Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten raport opisuje krok po kroku przewodnik po technice ostrych iniekcji dokanałowych w sposób nieinwazyjny, tj. niezależnie od implantacji cewnika. Techniczne ograniczenie tej techniki chirurgicznej polega na finezji rąk. Wstrzyknięcie jest szybkie, szczególnie dla wyszkolonego eksperymentatora, a ponieważ rozerwanie tkanki przy tej technice jest minimalne, możliwe są wielokrotne wstrzyknięcia; Co więcej, nie dochodzi do reakcji immunologicznej na obce narzędzia (np. cewnik), co daje lepszy i bardziej szczegółowy odczyt modulacji rdzenia kręgowego. Ponieważ stosowanie substancji jest w dużej mierze ograniczone do docelowego obszaru rdzenia kręgowego, nie ma potrzeby stosowania leków w dużych dawkach, a co ważniejsze, można uniknąć niepożądanych skutków dla innych tkanek, obserwowanych przy podawaniu ogólnoustrojowym1,2. Co więcej, łączymy tę technikę z transfekcją kwasu nukleinowego in vivo za pomocą odczynnika3 z polietyleniminy (PEI), który zapewnia ogromną wszechstronność w badaniu funkcji kręgosłupa poprzez dostarczanie środków farmakologicznych, a także modulatorów genów, RNA i białek.
Wprowadzenie
Rdzeń kręgowy jest bardzo ważnym ośrodkiem w wielu kluczowych procesach biologicznych i funkcjach fizjologicznych, w tym w przetwarzaniu i przekazywaniu bolesnych (nocyceptywnych) bodźców4-7. Opracowano różne techniki eksperymentalne w celu ułatwienia farmakologicznej modulacji rdzenia kręgowego, takie jak przewlekła implantacja cewników dooponowych8, mikroiniekcja rdzenia kręgowego i dokanałowe wstrzyknięcie igły9. Każda technika ma swoje zalety i wady, a w zależności od paradygmatu eksperymentu jedna technika może być bardziej odpowiednia niż inne. Podczas gdy przewlekła implantacja cewników dooponowych jest łatwo możliwa u szczurów, metoda ta jest bardzo trudna u myszy, ze względu na ograniczenia rozmiaru. Wskaźnik sukcesu jest bardzo niski, a deficyty motoryczne często występują z powodu nieporęcznej obecności cewnika w mocno ograniczonej przestrzeni podtwardówkowej u myszy. Co więcej, długotrwałe dostarczanie leków jest spowodowane częstym krzepnięciem przewlekle wszczepionych cewników. Wreszcie, reakcje immunologiczne są powszechne.
Te problemy można obejść za pomocą metody ostrego wstrzykiwania dooponowego za pomocą igły w przypadku braku preimplantowanego cewnika, co umożliwia szybkie i anatomicznie ograniczone stosowanie leków i odczynników do rdzenia kręgowego u myszy. Metoda ta w pełni zachowuje korzyści płynące z podawania dooponowego w porównaniu z innymi drogami podawania ogólnoustrojowego (np. doustnie, dożylnie, dootrzewnowo itp.), takie jak specyficzność modulacji kręgosłupa, która pozwala na zmniejszenie dawek i ograniczenie skutków ubocznych, a także zdolność do dostarczania substancji, które zwykle nie przekraczają bariery krew-mózg, ponieważ podczas wstrzyknięcia dooponowego igła jest wprowadzana między oponę twardą a rdzeń kręgowy. Co jednak ważne, w porównaniu z innymi metodami podawania dooponowego, metoda iniekcji dooponowej jest najmniej inwazyjna, pozwalając na wielokrotne zastosowanie u tego samego zwierzęcia bez powodowania znacznych uszkodzeń tkanek lub wywoływania reakcji immunologicznej w wyniku implantacji ciała obcego. Wymaga to jednak umiejętności technicznych do bardzo precyzyjnego celowania w igłę, aby umożliwić skuteczność.
