepu drożdży pozbawionego podjednostki e syntazy ATP. Ten komponent kompleksu syntazy ATP jest niezbędny do dimeryzacji mitochondrialnej syntazy ATP. Mitochondria z tego szczepu nie posiadają typowych blaszkowatych grzebieni charakterystycznych dla mitochondriów typu dzikiego (Rysunek 2), lecz zamiast tego zawierają szereg przedziałów błony wewnętrznej. Przedziały te są albo pozbawione grzebieni, albo zawierają niewielkie, balonowate inwaginacje błony (Rysunek 3).

W tomogramach o dobrym kontraście duże kompleksy białek mitochondrialnych, w tym przypadku dimery syntazy ATP, są łatwo widoczne (Rycina 4; Film 1). Struktury tych kompleksów można wyznaczyć z rozdzielczością 2-3 nm za pomocą uśredniania subtomogramów (Rycina 5; Film 2). Średnie wolumeny można ponownie umieścić w tomogramie, aby ocenić organizację poszczególnych kompleksów względem siebie oraz innych kompleksów białkowych w błonie (Rycina 6; Film 3).

Izolacja, mrożenie i krio-EM mitochondriów; schemat; proces: rozbicie komórek, tomografia.
Rysunek 1. Schemat blokowy przedstawiający etapy krio-tomografii elektronowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Struktura mitochondrium, tomografia i model 3D, błony wewnętrzna i zewnętrzna, grzebienie, macierz z opisami.
Rycina 2. Morfologia mitochondrium z dzikiego typu S. cerevisiae. Przekrój centralny przez wolumen tomograficzny mitochondrium dzikiego typu S. cerevisiae (lewo) oraz odpowiadający mu wolumen z renderowaniem powierzchni (prawo). Segmentowany wolumen błony zewnętrznej przedstawiono w kolorze szarym, a wolumeny błony wewnętrznej i grzebieni w kolorze jasnoniebieskim. Adaptacja z Davies et al8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Schemat budowy mitochondrium, z zaznaczonymi błonami, grzebieniami i macierzą; porównanie z mikroskopią elektronową.
Rycina 3. Mitochondrium z szczepu S. cerevisiae pozbawionego podjednostki niezbędnej do dimeryzacji syntazy ATP. Przekrój przez objętość tomograficzną (po lewej) oraz towarzysząca rekonstrukcja powierzchniowa objętości (po prawej) mitochondrium ze szczepu S. cerevisiae pozbawionego podjednostki białkowej e niezbędnej do dimeryzacji syntazy ATP. W porównaniu z Rycina 2, mitochondrium ze szczepu mutanty nie posiada prawidłowych lamelarnych grzebieni charakterystycznych dla mitochondriów typu dzikiego. Zamiast tego, mitochondrium posiada wiele przedziałów błony wewnętrznej, które nie mają grzebieni lub posiadają grzebienie w kształcie balonów. W ten sposób kriotomografia elektronowa uwydatnia zmiany w morfologii błon wynikające z delecji genów. Adaptacja z Davies et al8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Mikroskopia elektronowa chloroplastu z lokalizacjami syntazy ATP, schemat wskazujący miejsca syntezy energii.
Rysunek 4. Mitochondrium grzyba P. anserina. Przekrój przez wolumen tomograficzny (lewo) oraz towarzysząca renderowana powierzchnia wolumenu (prawo) mitochondrium nitkowatego grzyba P. anserina. W tym tomogramie rzędy cząsteczek o rozmiarze 10 nm (żółte groty strzałek) znajdują się nad silnie zakrzywionymi grzbietami błony w grzebieniach błony wewnętrznej (patrz Film 1). Cząsteczki te zostały zidentyfikowane jako dimery syntazy ATP za pomocą uśredniania subtomogramów. Z Davies et al9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Schemat struktury białka przedstawiający konfigurację molekularną, miejsca wiązania i oddziaływania.
