Artykuł metodologiczny

Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne

8.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51243

⸱

21 czerwca 2014

 , 
1Muscle Development and Regeneration Program, Sanford-Burnham Institute for Medical Research, 2IRCCS Fondazione Santa Lucia

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół oparty na epigenetycznym przeprogramowaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w kierunku generowania jednorodnej populacji komórek progenitorowych mięśni szkieletowych, które w dopuszczalnych warunkach hodowli tworzą trójwymiarowe skupiska kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer), które podsumowują biologiczne cechy ludzkich mięśni szkieletowych.

Streszczenie

Generowanie jednorodnej i obfitej populacji komórek mięśni szkieletowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) jest wymogiem dla terapii komórkowych i dla modelu "choroby w naczyniu" ludzkich chorób nerwowo-mięśniowych. Główne przeszkody, takie jak niska liczebność i niejednorodność populacji będącej przedmiotem zainteresowania, a także brak protokołów tworzenia trójwymiarowych struktur kurczliwych, ograniczyły zastosowania komórek macierzystych w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych. Zaprojektowaliśmy protokół, który pokonuje te ograniczenia poprzez ektopowe wprowadzenie zdefiniowanych czynników w hESC - czynnika determinacji mięśni MyoD i składnika kompleksu przebudowy chromatyny SWI/SNF BAF60C - które są w stanie przeprogramować hESC w komórki mięśni szkieletowych. W tym miejscu opisujemy protokół ustanowiony w celu generowania mioblastów pochodzących z hESC i promowania ich grupowania w trójwymiarowe zminiaturyzowane struktury (miosfery), które funkcjonalnie naśladują zminiaturyzowane mięśnie szkieletowe7.

Wprowadzenie

Ze względu na ich unikalną zdolność do samoodnawiania się przy zachowaniu pluripotencji, ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) są uważane za nieoceniony zasób w medycynie regeneracyjnej. Repopulacja chorych mięśni za pośrednictwem komórek macierzystych oraz generacja mięśni szkieletowych pochodząca z hESC lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do modelowania chorób in vitro są kluczowymi celami badań mających na celu identyfikację metod leczenia i wyjaśnienie patogenezy wielu chorób nerwowo-mięśniowych. Jednak badania te zostały zakwestionowane przez oporność hESC na przekształcanie się w komórki mięśni szkieletowych oraz przez niedostatek informacji dotyczących molekularnej regulacji zaangażowania hESC w miogenezę szkieletu. Rzeczywiście, wcześniejsze próby wygenerowania komórek progenitorowych mięśni szkieletowych z hESC wykazały, że tylko potomstwo pochodzące z ciała zarodka (EB) lub komórki mezenchymalne są zdolne do aktywacji miogenezy szkieletu po ektopowej ekspresji aktywatorów transkrypcji (np. Pax3 lub Myf5)1-3 lub poprzez ekspozycję na określone warunki hodowli4-5.

