Tutaj opisujemy proces barwienia immunologicznego czułków Drosophila przez całe mocowanie, co pozwala nam lepiej zrozumieć mechanizmy molekularne związane z dywersyfikacją neuronów receptorów węchowych (ORN).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Znakowanie immunologiczne całej góry neuronów receptora węchowego w antenie Drosophila
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Cząsteczki odorantu wiążą się ze swoimi docelowymi receptorami w precyzyjny i skoordynowany sposób. Każdy receptor rozpoznaje określony sygnał i przekazuje tę informację do mózgu. W związku z tym określenie, w jaki sposób informacje węchowe są przekazywane do mózgu, modyfikując zarówno percepcję, jak i zachowanie, zasługuje na badania. Co ciekawe, pojawiają się dowody na to, że transdukcja komórkowa i czynniki transkrypcyjne są zaangażowane w różnicowanie neuronu receptora węchowego. Tutaj zapewniamy solidną metodę znakowania immunologicznego całej góry do oznaczania organizacji neuronów receptora węchowego in vivo. Korzystając z tej metody, zidentyfikowaliśmy wszystkie neurony receptorów węchowych z przeciwciałem anty-ELAV, znanym markerem pan-neuronalnym i Or49a-mCD8::GFP, neuronem receptora węchowego specyficznie wyrażanym w neuronie Nba za pomocą przeciwciała anty-GFP.
Wprowadzenie
System węchowy służy do rozróżniania ogromnej różnorodności cząsteczek zapachowych, a następnie do wysyłania wynikowych informacji do wyższych ośrodków mózgu. Dane te są wykorzystywane do precyzyjnej kontroli podstawowych zachowań zwierząt, takich jak karmienie i krycie1-6. Ponieważ każdy typ neuronu węchowego jest związany z określonym zestawem zapachów, zróżnicowanie neuronów receptorów węchowych (ORN) jest niezbędne do prawidłowego funkcjonowania układu węchowego7.
Genetyka Drosophila umożliwia nam przeprowadzenie badań na poziomie pojedynczej komórki, obejmujących mechanizmy molekularne związane z rozwojem ORN i funkcją fizjologiczną 8-16. Barwienie immunologiczne całego wierzchowca czułków Drosophila umożliwiło nam bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów molekularnych zaangażowanych w dywersyfikację neuronów receptorów węchowych (ORN)7. W tym miejscu przedstawiamy wyczerpujący opis prostej metody, aby to osiągnąć.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotuj talerz z jabłkami
- Wymieszaj 12,5 g agaru, 125 ml 100% dostępnego w handlu soku jabłkowego, 12,5 g glukozy i 375 mlH2O. Mieszaninę podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 1 do 2 minut i przelać do 3-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Krzyżówka genetyczna
- Zastosować następującą reprezentatywną krzyżówkę genetyczną:
Or49a-mCD8::GFP/CyO x w1118
3. Protokół preparacji i barwienia
- Znieczul muchę, a następnie przetnij głowę muchy pionowo, trzymając ją za pomocą kleszczy.
- Ostrożnie umieść czułki zawierające porcję na talerzu z jabłkami.
- Wytnij trzeci segment anteny za pomocą cienkich nożyczek do preparowania.
- Umieścić 90 μl roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu w 0,1% PBST (PBS z 0,1% Triton X-100)) na środku naczynia hodowlanego ze szklanym dnem.
- Delikatnie przenieś wypreparowane czułki ostrą igłą bezpośrednio do roztworu utrwalającego. W razie potrzeby fizycznie zanurz anteny w roztworze za pomocą igły.
- Inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej (RT). Umyj anteny w 0,4% PBST (PBS z 0,4% Triton X-100), 3x 10 minut w każdej, trzymając je w tym samym naczyniu. Użyj żółtych końcówek, aby usunąć i dodać roztwór PBST. Za każdym razem należy stosować 90 μl roztworu myjącego.
UWAGA: Nie umieszczaj naczynia w shakerze podczas immunohistochemii. Przed wyjęciem lub dodaniem roztworu do naczynia należy za pomocą igły umieścić wszystkie czułki na środku naczynia i ostrożnie dodać lub usunąć roztwór z krawędzi naczynia. - Zatkać czułki 90 μl 5% normalnej surowicy końskiej w 0,1% PBST na 20 minut w temperaturze pokojowej.
- Po usunięciu roztworu blokującego inkubować czułki z 90 μl przeciwciał pierwszorzędowych w 0,1% PBST zawierającym 5% surowicy końskiej przez 48 godzin w temperaturze 4 °C w wilgotnym pojemniku, jak opisano wcześniej8.
