Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Adaptacja półautomatycznych testów na krążące komórki nowotworowe (CTC) do zastosowań klinicznych i przedklinicznych

15.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51248

⸱

28 lutego 2014

 ,  ,  , 
1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine and Dentistry, Western University, 3Special Hematology/Flow Cytometry, London Health Sciences Centre, 4Lawson Health Research Institute, 5Department of Oncology, Western University

W tym artykule

Podsumowanie

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są prognostyczne w kilku nowotworach przerzutowych. Ten manuskrypt opisuje złoty standard systemu CellSearch (CSS) platformy wyliczania CTC i zwraca uwagę na typowe błędy błędnej klasyfikacji. Ponadto opisano dwa dostosowane protokoły do definiowanej przez użytkownika charakterystyki markerów CTC i liczenia CTC w przedklinicznych mysich modelach przerzutów przy użyciu tej technologii.

Streszczenie

Większość zgonów związanych z rakiem następuje po rozwoju choroby z przerzutami. Ten wysoce śmiertelny etap choroby jest związany z obecnością krążących komórek nowotworowych (CTC). Wykazano, że te rzadkie komórki mają znaczenie kliniczne w przerzutowym raku piersi, prostaty i jelita grubego. Obecnie złotym standardem w klinicznym wykrywaniu i liczeniu CTC jest zatwierdzony przez FDA system CellSearch (CSS). Niniejszy manuskrypt przedstawia standardowy protokół wykorzystywany przez tę platformę, a także dwa dodatkowe dostosowane protokoły, które opisują szczegółowy proces optymalizacji markerów zdefiniowanych przez użytkownika do charakterystyki białek CTC pacjentów oraz porównywalny protokół wychwytywania CTC w bardzo małych objętościach krwi, przy użyciu standardowych odczynników CSS, do badań in vivo przedkliniczne mysie modele przerzutów. Ponadto podkreślono różnice w jakości CTC między krwią zdrowego dawcy wzbogaconą komórkami z hodowli tkankowej a próbkami krwi pacjentów. Na koniec przedstawiono kilka często rozbieżnych elementów, które mogą prowadzić do błędów błędnej klasyfikacji CTC. Podsumowując, protokoły te będą stanowić użyteczne źródło informacji dla użytkowników tej platformy zainteresowanych badaniami przedklinicznymi i klinicznymi dotyczącymi przerzutów i CTC.

Wprowadzenie

Szacuje się, że w 2013 roku 580 350 osób umrze na raka, a 1 660 290 nowych przypadków tej choroby zostanie zdiagnozowanych w samych StanachZjednoczonych1. Większość tych zgonów następuje po rozwoju choroby z przerzutami2. Obecny brak skutecznych terapii w leczeniu przerzutów i ograniczona wiedza na temat kaskady przerzutowej sprawiają, że ten etap choroby jest wysoce śmiertelny. Wykazano, że obecność krążących komórek nowotworowych (CTC) w krwiobiegu koreluje z chorobą przerzutową3. Komórki te są niezwykle rzadkie, a ich wykrycie wskazuje na całkowite przeżycie w przerzutowym raku piersi4, prostaty5 i jelita grubego6. U tych pacjentów obecność ≥5 (piersi i prostaty) lub ≥3 (jelito grube) CTC w 7,5 ml krwi wskazuje na gorsze rokowanie w porównaniu z pacjentami z mniejszą liczbą wykrywalnych CTC w tej samej objętości krwi lub bez nich. Ponadto wykazano, że zmiana liczby CTC w trakcie lub po interwencji terapeutycznej jest przydatna jako predyktor odpowiedzi na leczenie, często wcześniej niż obecnie stosowane techniki7-10.