Wcześniej wykazaliśmy, że komponent SWI/SNF, BAF60C (kodowany przez SMARCD3), jest niezbędnym składnikiem maszynerii transkrypcyjnej, która umożliwia aktywację loci6 specyficznych dla mięśni za pośrednictwem MyoD. Niedawno odkryliśmy, że selektywny brak BAF60C nadaje hESC odporność na aktywację miogenezy szkieletu za pośrednictwem MyoD7, która jest obserwowana w komórkach somatycznych z ekspresją BAF60C8-10, proces powszechnie określany jako konwersja miogenna. Wymuszona ekspresja BAF60C umożliwia MyoD bezpośrednią aktywację miogenezy szkieletu w hESC, w określonych warunkach hodowli, przy czym BAF60C i MyoD narzucają sygnaturę epigenetyczną, która angażuje hESC w kierunku linii miogennej7. Warto zauważyć, że wcześniejsza analiza proteomiczna wykazała selektywny brak BAF60C wśród składników SWI/SNF w ESC11. Wykorzystaliśmy tę wiedzę, aby nałożyć epigenetyczne zaangażowanie hESC na linię miogeniczną, co doprowadziło do wytworzenia jednorodnej populacji mioblastów szkieletowych, które można agregować w celu utworzenia trójwymiarowych struktur kurczliwych (miosfer), które funkcjonalnie naśladują zminiaturyzowane mięśnie szkieletowe7. Rzeczywiście, nasza metoda generowania komórek progenitorowych mięśni szkieletowych z hESC opiera się na epigenetycznym zaangażowaniu hESC w linię miogeniczną, która jest fenotypowo utajona, dopóki komórki nie zostaną wystawione na sygnały różnicujące, takie jak agregacja komórek i hodowla w pożywce różnicowej (patrz konkretny protokół). Strategia ta pozwala na ekspansję jednorodnej populacji hESC, które są epigenetycznie zaangażowane w linię mięśni szkieletowych i odpowiednie do tworzenia trójwymiarowych miosfer kurczliwych, które podsumowują histologiczne i funkcjonalne właściwości mięśni szkieletowych. Miosfery dostarczają pierwszych dowodów na istnienie zminiaturyzowanych mięśni, które można wykorzystać w modelu chorób mięśniowych "choroba w naczyniu". Miosfery te, generowane z iPSC pochodzących od pacjentów, mają potencjał, aby wyjaśnić długotrwałe pytania rozwojowe i patogenezę chorób rzadkich, a także oferują ogromny potencjał jako narzędzie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych związków terapeutycznych. Zauważamy również, że jeden natychmiastowy odczyt analizy miosfery może być dostarczony przez immunohistochemię na przekrojach, jak opisano w protokole JoVE autorstwa Gomesa i wsp.12

Protokół

1. Zakażenie hESC

Ten protokół wymaga lentiwirusów o wysokim mianie kodujących BAF60C i MyoD13. Te konstrukcje są dostępne na życzenie.

