Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Długotrwałe wykorzystanie Drosophila jako modelu dla biologii komórkowej i rozwojowej zaowocowało szeregiem narzędzi. Łącznie techniki te umożliwiły analizę biologii komórki i rozwoju z różnych punktów widzenia. Obrazowanie na żywo to nowa metoda obserwacji dynamicznych procesów komórkowych, takich jak podział komórek lub ruchliwość komórek. Po wyizolowaniu mutacji w niescharakteryzowanych domniemanych białkach cyklu komórkowego konieczne stało się obserwowanie mitozy in situ za pomocą obrazowania na żywo. Większość badań obrazowych na żywo u Drosophila koncentrowała się na stadiach embrionalnych, które są dostępne do manipulacji i obserwacji ze względu na ich mały rozmiar i przejrzystość optyczną. Jednak na tych etapach cykl komórkowy jest niezwykły, ponieważ brakuje w nim jednej lub obu faz przerwy. Natomiast komórki skrzydła poczwarki Drosophila mają typowy cykl komórkowy i przechodzą okres szybkiej mitozy trwający około 20 godzin rozwoju poczwarki. Łatwo jest zidentyfikować i wyizolować poczwarki w odpowiednim stadium, aby złapać mitozę in situ. Zamontowanie nienaruszonych poczwarek zapewniło najlepsze połączenie podatności i trwałości podczas obrazowania, umożliwiając przeprowadzanie eksperymentów przez kilka godzin przy minimalnym wpływie na żywotność komórek i zwierząt. Metoda ta pozwala na obserwację cech tak małych lub mniejszych niż chromosomy muchy. Dostosowanie ustawień mikroskopu i szczegółów montażu pozwoliło na rozszerzenie preparatu o wizualizację dynamiki błon sąsiednich komórek i fluorescencyjnie znakowanych białek, takich jak tubulina. Metoda ta działa w przypadku wszystkich badanych białek fluorescencyjnych i może uchwycić cechy w skali submikronowej w różnych skalach czasowych. Chociaż jest ograniczone do zewnętrznych 20 μm poczwarki za pomocą konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego, to podejście do obserwacji dynamiki białek i komórek w tkankach poczwarki in vivo może być ogólnie przydatne w badaniach biologii komórkowej i rozwojowej w tych tkankach.
Wprowadzenie
Mucha octowa, Drosophila melanogaster, jest dobrze znanym modelem do badania wielu aspektów biologii. Badania nad Drosophila mają bogatą historię eksperymentów genetycznych, które pozwalają na wyrafinowane formy manipulacji genami, w tym ekspresję, knockdown i mutację. Wraz z pojawieniem się fluorescencyjnych etykiet białkowych, repertuar ten rozszerzył się o badania komórek i białek u żywych zwierząt. Zarodek muchy jest doskonałym systemem do takich badań, ponieważ jest mały i optycznie czysty, co pozwala na głębokie obrazowanie in vivo wwysokiej rozdzielczości 1-3. Inne etapy rozwoju muszki okazały się mniej podatne na manipulacje, wymagające znieczulenia4, sekcji i krótkotrwałego posiewu5,6 lub stworzenia okien w naskórku do obrazowania7,8. Manipulacje te zwykle zagrażają rozwojowi zwierząt w dłuższej perspektywie lub wpływają na zwierzę w sposób, który ogranicza obrazowanie do krótkich okresów.
Aby badać nowe mutacje w genach przypominających regulatory cyklu komórkowego, konieczne było znalezienie odpowiedniego przygotowania do badania czasu i wierności cyklu komórkowego. Ponieważ większość embrionalnych cykli komórkowych jest skrócona (S-M lub S-G2-M), a badane mutanty wykazują defekty dopiero w późniejszych stadiach, ważne było obserwowanie cyklu komórkowego w tkankach w stadium poczwarki. Komórki nabłonkowe w poczwarce mają bardziej typowy cykl komórkowy G1-S-G2-M, a poczwarki na tym etapie nie są zdolne do ruchów mięśni9. Początkowym punktem wyjścia do manipulacji były nienaruszone całe poczwarki wykazujące ekspresję histonu2AV-GFP. Pomimo pozornej nieprzezroczystości obudowy poczwarki, ten nienaruszony preparat okazał się doskonały do długotrwałego obrazowania in vivo. Technika ta jest na tyle prosta, że naukowcy rutynowo używają jej do badania aspektów biologii komórki i rozwoju u Drosophila, a mimo to rozdzielczość jest wystarczająco dobra, aby umożliwić rozróżnienie cech skali mikrometrycznej. Dzięki tej metodzie obserwacje zdarzeń w ciągu godzin, minut lub sekund są możliwe po prostu poprzez dostosowanie parametrów szeregów czasowych. Nakręcono filmy wykorzystujące niebieskie, zielone, żółte, pomarańczowe i czerwone białka fluorescencyjne lub ich kombinacje. Co ważne, jeśli zadba się o zminimalizowanie intensywności lasera, nawet długotrwałe obrazowanie nie ma wpływu na rozwój lub żywotność zwierząt.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Praca w locie
- Utrzymuj muchy na standardowym podłożu z mąki kukurydzianej, agaru i melasy drożdżowej w temperaturze pokojowej10.