Rycina 5. Struktura i organizacja mitochondrialnej syntazy ATP. Widok z boku i z góry przedstawiający gęstość elektronową dimeru syntazy ATP z S. cerevisiae wyznaczoną metodą uśredniania subtomogramów z dopasowanymi modelami atomowymi (po lewej). Pęcherzyk wewnętrznej błony mitochondrialnej pokazujący organizację dimerów syntazy ATP w rzędach (po prawej). Rycina została wygenerowana poprzez umieszczenie średniej z subtomogramów dimeru syntazy ATP w segmentowanej objętości pęcherzyka błonowego, przy użyciu współrzędnych obliczonych podczas uśredniania. Adaptacja z Davies et al8. Modele atomowe: F1/pierścień rotora [PDB:2WPD]39 (niebieski i fioletowy); białko OSCP wrażliwe na oligomycynę [PDB:2BO5]40 (zielone); fragment bocznego ramienia [PDB:2CLY]1 z resztami N-końcowymi z [PDB:2WSS]2 (żółty i czerwony) (patrz Film 2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Schemat Cryo-EM układu mikrotubul; analiza strukturalna 3D ujawniająca oddziaływania białkowe.
Rysunek 6. Izolowany pęcherzyk grzebieniowy z mitochondrium P. anserina. Przekroje z wolumenu tomograficznego (po lewej) oraz towarzyszący wolumen z renderowaniem powierzchni (po prawej) pęcherzyka grzebieniowego z P. anserina. Wyraźnie widoczne są gęstości białkowe wystające z błony. Gęstości wskazane żółtymi grotami strzał to dimery syntazy ATP, zidentyfikowane metodą uśredniania subtomogramów. Zielone groty strzał wskazują gęstości zidentyfikowane za pomocą znakowania przeciwciałami jako dehydrogenaza NADH (kompleks 1; szczegóły w9). Segmentacja gęstości białkowych ujawnia ich organizację w grzebieniach, gdzie dimery syntazy ATP (czerwone i żółte) tworzą rzędy wzdłuż silnie zakrzywionych krawędzi grzebieni, a kompleksy dehydrogenazy NADH (zielone) znajdują się w obszarach błony po obu stronach tych rzędów (patrz Film 3). Z Davies et al9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Film 1. Kriotomogram elektronowy mitochondrium P. anserina .Film przedstawia kolejne przekroje przez objętość tomograficzną mitochondrium grzyba nitkowatego P. anserina. Rzędy syntazy ATP zostały zaznaczone żółtymi grotami strzałek. Renderowana powierzchniowo, segmentowana objętość pokazuje rozmieszczenie syntazy ATP (żółte sfery) w odniesieniu do trójwymiarowej struktury grzebieni. Błona zewnętrzna – szara; wewnętrzna błona graniczna – przezroczysta niebieska; błony grzebieni – nieprzezroczyste niebieskie. Według Davies et al9. Patrz również Rysunek 4. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Film 2. Średnia subtomogramowa dimeru syntazy ATP mitochondrialnej z S. cerevisiae z dopasowanymi modelami atomowymi. Średnia została obliczona z 121 subwolumenów. Gęstość jest wyświetlana na trzech poziomach konturowych: 1s - siatka, 2s - jasnoszary i 3s - ciemnoszary. Modele atomowe zostały dopasowane do gęstości przy użyciu procedury sekwencyjnego dopasowania w programie Chimera. Modele atomowe: F1/pierścień rotora [PDB:2WPD]39 (niebieski i fioletowy); białko OSCP nadające wrażliwość na oligomycynę [PDB:2BO5]40 (zielony); fragment trzonu peryferyjnego [PDB:2CLY]1 z resztami N-końcowymi z [PDB:2WSS]2 (żółty i czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo.

Zaadaptowano z Davies et al8. Patrz również Rysunek 5.