  1. Zalecenia przed rozpoczęciem
    1. W celu zapewnienia wysokiej skuteczności infekcji, płytki hESC do infekcji w warunkach wolnych od karmienia (Figura 2A) w celu wyeliminowania konkurentów komórkowych podczas wychwytu wirusa. Rzeczywiście, MEF są notorycznie łatwiejsze do zakażenia w porównaniu z hESC i są kompetentne do konwersji za pośrednictwem MyoD. W związku z tym eliminacja MEF z kultur hESC zwiększa wskaźnik infekcji.
    2. Zaleca się posiadanie lentiwirusów o wysokim mianie, aby zapewnić wysoką skuteczność infekcji. Możliwości poprawy skuteczności infekcji omówiono w sekcji "Sprawdzanie infekcji".
    3. Przygotować płytki pokryte matriżelem, dodając 1 ml 1 mg/ml Matrigel do każdej studzienki i pozostawić na co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej (lub O/N szczelnie zamkniętej w temperaturze 4 °C, jeśli zostały przygotowane dzień wcześniej).
  2. Przebieg infekcji
    1. Dzień przed infekcją
      1. Dodaj suplement do klonowania i odzyskiwania komórek hES w pożywce w rozcieńczeniu 1000X (końcowe stężenie 2 mM).
    2. Dzień 0 - Zakażenie BAF60C
      Uwaga: Najpierw należy przeprowadzić zakażenie hESC BAF60C, a następnie zakażenie MyoD.
      1. Dysocjować basenik 6-dołkowej płytki hESC wyhodowanych jako kolonie14 w zawiesinie jednokomórkowej przez inkubację z 1 ml TrypLE przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      2. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml, dodać 9 ml pożywki z hESC i wirować przez 5 minut przy 1 200 obr./min.
      3. Podczas wirowania przygotuj mieszankę infekcji w czystej probówce, dodając do 1 ml mTeSR1, polibrenu (6 mg / ml) i suplementu do klonowania i odzyskiwania komórek hES (2 mM).
      4. Ponownie zawiesić osad komórkowy (około 5 x 105-1 x 106 komórek z jednej zlewającej się studzienki hESC) z 1 ml mieszanki infekcji i płytką na 6-dołkowej płytce o niskim przyłączeniu, która zapobiega przyleganiu komórek do plastiku.
      5. Dodać wirusa BAF60C-iRES-GFP w temperaturze 108 MOI i inkubować przez 3 godziny w inkubatorze
      6. Zebrać zawiesinę komórkową zawierającą wirusy i podzielić ją równo w dwóch studzienkach pokrytych matriżelem. Następnie dodaj 2 ml suplementu do klonowania i odzyskiwania komórek mTeSR1+ hES do każdej studzienki i pozostaw O/N w inkubatorze.
    3. Dzień 1
      1. Ostrożnie usunąć pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją 2 ml mTeSR1 i suplementu hES Cell Cloning & Recovery Supplement. Komórki zaczną się zlepiać, jak pokazano na rysunku 2B.
    4. Dzień 2 - Zakażenie MyoD
      1. Przed kontynuowaniem sprawdź stan fluorescencji komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby upewnić się, że infekcja ma wysoką skuteczność. Jeśli nie, zapoznaj się z sekcją "Sprawdzanie infekcji".
      2. Jeśli komórki osiągnęły co najmniej 80% konfluencji, postępuj w następujący sposób; w przeciwnym razie poczekaj dodatkowy dzień przed kontynuowaniem.
      3. Usunąć pożywkę i dodać 1 ml odczynnika TrypLE w celu dysocjacji komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      4. Powtórz zgodnie z opisem od 1.2.2.2 - 1.2.2.6, dodając wirusa MyoD w 108 MOI.
    5. Dzień 3
      1. Ostrożnie usunąć pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją 2 ml mTeSR1 i suplementu hES Cell Cloning & Recovery Supplement.
      2. Płytki MEF na płytkach pokrytych matryżelem o wymiarach 2,5 x 105/cm2 na następny dzień, aby umożliwić namnażanie się zakażonych komórek.
    6. Dzień 4
      1. Usunąć pożywkę i dodać 1 ml odczynnika TrypLE w celu dysocjacji komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      2. Przenieść komórki do 15-mililitrowej probówki sokoła, dodać 9 ml pożywki hESC i wirować przez 5 minut z prędkością 1 200 obr./min.
      3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 6 ml pożywki z ludzkimi komórkami macierzystymi.
      4. Usunąć pożywkę z płytki 6-dołkowej zawierającej MEF i płytek hESC w stosunku podziału 1:2, dozując 3 ml na każdą studzienkę zawierającą MEF.
        napiwek! Kiedy kolonie osiągną konfluencję, niektóre studzienki komórek zakażonych MyoD/BAF60C można zamrozić w ciekłym azocie jako zapas zapasowy. Pożywka do zamrażania zawiera 90% KOSR i 10% DMSO oraz 2 mM hES Cell Cloning & Recovery Supplement. Pozostałe odwierty można następnie poddać działaniu protokołu różnicowania - opis znajduje się poniżej. Jeśli do wytworzenia większej liczby miosfer potrzebnych jest więcej komórek, zakażone hESC mogą być dalej rozmnażane w następujący sposób:
      5. Usunąć pożywkę i inkubować z 1 ml 1 mg/ml kolagenazy dożylnej przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      6. Usunąć kolagenazę dożylną i dodać 1 ml pożywki hESC.
      7. Pod mikroskopem preparacyjnym zeskrob kolonie końcówką o pojemności 10 ml.
      8. Zbierz kawałki kolonii do 15-mililitrowej probówki i pozostaw do osadzenia na 3 minuty. Następnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić w pożywce hESC i ułożyć płytkę na płytkach MEF w stosunku 1:4.
  3. Sprawdzanie infekcji
    1. Podczas rozmnażania komórek zaleca się powlekanie zakażonych komórek w mniejszej skali w celu pobrania do analizy RNA i przeprowadzenia analizy ekspresji białka za pomocą immunofluorescencji w celu sprawdzenia biomarkerów, które odzwierciedlają prawidłowy stan biologiczny na każdym etapie (patrz Reprezentatywne wyniki). W przypadku lentiwirusów o wysokim mianie oczekiwany odsetek zakażonych komórek powinien wynosić co najmniej 80%.
    2. Aby zapewnić wysoką skuteczność, wektory lentiwirusowe mogą być modyfikowane, wprowadzając fluorescencyjny marker selekcyjny i/lub oporność na antybiotyki. Nasz plazmid lentiwirusowy eksprymujący BAF60C również przenosi fluorescencję GFP.
    3. Sortowanie hESC dla markera fluorescencyjnego. W przypadku niskiej skuteczności infekcji zaleca się zastosowanie sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (sortowanie FACS) w celu wzbogacenia komórek w ekspresję wirusa BAF60C, a następnie zakażenia komórek wirusem MyoD o wysokim mianie.
      1. Dodaj suplement do klonowania i odzyskiwania komórek hES do pożywki dzień przed sortowaniem.
      2. W dniu sortowania zdysocjuj komórki za pomocą TrypLE (zgodnie z opisem w dniu 0) i ponownie zawieś komórki w surowicy zastępczej KO oraz suplemencie do klonowania i odzyskiwania komórek hES w probówkach FACS.
      3. Pod koniec sortowania zbierz komórki w zastępczej surowicy KO i płytce na płytkach MEF, dodając suplement hES Cell Cloning & Recovery Supplement.