- Umyj anteny 6 razy po 10 minut w 0,4% PBST.
- Inkubować czułki z 90 μl przeciwciał drugorzędowych w 0,1% PBST zawierającym 5% surowicy końskiej przez 48 godzin w temperaturze 4 °C. Myć 6 x 10 minut używając 0,4% PBST.
- Aby zamontować anteny, usuń PBST z naczynia hodowlanego tak bardzo, jak to możliwe i stopniowo wprowadzaj do anten dwa różne stężenia glicerolu. Najpierw dodaj 40% glicerolu do naczynia na 1 do 2 minut; Następnie usuń to i dodaj 80% glicerolu.
- Ostrożnie wyjmij czułki (w tym 80% glicerolu) z naczynia hodowlanego za pomocą żółtej końcówki i umieść je na szkiełku. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Anteny są teraz gotowe do zobrazowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kluczowym czynnikiem warunkującym powodzenie niniejszego protokołu jest zapewnienie szybkiego przeprowadzenia zarówno sekcji, jak i fiksacji. Równie istotne jest użycie precyzyjnych nożyczek i pęset. Po immunobarwieniu anteny znakowane fluorescencyjnie badano pod mikroskopem konfokalnym. Zazwyczaj wykonujemy przekroje o grubości 1µm przy użyciu obiektywu 20x. Znakowaliśmy neurony receptorowe węchowe (ORNs) typu Nba7 za pomocą Or49a-mCD8::GFP i liczyliśmy liczbę ORNs Nba w antenach typu dzikiego. Reporter mCD8-...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Sekcja opisywanej przez nas anteny Drosophila jest prosta i łatwa do wykonania w warunkach laboratoryjnych. Aby zapewnić udaną sekcję, konieczne jest użycie nożyczek o cienkich krawędziach. Podczas barwienia immunologicznego wypreparowanej anteny ważne jest, aby inkubować je w pojemniku wypełnionym wilgocią, aby uniknąć parowania roztworu przeciwciała. Wypreparowana antena ma tendencję do unoszenia się w roztworze. Użycie 0,1% Tritonu w PBS podczas etapów utrwalania i blokowania ułatwi zanurzenie anteny w roztwo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Program MEXT dla Fundacji Badań Strategicznych na Prywatnych Uniwersytetach oraz grant JSPS Young Scientist B dla H.T. Chcielibyśmy podziękować Ohtake Norihito za montaż klipów wideo.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop preparacyjny Stemi DV4 | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Naczynia hodowlane ze szklanym dnem | MatTek corporation | P35G-0-10-C | |
| Nożyczki do preparacji | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| anty-ELAV Szczur | Hybridoma Bank | 7E8A10 | Rozcieńczenie 1:200 |
| Mysz anty-GFP | Invitrogen | A11122 | Rozcieńczenie 1:400 |
| Osioł IgG | IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | Rozcieńczenie 1:200 |
| Osioł Anty-Szczurzy IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | Rozcieńczenie 1:200 |
Bibliografia
- Christensen, T. A., White, J. Representation of olfactory information in the brain In The Neurobiology of Taste and Smell. , New York. 201-232 (2000).
- Ache, B. W. Towards a common strategy for transducing olfactory information. Sem. Cell Biol. 5, 55-63 (1994).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction. C. elegans. Cell. 13, 515-527 (1993).
- Barth, A. L., Justice, N. J., Ngai, J. Asynchronous onset of odorant receptor expression in the developing zebrafish olfactory system. Neuron. 16, 23-34 (1996).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Stockinger, P., et al. Neural circuitry that governs Drosophila male courtship behavior. Cell. 121, 795-807 (2005).
- Endo, K., et al. Chromatin modification of Notch targets in olfactory receptor neuron diversification. Nat Neurosci. 15, 224-233 (2011).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. , (2011).
- Suh, G. S., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Sachse, S., Galizia, C. G. Role of inhibition for temporal and spatial odor representation in olfactory output neurons: A calcium imaging study. J Neurophysiol. 87, 1106-1117 (2002).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117, 965-979 (2004).
- Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. An olfactory sensory map in the fly brain. Cell. 102, 147-159 (2000).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. J. Molecular, anatomical and functional organization of the Drosophila olfactory system. Curr Biol. 15, 1535-1547 (2005).
- Clyne, P., et al. Odorant response of individual sensilla on the Drosophila antenna. Invert Neurosci. 3, 127-135 (1997).
- Vosshall, L. B., et al. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96, 725-736 (1999).
- Wang, J. W., et al. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112, 271-282 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
