Artykuł metodologiczny

Testowanie węchu Drosophila za pomocą testu Y-maze

15.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51241

⸱

12 czerwca 2014

 ,  , 
1Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-6265 CNRS, 2Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-1324 INRA, 3Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, Université de Bourgogne

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy test wyboru, który ma na celu ujawnienie wpływu odorantów na zachowanie Drosophila za pomocą testu Y-labirynt

.

Streszczenie

Wykrywanie sygnałów z otoczenia jest niezbędne dla zwierząt, aby zapewnić im przetrwanie. W tym celu wykorzystują sygnały środowiskowe, takie jak wzrok, mechanorecepcja, słuch i chemopercepcja poprzez smak, bezpośredni kontakt lub węch, który reprezentuje reakcję na lotną cząsteczkę działającą na większą odległość. Lotne cząsteczki chemiczne są dla większości zwierząt bardzo ważnymi sygnałami w wykrywaniu niebezpieczeństwa, źródle pożywienia lub komunikowaniu się między osobnikami. Drosophila melanogaster jest jednym z najczęstszych modeli biologicznych, z których naukowcy mogą badać komórkowe i molekularne podstawy węchu. Aby podkreślić zdolności węchowe tego małego owada, opisujemy zmodyfikowany protokół wyboru oparty na teście labiryntu Y, klasycznie stosowanym u myszy. Dane uzyskane za pomocą labiryntów Y dostarczają cennych informacji, które pozwalają lepiej zrozumieć, w jaki sposób zwierzęta radzą sobie z ciągle zmieniającym się środowiskiem. Wprowadzamy protokół krok po kroku do badania wpływu odorantów na reakcję eksploracyjną much za pomocą tego testu Y-labirynt.

Wprowadzenie

Chemorecepcja poprzez smak lub węch jest kluczowym sposobem sensorycznym dla przetrwania zwierząt. Daje istotne wskazówki niezbędne do wykrycia zagrożenia lub źródeł pożywienia, a także do interakcji społecznych. Pomaga również zwierzętom znaleźć partnera seksualnego niezbędnego do ich reprodukcji. Przez ponad 20 lat prowadzone były intensywne badania, w tym nagrodzona Nagrodą Nobla praca Richarda Axela i Lindy Buck w 2004 r. "za odkrycia receptorów zapachowych i organizacji układu węchowego", mające na celu ujawnienie molekularnych i komórkowych podstaw węchu1,2.

Jednym z ulubionych modeli zwierzęcych dla naukowców do analizy percepcji węchowej jest D. melanogaster. Owad ten ma podobną komórkową i molekularną strategię kodowania zapachu ze ssakami. Społeczność naukowa wykorzystuje różne paradygmaty behawioralne do badania roli substancji zapachowych w tej muszce owocowej. Testy te obejmują testy multimodalne, takie jak testy zalotów, w których różne modalności sensoryczne, w tym węch, są ważne dla wywołania męskich zalotów3. Opracowano również inne testy, aby dokładniej przyjrzeć się roli substancji zapachowych; Należą do nich labirynty T, labirynty Y, testy pułapek, areny czteropolowe i tunele aerodynamiczne4,5,6,7,8.

W tym artykule prezentujemy prosty, zmodyfikowany test labiryntu Y, który zapewnia silne reakcje węchowe przy użyciu D. melanogaster. Nasza konfiguracja wykorzystuje końcówki w przeciwieństwie do wcześniej opisanej metody9. Tak więc nasz labirynt Y ma dwie zalety. Po pierwsze, unika powrotu do systemu, gdy mucha dokona wyboru. Po drugie, ogranicza wymianę substancji zapachowych we wszystkich obszarach labiryntu Y. Ta ostatnia zaleta jest ważna, ponieważ Drosophila są bardzo wrażliwe na przepływ powietrza, który jest często używany w celu uniknięcia nasycenia nazapachami. Dostosowanie konfiguracji eksperymentalnej do przepływu powietrza byłoby czasochłonne i kosztowne. Dlatego nasz test Y-maze stanowi skuteczny i szybki sposób na zbadanie wydajności węchowej Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przed rozpoczęciem