Tutaj wizualnie demonstrujemy metodę osiągania optymalnego wskaźnika sukcesu w szczególności w celu celowania w rdzeń kręgowy w odcinku lędźwiowym. Miejsce wstrzyknięcia, które jest wybierane w tym eksperymencie, to rowek między kolumną kręgowców L5 i L6, w pobliżu miejsca, w którym kończy się rdzeń kręgowy, aby zminimalizować możliwość uszkodzenia kręgosłupa. Co więcej, demonstrujemy zastosowanie tej techniki do niszczenia genów w rdzeniu kręgowym za pomocą siRNA.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące wykorzystywania zwierząt były zgodne z etycznymi wytycznymi określonymi przez lokalne ciało zarządzające (Regierungspräsidium Karlsruhe, Karlsruhe, Niemcy).
1. Przygotowanie kompleksu siRNA/PEI
Roztwór kompleksu siRNA/PEI przygotowuje się zgodnie ze wskazówkami producenta w następujący sposób:
- Roztwór A: Rozcieńczyć żądaną ilość siRNA sterylną wodą (jeśli to konieczne) do jednej czwartej objętości końcowej i rozcieńczyć ją dalej 10% roztworem glukozy do połowy objętości końcowej. Delikatnie wymieszać lub wymieszać, pipetując w górę iw dół. Optymalna ilość siRNA musi być określona empirycznie, ale 1 μg siRNA w 10 μl złożonego roztworu na zwierzę jest dobrym punktem wyjścia do optymalizacji.
- Roztwór B: Rozcieńczyć potrzebną objętość odczynnika PEI sterylną wodą do jednej czwartej objętości końcowej i rozcieńczyć ją dalej 10% roztworem glukozy do połowy objętości końcowej. Delikatnie wymieszać lub wymieszać, pipetując w górę i w dół.
Uwaga: ilość odczynnika PEI decyduje o równowadze jonowej w kompleksie, która wpływa na efektywność transfekcji. Podobnie optymalna ilość roztworu PEI musi być określona empirycznie. W naszych rękach optymalna ilość to 0,12 μl roztworu PEI na 1 μg siRNA. - Wymieszaj roztwór A z roztworem B jednocześnie, delikatnie zmieszaj.
- Mieszany roztwór inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem. Kompleks ten jest stabilny przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
2. Wstrzyknięcie dokanałowe
- Znieczulenie myszy 3% izofluranem, aż nie wykaże oznak odruchu prostowania. Ponadto sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania ogona i/lub łapy, aby dodatkowo upewnić się, że jest w stanie znieczulenia.
- Ogolić około 2cm2 futra na tylnym końcu zwierzęcia w pobliżu podstawy ogona, aby ułatwić lepszą wizualizację podczas wprowadzania igły.
- Umieść mysz w stożku nosowym w celu dalszego podawania izofluranu podczas zabiegu, zmniejsz ilość izofluranu do 1,5% i pokryj oczy myszy lubrykantem do oczu.
- Przygotować gotowy do użycia mieszany roztwór siRNA za pomocą 25 μl strzykawki Hamiltona przymocowanej do igły 30 G 0,5 cala.
- Zlokalizuj wyrostek kolczysty L6, który powinien być najbardziej widoczny i przymocuj kolumnę kręgowców wokół tego obszaru, delikatnie ją naciskając.
- Ostrożnie wprowadzić igłę między rowek kręgów L5 i L6 i obserwować, czy wykonuje się ruch ogonem, ponieważ ten znak wskazuje na pomyślne wprowadzenie igły do przestrzeni śródoponowej.
napiwek: Za pomocą paznokcia powinno być również w stanie zlokalizować rowek. - Po zaobserwowaniu ruchu ogona, natychmiast, ale ostrożnie, zabezpiecz pozycję igły jedną ręką i powoli wstrzyknij żądaną objętość substancji drugą ręką.
Wskazówka: objętość między 5-10 μl jest optymalna, ponieważ objętość mniejsza niż 5 μl jest zawodna, a objętość większa niż 10 μl prowadzi do zbyt dużego ciśnienia. - Po wykonaniu wstrzyknięcia należy przenieść mysz z powrotem do klatki, aby dojść do siebie po znieczuleniu.