2. Indukcja i różnicowanie podobne do EB

  1. Procedura indukcji i różnicowania
    1. Dzień 0 - Indukcja EB
      1. Przed rozpoczęciem różnicowania od hESC zakażonych BAF60C/Myod upewnij się, że w studzience znajduje się duża liczba kolonii (ryc. 2C).
      2. Z każdej studzienki usunąć pożywkę, przemyć PBS i dodać 1 ml 1 mg/ml kolagenazy dożylnej. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      3. Usuń kolagenazę i dodaj 1 ml pożywki EB.
      4. Pod mikroskopem preparacyjnym szybko mechanicznie zdysocjuj kolonie na 400-800 agregatów komórkowych poprzez zeskrobanie końcówką o pojemności 10 ml.
      5. Zebrać kawałki kolonii do 15-mililitrowej probówki i pozostawić do osadzenia na 3 minuty. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w 3 ml pożywki EB i przenieść zawiesinę komórek do jednego dołka na 6-dołkowej płytce o niskim mocowaniu.
    2. Dzień 1
      1. Przed kontynuowaniem sprawdź wielkość kolonii i śmierć komórki. Jeśli obecne są duże kawałki, rozbij je, delikatnie pipetując w górę i w dół pipetą o pojemności 5 ml 3-4 razy. Jeśli śmierć komórki jest bardzo wysoka (wiele pływających komórek i zanieczyszczeń), zastąp pożywkę, zbierając grawitacyjnie agregaty w 15-mililitrowej probówce i pokryj je 3 ml świeżej pożywki EB, w przeciwnym razie postępuj w następujący sposób.
      2. Dodać 1,5 ml świeżej pożywki EB do studzienek
    3. Dzień 2
      1. Zmień pożywkę, zbierając kruszywa ze studzienek do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól im się uspokoić na 2 minuty.
      2. Usunąć supernatant, zastąpić 3 ml świeżej pożywki EB i ponownie rozprowadzić na tych samych studzienkach.
    4. Dzień 3
      1. Dodać 1,5 ml świeżej pożywki EB do studzienek.
    5. Dzień 4
      1. Postępuj zgodnie z opisem w "Dzień 2".
    6. Dzień 5 - Miogenne różnicowanie klastrów podobnych do EB (ryc. 2D).
      1. Zebrać agregaty zgodnie z opisem w ppkt 2.1.3.1 i przemyć raz 2 ml PBS; pozostawić je do osadu.
      2. Usunąć PBS i dodać 3 ml pożywki DM; płytkę na tych samych studzienkach.
    7. Dzień 6 - Dzień 20
      1. Od k6 do k20 co 3 dni wymieniaj pożywkę na świeżą. Reprezentatywne miosfery przedstawiono na rysunku 2E.
  2. Sprawdzanie różnicowania miosfery
    1. Zanim przejdziemy dalej, zaleca się sprawdzenie skuteczności różnicowania miogenicznego w obrębie miosfer poprzez wykonanie odcinków miosfer osadzonych w związku O.C.T., zgodnie z opisem w poprzednim protokole JoVE12. Wykonać barwienie immunofluorescencyjne dla markerów miogennych, takich jak miogenina (klon F5D, DSHB) i łańcuch ciężki miozyny (klon MF20, DSHB) (patrz Reprezentatywne wyniki).
      napiwek! Aby barwienie na obecność miogeniny na skrawkach EB zakończyło się sukcesem, konieczne jest pobranie antygenu poprzez leczenie dodecylosiarczanem sodu (SDS) 0,5% przez 5 minut. Dodatkowo możliwe jest zastosowanie tego protokołu do podwójnego barwienia przy użyciu przeciwciał F5D i MF20.