Film 3. Izolowany pęcherzyk grzebieniowy z mitochondrium P. anserina. Przedstawiono kolejne przekroje przez objętość tomograficzną, a następnie segmentowaną objętość z renderowaniem powierzchni. Wyraźnie widoczne są gęstości białek wystające z błony. Czerwone i żółte gęstości to dimery syntazy ATP. Zielone gęstości to dehydrogenaza NADH (kompleks I), zidentyfikowana za pomocą znakowania przeciwciałami. Z Davies et al9. Zobacz również Rysunek 6. Kliknij tutaj, aby obejrzeć film.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół stanowi wprowadzenie do krio-ET i uśredniania mitochondriów metodą subtomogramu, ale zasadniczo tę samą procedurę można zastosować do każdego innego przedziału komórkowego lub błony. Aby uzyskać jak najlepsze dane, krytycznymi etapami procedury są przygotowanie próbki, proces zamrażania wgłębnego i strategia pozyskiwania danych. Jakość próbki, która ma kluczowe znaczenie dla sukcesu, zależy od zoptymalizowanego protokołu zamrażania, aby zapewnić odpowiednią grubość lodu, co ma ogromne znaczenie dla dobrego kontrastu obrazu. Optymalna strategia pozyskiwania danych zależy od urządzenia i próbki. Parametry, które należy zoptymalizować, obejmują dawkę elektronów na obraz, schemat nachylenia i rozmycie. Zaopatrzenie się w dobry tomogram dobrej próbki ułatwia wszystkie dalsze etapy przetwarzania i zapewnia zadowalający efekt końcowy.

Cryo-ET w połączeniu z uśrednianiem subtomogramu i dopasowaniem modelu atomowego dostarcza szczegółowych informacji na temat rozmieszczenia kompleksów białkowych w ich naturalnym środowisku komórkowym. Technika ta nadaje się również do badania struktury dużych błonowych kompleksów białkowych, takich jak superkompleksy łańcuchów oddechowych (1,7 MDa), dimery syntazy ATP (2x500 kDa) lub jądrowy kompleks porowy (~120 MDa)8,9,17. Organizacja dimerów syntazy ATP w rzędy nie może być obserwowana za pomocą technik o wysokiej rozdzielczości, takich jak krystalografia rentgenowska, NMR lub krio-EM z pojedynczą cząstką, ponieważ rzędy dimerów są zakłócane przez ekstrakcję detergentem, co jest niezbędnym krokiem w izolacji i oczyszczaniu kompleksów białek błonowych.

Ułożenie syntazy ATP w rzędach dimerów wzdłuż grzbietów cristae jest uniwersalną zasadą organizującą mitochondria u wszystkich gatunków. Kompleksy pompujące protony w łańcuchu transportu elektronów, w szczególności kompleks I (dehydrogenaza NADH), znajdują się w obszarach błony po obu stronach rzędów 8,9. Ta organizacja łańcucha oddechowego ma głęboki wpływ na bioenergetykę mitochondriów. Jeśli rzędy dimerów nie mogą się tworzyć z powodu braku podjednostek białkowych specyficznych dla dimerów, komórki wykazują dłuższy czas generacji i zmniejszoną sprawność komórkową, jak zaobserwowano w mutancie drożdży pokazanym na rysunku 341. Wraz z rosnącym zainteresowaniem chorobami mitochondrialnymi, szczegółowe zrozumienie molekularnych podstaw rządzącej ultrastrukturą i funkcją mitochondriów ma ogromne znaczenie. Kriotomografia elektronowa zapewnia powiązanie między strukturą białek określaną metodami o wysokiej rozdzielczości, a rozmieszczeniem i rozmieszczeniem tych białek w błonie w skali nanometrów. To sprawia, że cryo-ET jest niezbędnym narzędziem do zrozumienia struktury i funkcji mitochondriów w zdrowiu i chorobie.