Oszacowano, że u pacjentów z rakiem z przerzutami, CTC występują z częstotliwością około 1 CTC na 105-10 7 komórek jednojądrzastych krwi, a u pacjentów z miejscową chorobą, częstotliwość ta może być jeszcze niższa (~1 na 108). Rzadkość występowania tych komórek może utrudniać dokładne i wiarygodne wykrywanie i analizowanie CTC11. Zastosowano kilka metod (omówionych wcześniej12-14) w celu wzbogacenia i wykrycia tych komórek poprzez wykorzystanie właściwości, które odróżniają je od otaczających składników krwi. Ogólnie rzecz biorąc, wyliczanie CTC jest procesem dwuczęściowym, który wymaga zarówno kroku wzbogacania, jak i etapu wykrywania. Tradycyjnie, etapy wzbogacania opierają się na różnicach we właściwościach fizycznych CTC (wielkość komórki, gęstość, odkształcalność) lub na ekspresji markerów białkowych (tj. cząsteczka adhezji komórek nabłonka [EpCAM], cytokeratyna [CK]). Po wzbogaceniu wykrywanie CTC można przeprowadzić na wiele różnych sposobów, z których najczęstszym są testy oparte na kwasach nukleinowych i/lub podejścia cytometryczne. Każda z tych strategii jest wyjątkowa, ma wyraźne zalety i wady, jednak wszystkie brakuje standaryzacji; konieczność wejścia w środowisko kliniczne. W związku z tym opracowano system CellSearch (CSS), aby zapewnić ustandaryzowaną metodę wykrywania i liczenia rzadkich CTC w ludzkiej krwi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i technik opartych na przeciwciałach4-6. Platforma ta jest obecnie uważana za złoty standard w liczeniu CTC i jest jedyną techniką zatwierdzoną przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do użytku w klinice15.

CSS to dwuskładnikowa platforma składająca się z: (1) systemu CellTracks AutoPrep (zwanego dalej instrumentem przygotowawczym), który automatyzuje przygotowanie próbek krwi ludzkiej, oraz (2) CellTracks Analyzer II (zwanego dalej instrumentem do analizy), który skanuje te próbki po przygotowaniu. Aby odróżnić CTC od zanieczyszczających leukocytów, przyrząd do przygotowania wykorzystuje metodę separacji magnetycznej za pośrednictwem przeciwciał, opartą na ferrofluidach i różnicowe barwienie fluorescencyjne. Początkowo system znakuje CTC za pomocą przeciwciał anty-EpCAM sprzężonych z nanocząstkami żelaza. Próbka jest następnie inkubowana w polu magnetycznym, a wszystkie nieznakowane komórki są odsysane. Wybrane komórki nowotworowe są ponownie zawieszane i inkubowane w różnicowym barwieniu fluorescencyjnym, składającym się z przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie i odczynnika do barwienia jądrowego. Na koniec próbka jest przenoszona do wkładu magnetycznego, zwanego MagNest (zwanego dalej urządzeniem magnetycznym) i skanowana za pomocą przyrządu analitycznego.

Przyrząd do analizy służy do skanowania przygotowanych próbek za pomocą różnych filtrów fluorescencyjnych, z których każdy jest zoptymalizowany pod kątem odpowiedniej cząstki fluorescencji, przy użyciu soczewki obiektywowej 10X. CTC są identyfikowane jako komórki, które są związane przez anty-EpCAM, anty-pan-CK-fikoerytrynę (PE) (CK8, 18 i 19) i barwnik jądrowy 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI). I odwrotnie, zanieczyszczające leukocyty są identyfikowane jako komórki związane przez anty-CD45-allofikocyjaninę (APC) i DAPI. Po skanowaniu użytkownikowi prezentowane są zdefiniowane komputerowo potencjalne komórki nowotworowe. Na podstawie tych obrazów użytkownik musi przeprowadzić analizę jakościową przy użyciu zdefiniowanych parametrów i barwienia różnicowego omówionego powyżej, aby określić, które zdarzenia są CTC.

Oprócz dostarczania ustandaryzowanej metody liczenia CTC, CSS pozwala na molekularną charakterystykę CTC na podstawie interesujących markerów białkowych. Badanie to można przeprowadzić na poziomie pojedynczej komórki, przy użyciu kanału fluorescencyjnego izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), który nie jest wymagany do identyfikacji CTC16. Chociaż platforma ta zapewnia możliwość charakterystyki molekularnej, szczegółowy proces opracowywania i optymalizacji protokołów nie jest dobrze zdefiniowany. Trzy dostępne na rynku markery zostały opracowane przez producenta do stosowania z CSS, w tym receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) i receptor insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1R). Analiza HER2, w połączeniu z CSS, została wykorzystana przez kilka grup w celu zilustrowania potencjału charakterystyki CTC w podejmowaniu decyzji klinicznych i potencjalnej zmianie istniejących wytycznych dotyczących leczenia. Na przykład Fehm i wsp.17 wykazało, że około jedna trzecia pacjentek z rakiem piersi z guzami pierwotnymi HER2 miała HER2 + CTC. Ponadto Liu i wsp.18 niedawno poinformowało, że do 50% pacjentów z przerzutowym rakiem piersi HER+ nie miało HER2+ CTC. Herceptin, przeciwciało monoklonalne zakłócające receptor HER2, które wykazało, że przynosi ogromne korzyści pacjentom, u których guzy wyrażają wystarczający poziom HER2, jest powszechnie stosowanym leczeniem u pacjentów z guzami pierwotnymi HER2+ 19-21. Jednak badania te sugerują, że Herceptin może być stosowany nieoptymalnie, a charakterystyka CTC może pomóc w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie. Ostatecznie charakterystyka CTC może mieć potencjał do poprawy spersonalizowanej opieki.