3. Przepisy medialne

  1. ESC medium
    DMEM-F12
    1 mM L-glutamina
    20% Środek zastępczy Knockout Serum (KOSR)
    0,1 mM aminokwasy endogenne (NEAA)
    50 j./ml penicyliny/streptomycyny (wstrzykiwacz/paciorkowiec)
    0,1 mM beta-merkaptoetanol
    8 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF)
  2. EB średni
    DMEM F12
    1 mM L-glutamina
    15% FBS
    5% surowicy końskiej
  3. DM średni
    DMEF F12
    1X Suplement do płynnych mediów ITS
    1X Suplement N-2

Wyniki

Rysunek 1A przedstawia schemat protokołu zaproponowanego do generowania miozfer z hESC. Krytycznymi krokami wymagającymi kontroli (oznaczonymi strzałkami) są wydajność infekcji hESC oraz konwersja miogenna w obrębie miozfer.

W naszych eksperymentach wykorzystujemy wektor lentiwirusem kodujący BAF60C, który niesie fluorescencję GFP. Zazwyczaj infekujemy komórki BAF60C, a następnie przeprowadzamy sortowanie FACS 72 h po infekcji, aby wzbogacić populację wykazującą ekspresję BAF60C. Gdy komórki osiągną około 70-80% konfluencji, infekujemy je lentiwirusem MyoD. Po pierwszej infekcji komórki zazwyczaj osiągają taką konfluencję w ciągu dwóch lub trzech dni.

Rycina 1B przedstawia poziomy ekspresji genów egzogennych jako krotność indukcji w stosunku do niezakażonych hESC. Rycina 1C przedstawia ekspresję i rozkład wprowadzonych czynników na poziomie białek. Ekspresja BAF60C jest ukazana jako fluorescencja GFP, natomiast ekspresję MyoD wykrywa się metodą immunofluorescencji z użyciem przeciwciała przeciwko MyoD. Dzień 0 uznajemy za dzień rozpoczęcia różnicowania zakażonych hESC w agregaty typu EB. Po 15 dniach w pożywce DM część mioosfer (zazwyczaj cała jedna studzienka) zostaje zatopiona w związku O.C.T.12 i poddana sekcjonowaniu w celu wykonania immunofluorescencji dla markerów miogennych, aby sprawdzić wydajność konwersji miogennej. Rycina 1D przedstawia reprezentatywne barwienie na miogeninę i ciężki łańcuch miozyny w optymalnym różnicowaniu miogennym. Mioosfery mogą mieć różne lub nietypowe kształty, co być może wynika z fuzji z mniejszymi mioosferami. Od 10. dnia można zaobserwować sporadyczne skurcze w mioosferach (patrz filmy 1 i 2).

Proces różnicowania mioblastów; analiza ekspresji genów; panel immunofluorescencji; badanie komórek macierzystych.
Rysunek 1. A) Schemat protokołu zastosowanego do generowania miosfer z hESC. B) Poziomy mRNA egzogennych genów w hESC zainfekowanych BAF60C i MyoD (H9-BM) monitorowane za pomocą qRT-PCR i przedstawione jako krotność indukcji w porównaniu do hESC zainfekowanych pozornie (H9-ctr). C) Obrazy immunofluorescencyjne wykazujące barwienie MyoD (czerwony) i fluorescencję BAF60C (zielony) wynikającą z obecności elementu IRES-GFP w wektorze. D) Immunofluorescencja wykonana na przekrojach miosfer barwionych na Myogeninę (MYOG), ciężki łańcuch miozyny (MyHC) oraz przeciwbarwionych DAPI (szczegóły w sekcji Immunofluorescencja). Pasek skali wynosi 100 µm.