Dalsze postępy techniczne i ulepszenia w cryo-ET obejmują strategie znakowania białek w celu identyfikacji pozycji podjednostek białkowych w kompleksach makromolekularnych lub lokalizacji mniejszych lub mniej odrębnych białek (<0,5 MDa) w komórkach. Ponadto hybrydowe metody przetwarzania EM, które łączą uśrednianie subtomogramowe z analizą pojedynczych cząstek lub rekonstrukcją spiralną, określiły ostatnio struktury białek do ~8 A42,43. Te metody przetwarzania są obecnie ograniczone do oczyszczonych białek, które są dobrze oddzielone w lodzie lub tworzą spiralne zespoły i obecnie nie mają zastosowania w zatłoczonych środowiskach komórkowych, takich jak mitochondria i błony grzebieniowe. Do gromadzenia danych opracowywane są nowe narzędzia obliczeniowe i sprzętowe, które umożliwiają zautomatyzowane pozyskiwanie tomogramów, zwiększają kontrast obrazu i zmniejszają całkowitą wymaganą dawkę elektronów. Jedynym podstawowym ograniczeniem w cryo-ET jest uszkodzenie próbki przez promieniowanie wiązki elektronów. Oznacza to, że tylko bardzo niskie dawki elektronów mogą być używane do rejestrowania każdego obrazu serii nachylenia tomografii, co skutkuje słabym stosunkiem sygnału do szumu, co ostatecznie ogranicza osiągalną rozdzielczość. Nowe bezpośrednie detektory elektronów, wprowadzone na rynek niecały rok temu, rewolucjonizują obecnie dziedzinę krio-EM44,45 pojedynczych cząstek. Te nowe detektory zapewniają wyższy kontrast i lepszą rozdzielczość przy niższych dawkach elektronów. W przypadku kriotomografii elektronowej oznacza to, że serie pochyleń z mniejszymi krokami, a nawet tomogramy dwuosiowe mogą być zbierane bez obaw o nadmierne uszkodzenia promieniowania (jeden obraz CCD odpowiada pod względem dawki elektronów 5 obrazom z bezpośredniego detektora elektronów). Ogromne ilości danych generowanych przez te detektory stwarzają własne wyzwania w zakresie obsługi, przetwarzania i przechowywania danych, którym trzeba będzie sprostać.

Ponadto płytki fazowe, które działają na podobnych zasadach, jak te rutynowo stosowane w mikroskopii świetlnej w celu zwiększenia kontrastu fazowego, są obecnie opracowywane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej46,47. Powinno to umożliwić gromadzenie tomogramów bliżej punktu widzenia, a zatem w wyższej rozdzielczości, przy jednoczesnym zachowaniu cech o niskiej rozdzielczości niezbędnych do wyrównania i interpretacji objętości tomograficznych. Podsumowując, ten postęp technologiczny znacznie rozszerzy zakres zagadnień biologicznych, na które można odpowiedzieć za pomocą cryo-ET.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Max Planck Society (K.M.D., B.D., A.W.M., T.B., T.B.B., D.J.M., i W.K.), Cluster of Excellence Frankfurt "Macromolecular Complexes" ufundowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (W.K.) oraz podoktoranckie stypendium EMBO Long-Term Fellowship (V.A.M.G.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SacharozaRoth4621.2
TrehalozaSigma-AldrichT9449
HEPESSigma-AldrichH3375
ZymolabiomolZ1000.1
Gradient gęstości średniSigma-AldrichD1556 lub P1644
Białko A złotoAurion810.11110 nm
EthaneAir LiquideP0502S02R0A001
AzotAir LiquideI4150RG
Materiały eksploatacyjne
Bibuła filtracyjnaWhatman, GE Healthcare1004 090Nr 4
PęsetaDumontT506Niemagnetyczna, wzór #5
Siatka testowa kombinowana EMPlano GmbHS142Grapitowe i złote wyspy na dziurawej folii węglowej
Holey Siatki węgloweQuantifoil Micro Tools GmbH lub C-flatR2/2 300 Cu mesh
CryoPlano GmbH160-42Alternatywne domowe pudełka metalowe
PotterSigma-AldrichP7984
BlenderWaring8011S
Młynek do koralików szklanych - ubijak do koralikówProdukty BioSpec1107900-105Z kulkami 0,5 mm
Homogenizator z łożyskiem kulkowym (Balch)Wirówka isobiotecH8
Thermo Scientific46915Sorvall RC6+
Aparat wyładowczyBal-Tec AGCTA 010
Urządzenie do witryfikacji siatkiFEI, Gatan lub LeicaAlternatywny domowy tłok
Transmisyjny mikroskop elektronowyFEI lub Jeol300 keV
Bezpośredni detektor elektronówSzczyt GatanK24k x 4k pikseli, tryb zliczany
Urządzenie ze sprzężeniem ładunkowym (CCD)GatanUS40004k x 4k pikseli (alternatywa dla bezpośredniego detektora elektronów)