  1. Użyj izogenicznego stado referencyjnego o stabilnych i solidnych fenotypach behawioralnych. Nie ma ogólnej zasady wyboru tego stada, ponieważ wszystkie potencjalne grupy kontrolne mogą zawierać heterogeniczne allele tła.
  2. Użyj tego szczepu kontrolnego, aby skrzyżować wstecznie wszystkie inne stado niezbędne do późniejszych kroków. Ten etap krzyżowania wstecznego jest zwykle reprezentowany przez co najmniej 5 kolejnych krzyżówek pojedynczej dziewiczej samicy (aby umożliwić możliwe skrzyżowanie między chromosomami homologicznymi) do 2-3 izogenicznych samców referencyjnych5. Ten krok jest ważny dla ujednolicenia tła genetycznego między różnymi stadami much.
  3. Utrzymuj zapasy Drosophila na standardowej mące kukurydzianej (9%), drożdżach (10%) i podłożu agarowym (1,5%) uzupełnionym antybiotykiem (0,4% para-hydroksybenzoesanu metylu) w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w temperaturze 25 °C.
  4. Przeprowadzanie eksperymentów chemosensorycznych w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (25 °C) w dalekim czerwonym świetle (w celu wyeliminowania wpływu sygnałów wizualnych i skupienia się na sygnałach chemosensorycznych). Regularnie wymieniaj powietrze w pomieszczeniu, aby przewietrzyć obszar między każdym eksperymentem.

2. Reakcja węchowa przy użyciu testu Y-labirynt

  1. Przed badaniem należy zagłodzić muchy przez 16–18 godzin w temperaturze 25 °C w szklanych probówkach zawierających mokry ręcznik papierowy.
  2. Połączyć łącznik w kształcie litery Y z dwiema szklanymi fiolkami i z mniejszą fiolką z tworzywa sztucznego (fiolką ładującą). Za pomocą końcówek do pipet o pojemności 1 ml przechodzących przez korki piankowe należy połączyć łącznik z trzema fiolkami i uzyskać szczelnie zamknięty labirynt Y. Odetnij wąskie końce dwóch końcówek pipet (o średnicy ~2 mm, aby uniknąć powrotu muchy po podjęciu decyzji), aby utworzyć dwie fiolki "pułapki" i duży koniec jednej końcówki pipety, aby utworzyć rurkę "ładującą" (Rysunek 1A).
  3. Tuż przed podłączeniem fiolek z "pułapką" (Rysunek 1B) należy umieścić jedną bibułę filtracyjną o średnicy ~6 mm w każdej fiolce. Dodać 40 μl roztworu nawaniacza na jedną bibułę filtracyjną i 40 μl odpowiedniego rozpuszczalnika na drugą bibułę filtracyjną.
  4. Wprowadź dziesięć much w wieku od 4 do 9 dni do fiolki "ładującej". Nie należy stosować znieczulenia CO2 podczas tego transferu, ponieważ ma on silny wpływ na zachowanie10. Raczej użyj krótkiego chłodzenia na lodzie. Właściwa manipulacja znieczulonymi muchami jest ważna, aby w jak największym stopniu ograniczyć stres u badanych.
    1. Wykonaj serię testów labiryntu Y w temperaturze 25 °C w dalekim świetle czerwonym (przy użyciu żarówek LED w celu ograniczenia możliwego źródła ciepła), aby w jak największym stopniu uniknąć bodźców wizualnych. Uważaj, aby zmienić orientację labiryntów Y (rurka zawierająca nazapach po lewej lub po prawej stronie i rurka ładująca z przodu lub z tyłu; Rysunek 1C).
    2. Odczekać kilka godzin, aby muchy dostały się do fiolki pułapki zawierającej środek zapachowy lub rozpuszczalnik. Liczenie leci po 24 godzinach, aby zwiększyć udział do ponad 80% i zapewnić maksymalną wartość indeksu węchowego (Simonnet, komunikacja osobista).
    3. Obliczyć wynikowy indeks węchowy, korzystając z następującego wzoru: (liczba w rurki zapachowej - liczba w probówce z rozpuszczalnikiem)/całkowita liczba załadowanych much.
  5. Umyj zestaw Y-maze w następujący sposób: zdemontowany zestaw namocz w RBS 35 MD na noc. Dokładnie spłucz wodą z kranu. Na koniec spłucz wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia.