proces przygotowania hESC i generowania mioosfer; obrazy mikroskopowe różnicowania komórkowego.
Rycina 2. Reprezentatywne zdjęcia wyglądu komórek na różnych etapach protokołu, od infekcji (część I) do różnicowania (część II). Pasek skali wynosi 100 µm. Podczas gdy struktury typu EB od d1 do d5 mają głównie kształt kolisty (D), mioosfery hodowane przez 15 dni zgodnie ze schematem na Rycini 1A wykazują nieprzewidywalny kształt i są heterogeniczne w kulturze; dwa przykłady przedstawiono w E i F.

Dyskusja

Proponowany tutaj protokół opisuje, w jaki sposób generować trójwymiarowe klastry kurczliwych włókien mięśniowych (miosfer) bezpośrednio z hESC. Proponowana strategia ma bezprecedensowy i niezwykły potencjał w zakresie produkcji mini mięśni w zawiesinie, które mogą być odpowiednie jako model "choroby w naczyniu" zarówno w testach przesiewowych, jak i badaniach rozwojowych. Co więcej, metoda generowania miosfer z hESC jest prosta i nie wymaga żadnego etapu sortowania FACS podczas różnicowania, co zwykle ma negatywny wpływ na wydajność odzyskanych komórek. Poza tym procedura sortowania podczas różnicowania zakłóciłaby agregację, ponieważ implikuje dysocjację EB na pojedyncze komórki.

Proponowana metoda opiera się na epigenetycznym przeprogramowaniu hESC za pomocą specyficznych czynników, MyoD i BaAF60C, które nie ulegają ekspresji w pluripotencjalnych embrionalnych komórkach macierzystych. MyoD i BAF60C zapewniają "rdzeń" kompleksu białkowego, który oznacza loci genomowe, z których następuje transkrypcja w celu aktywacji szkieletowego programu miogennego. Te dwa czynniki są dostarczane do komórek za pomocą infekcji lentiwirusowych, dlatego tak ważne jest uzyskanie wysokiej skuteczności infekcji obu czynników we wszystkich komórkach. Można to osiągnąć za pomocą wirusów o wysokim mianie lub wirusów wyposażonych w markery selekcyjne. Warunki hodowli odgrywają również ważną rolę w optymalizacji zakresu różnicowania miogenicznego. Proponujemy protokół różnicowania oparty na surowicy w celu różnicowania MyoD / BAF60C eksprymującego hESC w klastry prekursorów miogennych, a następnie inkubację w zdefiniowanej pożywce wolnej od surowicy (zawierającej insulinę transferynę - ITS) w celu osiągnięcia konwersji prekursorów miogennych do miotub szkieletowych. Możliwe jest jednak, że inne zdefiniowane pożywki mogą osiągnąć równe lub lepsze zróżnicowanie miogenne. Jednym z obecnych ograniczeń protokołu jest to, że opiera się on na użyciu płodowej surowicy bydlęcej, która oprócz tego, że zawiera wiele białek i substancji zwierzęcych, wykazuje różnice między partiami. Może to skutkować niższą wydajnością lub niejednorodnością konwersji miogennej w obrębie miosfer. Warto zauważyć, że nie wszystkie struktury podobne do EB pochodzące z hESC wykazujących ekspresję BAF60 / MyoD są miosferami; mianowicie, niektóre są agregatami podobnymi do EB w pełni złożonymi z włókien mięśniowych. Liczba miosfer normalnie pochodzących z hESC eksprymujących BAF60C i MyoD może wahać się od 30 do 60%, zgodnie z oszacowaniem na podstawie barwienia immunologicznego na odcinkach EB wykonanego na końcu protokołu (patrz Wyniki). Potencjalnym podejściem do wzbogacenia naczynia hodowlanego tylko dla miosfer byłoby użycie reportera miogenicznego. Ułatwiłoby to odrzucenie częściowo lub niezróżnicowanych gromad podobnych do EB i wybranie tylko miosfer.