- Powtarzaj to wstrzyknięcie co najmniej 2 razy co 24 godziny, aby osiągnąć optymalną regulację w dół docelowego genu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby zilustrować prawidłowe wstrzyknięcie, wykonaliśmy tę technikę z użyciem barwnika Fast Green FCF u dorosłych myszy C57Bl6 (w wieku 8-10 tygodni). Zwierzęciu pozwolono na kilkuminutową rekonwalescencję po iniekcji, aby barwnik mógł się rozprzestrzenić, a następnie uśmiercono je przedawkowaniem CO2. Następnie dokonano sekcji kręgosłupa i odsłonięto rdzeń kręgowy. Niebieskie punkty odpowiadające rozproszonemu barwnikowi wyznaczyły miejsce wstrzyknięcia. Nie stwierdzono oznak uszkodzenia rdzenia kręgowego, co p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tak więc opisana powyżej technika dokanałowych wstrzyknięć igieł jest skuteczna, szybka, specyficznie zlokalizowana i nieniszcząca. Technicznie rzecz biorąc, najbardziej krytycznym aspektem tej procedury jest miejsce wprowadzenia igły do rowka. Bardzo ważne jest, aby ta procedura była wykonywana bardzo spokojnymi rękami i cierpliwością. Podobnie jak w przypadku wielu zabiegów chirurgicznych, szkolenie poprawia wskaźnik udanego wstrzyknięcia. Jest to również ważne, ponieważ podczas rzeczywistego eksperymentu technika ta n...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| In Vivo-jetPEI | Polyplus | 201-10G | |
| WAVE1 siRNA | Santa Cruz | sc-36832 | |
| Kontrola siRNA-A | Santa Cruz | sc-37007 | |
| Przeciwciało anty-ß-tubuliny III | Sigma | T2200& | nbsp; |
| Przeciwciało anty-WAVE1 | R& D Systems | AF5514 | |
| Szybki zielony barwnik | Sigma | F-7252 | |
| Izofluran | Baxter | ||
| Konfiguracja izofluranu | Drä ger Lü beck | ||
| Golarka | Wella | ||
| Strzykawka Hamilton Gazoszczelna 1702 | Hamilton | ||
| 30 G 1/2 w 13 mm Igła | BD Microlance | 304000 | |
| Mikroskop Leica MS5 | Leica | ||
| Starter do przodu WAVE1 do qRT-PCR | Sigma | cacagagcctcaggacagg | |
| WAVE1 odwrócony starter do qRT-PCR | Sigma | cttttcaccaacggcatctt | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 6402712001 |
Bibliografia
- Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur. J. Pharmacol. 67, 313-316 (1980).
- Stokes, J. A., Corr, M., Yaksh, T. L. Transient tactile allodynia following intrathecal puncture in mouse: contributions of Toll-like receptor signaling. Neurosci. Lett. 504, 215-218 (2011).
- Goula, D., et al. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther. , 1291-1295 (1998).
- Fairbanks, C. A. Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia. Adv. Drug. Deliv. Rev. 55, 1007-1041 (2003).
- Hohmann, A. G., Tsou, K., Walker, J. M. Cannabinoid modulation of wide dynamic range neurons in the lumbar dorsal horn of the rat by spinally administered WIN55,212-2. Neurosci. Lett. 257, 119-122 (1998).
- Song, Z. H., Takemori, A. E. Involvement of spinal kappa opioid receptors in the antinociception produced by intrathecally administered corticotropin-releasing factor in mice. J. Pharmacol. Exp. Ther. 254, 363-368 (1990).
- Trang, T., Sutak, M., Jhamandas, K. Involvement of cannabinoid (CB1)-receptors in the development and maintenance of opioid tolerance. Neuroscience. , 1275-1288 (2007).
- Yaksh, T. L., Rudy, T. A. Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space. Physiol. Behav. 17, 1031-1036 (1976).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. , 677-681 (2006).
- Bourinet, E., et al. Silencing of the Cav3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. EMBO J. 24, 315-324 (2005).
- Wang, X., et al. Gene transfer to dorsal root ganglia by intrathecal injection: effects on regeneration of peripheral nerves. Mol. Ther. 12, 314-320 (2005).
- Wigdor, S., Wilcox, G. L. Central and systemic morphine-induced antinociception in mice: contribution of descending serotonergic and noradrenergic pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 242, 90-95 (1987).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Przeglądaj więcej artykułów