3. Analiza statystyczna danych

  1. Wykonaj test t, jednoczynnikową lub dwukierunkową wartość ANOVA, w zależności od danych i zmiennych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1D przedstawia dwie reprezentatywne odpowiedzi w tym teście z labiryntem w kształcie litery Y. Samce szczepu Canton-S silnie unikają 10% kwasu octowego rozcieńczonego w wodzie destylowanej, podczas gdy nie unikają w stopniu znaczącym 10% kwasu fenylooctowego. Testy te opierają się na 10 samcach na powtórzenie, umieszczonych razem w fiolkach załadowczych. Protokół ten może czasami prowadzić do dużego błędu standardowego średniej. W razie potrzeby można ograniczyć tę wadę, stosując 20 samców na pow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasz protokół Y-maze jest oparty na wcześniej opisanym protokole9. Wprowadzamy jednak dwie zasadnicze różnice. Po pierwsze, używamy wąskich końcówek pipet, aby zapobiec powrotowi much, gdy zdecydują się dostać do fiolki zawierającej rozpuszczalnik lub rozpuszczalnik i środek zapachowy. Te wąskie końcówki są również przydatne do ograniczania dyfuzji zapachów w labiryncie Y. Po drugie, używamy mniejszej fiolki ładującej, aby zmusić muchy do wejścia do labiryntu Y. Ważne jest, aby mieć wysoki udział tych much (80...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy 4 anonimowym recenzentom za ich pracę nad ulepszeniem manuskryptu. Dziękujemy Centre National de la Recherche Scientifique za wsparcie finansowe dla MBG i YG, a także Université de Bourgogne i francuskiemu Ministerstwu Badań Naukowych dla MMS. Badania w laboratorium YG są finansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC Starting Grant, GliSFCo-311403), Agence Nationale de la Recherche (ANR-JCJC, GGCB-2010), Conseil Régional de Bourgogne (Faber) oraz CNRS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka polistyrenowa DrosophilaVWR europe734-225530 x 25 mm 
Y-maze
Rurka borokrzemianowa DrosophilaDijon verre95 X 25 mm
Y-maze
Korek piankowyDutscher999038
Łącznik
kształcie literyY-maze Europrix11020605
Y-maze
100-1,000 µ l końcówki do pipetCorning4868Podłącz następujące końcówki do pipet do złącza w kształcie litery Y. Odetnij 2 końcówki pipet w odległości 65 mm od szerokiego końca i połącz wąski koniec (za pomocą ∼ Otwór 2 mm) do 2 fiolek testowych. Otwory te ograniczą zawracanie, gdy muchy dostaną się do rur zawierających zapachy. Wytnij 1 końcówkę pipety w odległości 35 mm od szerokiego końca i podłącz ją do fiolki ładującej.
Żarówka LED Y-maze Far-RedRubin-Lacaque0RB180238625-630 nm
Kwas octowySigma-Aldrich45725
Kwas fenylooctowySigma-AldrichP16621
DrożdżeSensient Flavors Strasburg1018880464
MąkakukurydzianaeurogermFarine de maï s
AgarKalysHP-697-25
Hydroksy-4 benzoesan metyluVWR międzynarodowa25605293
w Y

Bibliografia

  1. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
  2. Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
  3. Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. The smell of love in Drosophila. Front. Physiol. 4, (2013).
  4. Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
  5. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
  6. Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
  7. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
  8. Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
  9. Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
  10. Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
  11. Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
  12. Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odpowied w chowatestowanie substancji zapachowychzachowanie muchprotok g odzeniamonta labiryntuwiat o dalekiej czerwieniindeks w chowystandardowe metody statystyczne

Powiązane artykuły