Filtr energiiGatan lub Jeol
Software
Oprogramowanie do akwizycji obrazówGatan
Oprogramowanie do akwizycji TomogramówAlternatywy Gatan, FEI, USCF lub UC-Boulder4
do przetwarzania TomogramówAlternatywy
Oprogramowanie do uśredniania subtomogramuAlternatywy UC-Boulder lub University of Basel2
Oprogramowanie do wizualizacji TomogramUC-Boulder, FEI lub University of Utah3 alternatywy
Wtyczka oprogramowania do wizualizacjiUniwersytethttp://www.biophys.uni-frankfurt.de/frangakis/
Oprogramowanie do wizualizacji konstrukcjiUCSFhttp://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Oprogramowanie do obliczeń numerycznychMathWorkshttp://www.mathworks.de/academia/
grid boxes Oprogramowanie FEI, UCSF lub UC-Boulder 3 Goethego

Bibliografia

  1. Dickson, V. K., Silvester, J. A., Fearnley, I. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. On the structure of the stator of the mitochondrial ATP synthase. The EMBO journal. 25, 2911-2918 (2006).
  2. Rees, D. M., Leslie, A. G., Walker, J. E. The structure of the membrane extrinsic region of bovine ATP synthase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21597-21601 (2009).
  3. Watt, I. N., Montgomery, M. G., Runswick, M. J., Leslie, A. G., Walker, J. E. Bioenergetic cost of making an adenosine triphosphate molecule in animal mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 16823-16827 (2010).
  4. Baker, L. A., Watt, I. N., Runswick, M. J., Walker, J. E., Rubinstein, J. L. Arrangement of subunits in intact mammalian mitochondrial ATP synthase determined by cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 11675-11680 (2012).
  5. Allen, R. D., Schroeder, C. C., Fok, A. K. An investigation of mitochondrial inner membranes by rapid-freeze deep-etch techniques. The Journal of cell biology. 108, 2233-2240 (1989).
  6. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kühlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. The EMBO journal. 27, 1154-1160 (2008).
  7. Dudkina, N. V., Oostergetel, G. T., Lewejohann, D., Braun, H. P., Boekema, E. J. Row-like organization of ATP synthase in intact mitochondria determined by cryo-electron tomography. Biochimica et biophysica acta. 1797, 272-277 (2010).
  8. Davies, K. M., Anselmi, C., Wittig, I., Faraldo-Gomez, J. D., Kühlbrandt, W. Structure of the yeast F1Fo-ATP synthase dimer and its role in shaping the mitochondrial cristae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13602-13607 (2012).
  9. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14121-14126 (2011).
  10. Wurm, C. A., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13546-13551 (2011).
  11. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
  12. Austin, J. R. 2nd, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
  13. Ohta, K., et al. Beam deceleration for block-face scanning electron microscopy of embedded biological tissue. Micron. 43, 612-620 (2012).
  14. Buzhynskyy, N., Sens, P., Prima, V., Sturgis, J. N., Scheuring, S. Rows of ATP synthase dimers in native mitochondrial inner membranes. Biophysical journal. 93, 2870-2876 (2007).
  15. Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Current opinion in structural biology. 20, 623-631 (2010).
  16. Miao, J., Hodgson, K. O., Sayre, D. An approach to three-dimensional structures of biomolecules by using single-molecule diffraction images. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 6641-6645 (2001).
  17. Maimon, T., Elad, N., Dahan, I., Medalia, O. The human nuclear pore complex as revealed by cryo-electron tomography. Structure. 20, 998-1006 (2012).
  18. Meyerson, J. R., et al. Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging. Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).
  19. Chen, S., et al. Electron cryotomography of bacterial cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (39), (2010).
  20. Bharat, T. A., et al. Structural dissection of Ebola virus and its assembly determinants using cryo-electron tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4275-4280 (2012).