- W przypadku krzyżówek należy odizolować dziewice w ciągu 6 godzin od zamknięcia. Po skrzyżowaniu z samcami o pożądanym genotypie należy wymieniać muchy na nowe fiolki co 3-4 dni.
Uwaga: W tych eksperymentach użyto linii A9 Gal4 do sterowania ekspresją transgenów w skrzydle. Zapasy much można nabyć w centrum magazynowym w Bloomington. Akcje użyte w tych eksperymentach obejmują A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773), lollibow11.
2. Wybór i montaż poczwarek
- Etapować poczwarki, zbierając je jako białe poczwarki (WPP) i utrzymując je w temperaturze 25 °C do czasu osiągnięcia odpowiedniego wieku lub stosując kryteria morfologiczne12.
- Aby zaobserwować podziały komórkowe, wybierz poczwarki, które niedawno przeszły wywinięcie głowy. Od tego czasu aż do momentu tuż przed eklozją (w >96 godz.) poczwarki są nieruchome, co pozwala na dłuższą obserwację poklatkową.
- Usuń poczwarki z fiolek, najpierw dotykając ich pędzlem zwilżonym wodą, czekając minutę, aby woda poluzowała klej, a następnie delikatnie nacierając je na pędzel.
- Delikatnie umyj wybrane poczwarki, zanurzając je pędzlem w wodzie, aby usunąć klej gruczołów ślinowych i resztki jedzenia.
- Przenieść czyste poczwarki na szalkę Petriego o średnicy 25 mm z dnem szkiełka nakrywkowego (szkiełko nakrywkowe numer 1 1/2).
- Używając cienkich pasków plasteliny lub wosku dentystycznego jako podpory, zamontuj poczwarki tak, aby interesująca tkanka znajdowała się najbliżej szkiełka nakrywkowego.
Uwaga: W opisanych tutaj badaniach zaobserwowano skrzydła poczwarki, nogi, histobblasty brzuszne lub notum grzbietowe. W praktyce można zaobserwować każdą tkankę w odległości nie większej niż 20 μm od powierzchni obudowy poczwarki. - Ostrożnie ustaw poczwarki tak, aby tkanka będąca przedmiotem zainteresowania była równoległa do powierzchni szkiełka nakrywkowego.
- Po zamontowaniu poczwarek użyj pędzla, aby przenieść cienką warstwę glikolu tiodietylenowego (TDG) do przestrzeni między poczwarką a szkiełkiem nakrywkowym.
Uwaga: TDG zmniejsza rozpraszanie powierzchniowe, dopasowuje współczynnik załamania światła oleju i pozwala tlenowi przenikać do tkanki13. Nie zaleca się stosowania olejków, ponieważ mają one tendencję do pozbawiania tkanek tlenu, powodując szybkie zanik zachowań komórek.
3. Obrazowanie
Uwaga: Do obrazowania, mikroskop konfokalny może być niezbędny, ponieważ konfokalność usuwa większość zasłaniającego tła spowodowanego intensywnym oświetleniem obudowy poczwarki.
- Dostosuj ustawienia konfokalnej, aby zminimalizować wpływ oświetlenia na rozwój i żywotność poczwarki. Aby to zrobić, zachowaj równowagę między intensywnością wzbudzenia a wrażliwością zbierania. Typowa konfiguracja do obrazowania za pomocą Leica SP5 wykorzystywała skaner rezonansowy (8 000 Hz), moc lasera ustawioną na 2% (10% transmitancji przy 20% mocy), otworek otworkowy ustawiony na 120 μm i uśrednianie linii ustawiony na 8. Ustawienia będą się różnić w zależności od warunków eksperymentalnych.