Wreszcie, lepsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw czasowych wymogów dotyczących wprowadzonych czynników byłoby przydatne w celu udoskonalenia metody dostarczania. Na przykład, jeśli BAF60C i MyoD są potrzebne tylko przez krótki czas, aby "kopnąć" komórki we właściwym kierunku, można zastosować metody oparte na zmodyfikowanym dostarczaniu mRNA. W przeciwieństwie do tego, jeśli czynniki są wymagane przez dłuższy czas, zanim komórki wykorzystają swoje endogenne białka, zalecane byłoby podejście episomalne w celu wyeliminowania zmienności i niekontrolowanych skutków wynikających z integracji w genomie. Na koniec zauważamy, że obowiązkowa jest ekspresja BAF60C przed lub w tym samym czasie co MyoD (nigdy po) w celu osiągnięcia konwersji hESC do mięśni szkieletowych. Wymóg wcześniejszej ekspresji BAF60C przypuszczalnie opiera się na jego roli w wstępnym ustawieniu krajobrazu epigenetycznego dla prawidłowej dystrybucji chromatyny MyoD w genomie6,15. W związku z tym przyszłe protokoły mogą zostać ulepszone dzięki związkom lub innym manipulacjom, które promują ekspresję BAF60C w hESC.

Oświadczenia

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

PLP jest współpracownikiem naukowym Sanford Children's Health Research Center. Prace te zostały wsparte następującymi grantami dla PLP: R01AR056712, R01AR052779 i P30 AR061303 z National Institute of Health/National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS), MDA i Sanford Children Health Research award. Prace te częściowo skorzystały z funduszy badawczych z Siódmego Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej w ramach projektu FP7-Zdrowie - 2009 ENDOSTEM 241440 (Aktywacja komórek macierzystych związanych z naczyniami krwionośnymi i komórek macierzystych mięśni w celu naprawy i utrzymania tkanki mięśniowej). SA był wspierany przez stypendium CIRM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 6-dołkowaCorning3506
6-dołkowa niska płytka mocującaCorning3471
GFR MatrigelBD Biosciencies356231
MEFs (zatrzymane wzrost)14
Collagenase IVInvitrogen17104-019
DMEM-F12Invitrogen15-090-CV
KOSRInvitrogen10828-028
1 mM L-glutamina (100X)Invitrogen35050-61
Pen/Strep (100X)Invitrogen15070-063
2-merkaptoetanolInvitrogen21985-023
NEAA (100X)Invitrogen11140-050
PolybreneMilliporeTR-1003-G
ITS Płynny suplement do mediówSigmaI3146
N2-suplement Invitrogen17502-048
TrypLE expressInvitrogen12605-010
FBSHyCloneSH30396.03
HSInvitrogen16050114
hES Klonowanie komórek i Suplement regeneracyjnyStemgent01-0014-100
bfgfSigma4114-TC
mTeSR1Stemcell Technologies5850
Anti-MyoDBD Biosciences554130
Anti-MyHCDSHBMF20
Anti-myogeninDSHBF5D

Bibliografia

  1. Darabi, R., et al. Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells. Nat Med. 14, 134-143 (2008).
  2. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).
  3. Iacovino, M., et al. Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells. Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).
  4. Barberi, T., et al. Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells. Nat Med. 13, 642-648 (2007).
  5. Goudenege, S., et al. Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation. Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).
  6. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. Embo J. 31, 301-316 (2012).
  7. Albini, S., et al. Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres. Cell Rep. 3, 661-670 (2013).
  8. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).
  9. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  10. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  11. Ho, L., et al. An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).
  12. Gomes, I. C., et al. Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies. J Vis Exp. (46), (2010).
  13. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
  14. Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M. Human embryonic stem cell cardiogenesis. Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam. 227-237 (2007).
  15. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

lentiwirus MyoDlentiwirus BAF60Cr nicowanie mi ni szkieletowychagregaty typu EBr nicowanie w warunkach beze syjnychbarwienie immunofluorescencyjnemarkery miogenne
Generowanie miosfer z hESC poprzez przeprogramowanie epigenetyczne
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.