  21. Bennett, A. E., et al. Ion-abrasion scanning electron microscopy reveals surface-connected tubular conduits in HIV-infected macrophages. PLoS pathogens. 5, e1000591(2009).
  22. Liu, J., et al. Cellular architecture of Treponema pallidum: novel flagellum, periplasmic cone, and cell envelope as revealed by cryo electron tomography. Journal of molecular biology. 403, 546-561 (2010).
  23. Liu, J., et al. Intact flagellar motor of Borrelia burgdorferi revealed by cryo-electron tomography: evidence for stator ring curvature and rotor/C-ring assembly flexion. Journal of bacteriology. 191, 5026-5036 (2009).
  24. Patla, I., et al. Dissecting the molecular architecture of integrin adhesion sites by cryo-electron tomography. Nature cell biology. 12, 909-915 (2010).
  25. Heuser, T., et al. Cryoelectron tomography reveals doublet-specific structures and unique interactions in the I1 dynein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E2067-E2076 (2012).
  26. Briggs, J. A. Structural biology in situ-the potential of subtomogram averaging. Current opinion in structural biology. 23, (2013).
  27. Cheng, D., Mitchell, D. R. G., Shieh, D. B., Braet, F. Current Microscopy Contributions to Advances in Science and Technology. Méndez-Vilas, A. 2, Formatex. (2012).
  28. Brust, D., et al. Cyclophilin D links programmed cell death and organismal aging in Podospora anserina. Aging cell. 9, 761-775 (2010).
  29. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (30), (2009).
  30. Bhaskaran, S., et al. Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application. Analytical biochemistry. 413, 123-132 (2011).
  31. Pavlov, P. F., Rudhe, C., Bhushan, S., Glaser, E. In vitro and in vivo protein import into plant mitochondria. Methods in molecular biology. 372, 297-314 (2007).
  32. Graham, J. M., et al. Ch. 3, Current protocols in cell biology. Bonifacino, J. S. , John Wiley and Sons. (2001).
  33. Zheng, S. Q., et al. UCSF tomography: an integrated software suite for real-time electron microscopic tomographic data collection, alignment, and reconstruction. Journal of structural biology. 157, 138-147 (2007).
  34. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of structural biology. 152, 36-51 (2005).
  35. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of structural biology. 116, 71-76 (1996).
  36. Pruggnaller, S., Mayr, M., Frangakis, A. S. A visualization and segmentation toolbox for electron microscopy. Journal of structural biology. 164, 161-165 (2008).
  37. Scheres, S. H., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature methods. 9, 853-854 (2012).
  38. Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).
  39. Dautant, A., Velours, J., Giraud, M. F. Crystal structure of the Mg.ADP-inhibited state of the yeast F1c10-ATP synthase. The Journal of biological chemistry. 285, 29502-29510 (2010).
  40. Carbajo, R. J., et al. Structure of the F1-binding domain of the stator of bovine F1Fo-ATPase and how it binds an alpha-subunit. Journal of molecular biology. 351, 824-838 (2005).
  41. Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. The EMBO journal. 21, 221-230 (2002).
  42. Bharat, T. A., et al. Structure of the immature retroviral capsid at 8 A resolution by cryo-electron microscopy. Nature. 487, 385-389 (2012).
  43. Bartesaghi, A., Lecumberry, F., Sapiro, G., Subramaniam, S. Protein secondary structure determination by constrained single-particle cryo-electron tomography. Structure. 20, 2003-2013 (2012).
  44. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. eLife. 2, e00461(2013).
  45. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature methods. , (2013).
  46. Danev, R., Nagayama, K. Optimizing the phase shift and the cut-on periodicity of phase plates for TEM. Ultramicroscopy. 111, 1305-1315 (2011).
  47. Walter, A., et al. Practical aspects of Boersch phase contrast electron microscopy of biological specimens. Ultramicroscopy. 116, 62-72 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mitochondrialowa syntaza ATPu rednianie subtomogram wb ona grzebieniastastruktura kompleksu bia kowegowewn trzna b ona mitochondrialnarekonstrukcja serii pochylez ote markery fiducyjnesegmentacja b onymitochondria dro d y
Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.