Uwaga: Aby rozwiązać problem cech precyzyjnej skali, w tej metodzie z powodzeniem zastosowano również soczewki immersyjne 40X i 63X (odległość robocza 0,1 mm), chociaż ograniczają one głębię ostrości.
4. Analiza
Aby analizować klatki, stosy z lub filmy, importuj pliki danych do FIDŻI, które mają skuteczne narzędzia do przeglądania, mierzenia i modyfikowania plików do prezentacji14. Na przykład czas do zakończenia mitozy mierzono za pomocą interwału próbkowania i wielowymiarowej przeglądarki obrazów, aby przechodzić przez klatki podczas obserwacji komórki od profazy do telofazy. Wymiary X, Y i Z można mierzyć za pomocą narzędzia pomiarowego. Szczegółowe instrukcje dotyczące oprogramowania i jego użytkowania można znaleźć na stronie: http://fiji.sc/Fiji.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Komórki w nabłonkach rzekomo wielorzędowych, takich jak rozwijające się oko Drosophila lub warstwa komorowa rozwijającego się centralnego układu nerwowego kręgowców, wykonują ruchy jąder, nazywane interkinetyczną migracją jąder, zsynchronizowane z cyklem komórkowym. Replikacja DNA zachodzi, gdy jądra znajdują się na powierzchni podstawnej lub w jej pobliżu, a komórki wchodzą w fazę mitozy, gdy jądra dotrą do powierzchni apikalnej15,16. Komórki skrzydła poczwarki tworzą szybko dzielący się nabłonek jed...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wizualizacja, pomiar i ilościowe określenie cech dzielących się komórek wymagało opracowania prostego preparatu do obserwacji mitozy w żywym skrzydle poczwarkowym Drosophila za pomocą analizy konfokalnej komórek eksprymujących His2AvGFP. Metodę tę zastosowano do udokumentowania, że cykl komórkowy w skrzydle poczwarki wykazuje silne podobieństwa do cykli komórkowych w nabłonku pseudostratyfikowanym, w którym jądra przemieszczają się na wierzchołkową powierzchnię nabłonka, gdzie wchodzą w mitozę. Po telofazie jądr...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Akirze Chibie za wsparcie intelektualne, materialne i zapasy. Podziękowania dla Julii Dallman za komentarze.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Muchy na muchy | Genesee Scientific | 59-114 | do znieczulenia much |
| CO2 gaz | Airgas South | CD50 | Do znieczulenia much |
| Regulator | Airgas South | CO2 | |
| Fiolki na muchy | Genesee Scientific | 32-113RLBF | Kultura much |
| Drosophila linie:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773) | Bloomington Stock Center | ||
| Naczynia ze szklanym dnem #1 1/2 | WillCo Wells BV | Do mikroskopii | |
| Glikol tiodietylenowy | Fluka | 88559 | mocowanie |
| Sklep z artykułami plastycznymi z plasteliny do modelowania | Wsparcie w ustawianiu poczwarek względem | ||
| komputer | dowolny | 8 GB pamięci RAM do analizy obrazu/filmu | |
| Oprogramowanie | Darmowe oprogramowanie http://fiji.sc/Fiji | Oprogramowanie do analizy obrazu | |
| Mikroskop | Każdy szybki skaning konfokalny powinien być wystarczający | ||
| 20-krotnie suche i 40-krotne lub 63-krotne olejowe soczewki immersyjne | dowolne | Do obrazowania cech | |
| tkankowych, komórkowych i subkomórkowychOlejek immersyjny (niefluorescencyjny) | |||
| Mikroskop stereoskopowy | dowolny | do manipulacji muchami |
Bibliografia
- Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).
- Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses. Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways. Science. 332, 354-358 (2011).
- Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126, 3573-3584 (1999).
- Ninov, N., Martin-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).
- Edgar, B. A., Lehner, C. F. Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective. Science. 274, 1646-1652 (1996).
- Wirtz, R. A., Semey, H. G. The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies. Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140, 1605-1613 (2013).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. 2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy. Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia. Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).
- Sauer, F. C. Mitosis in the neural tube. J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