Badania CTC są wyjątkowe, ponieważ w dużej mierze wykorzystują podejście od łóżka do stołu. Ta metoda, w przeciwieństwie do badań klinicznych prowadzonych od pacjenta do łóżka pacjenta, które często mogą trwać latami, aby wpłynąć na opiekę nad pacjentem, umożliwiła CTC szybkie wejście do środowiska klinicznego. Jednak lekarze niechętnie wykorzystują wyniki analizy CTC w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia pacjentów ze względu na brak zrozumienia ich podstawowej biologii. W związku z tym należy zastosować odpowiednie przedkliniczne mysie modele przerzutów i uzupełniające techniki analizy CTC w celu zbadania tych nierozstrzygniętych kwestii. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją dwa rodzaje modeli przedklinicznych stosowanych do badania kaskady przerzutowej: (1) modele spontanicznych przerzutów, które pozwalają na badanie wszystkich etapów kaskady przerzutowej, oraz (2) eksperymentalne modele przerzutów, które pozwalają tylko na badanie późniejszych etapów procesu przerzutowego, takich jak wynaczynienie i wtórne tworzenie się guza22. Modele spontanicznych przerzutów polegają na iniekcjach komórek nowotworowych w odpowiednie miejsca ortotopowe (np. wstrzyknięcie komórek raka prostaty do gruczołu krokowego w celu zbadania raka gruczołu krokowego). Komórki mają następnie czas na utworzenie guzów pierwotnych i spontaniczne przerzuty do miejsc wtórnych, takich jak kości, płuca i węzły chłonne. Natomiast eksperymentalne modele przerzutów obejmują bezpośrednie wstrzyknięcie komórek nowotworowych do krwiobiegu (np. przez żyłę ogonową lub wstrzyknięcie dosercowe do komórek docelowych w określone miejsca), a zatem pomijają początkowe etapy wewnątrznaczynienia i rozsiewu do narządów wtórnych22. Do tej pory większość analiz CTC w systemach modelowych in vivo przeprowadzono przy użyciu technik CTC opartych na cytometrii23 lub dostosowanych technik CTC opartych na ludziach (np. AdnaTest)24. Chociaż jest to przydatne, żadna z tych technik nie odzwierciedla odpowiednio wyliczania CTC przy użyciu złotego standardu CSS. W oparciu o aprobatę kliniczną, ustandaryzowany charakter i powszechne stosowanie CSS, opracowanie techniki wychwytywania i wykrywania CTC do modelowania in vivo, która wykorzystuje równoważne kryteria przygotowania, przetwarzania i identyfikacji próbki, byłoby korzystne, ponieważ wyniki byłyby porównywalne z wynikami uzyskanymi z próbek pobranych od pacjentów. Jednak ze względu na wymagania dotyczące objętości przyrządu do przygotowywania, nie jest możliwe przetwarzanie małych objętości krwi za pomocą tej zautomatyzowanej platformy. Ponadto wcześniejsze prace Eliane i wsp.25 wykazało, że zanieczyszczenie próbek komórkami nabłonkowymi myszy (które również spełniają standardową definicję CTC [EpCAM+CK+DAPI+CD45-]) może prowadzić do błędnej klasyfikacji mysich komórek nabłonka płaskonabłonkowego jako CTC. Aby rozwiązać te problemy, opracowano dostosowaną technikę, która umożliwia wykorzystanie odczynników z zestawu CSS CTC w połączeniu z procedurą ręcznej izolacji. Dodanie do testu przeciwciała przeciwko ludzkiemu antygenowi leukocytarnemu (HLA) znakowanemu FITC pozwala na odróżnienie ludzkich komórek nowotworowych od mysich komórek nabłonka płaskonabłonkowego.

Ten manuskrypt opisuje standardowy, komercyjnie opracowany i zoptymalizowany protokół CSS do przetwarzania próbek krwi pacjentów oraz typowe pułapki, które można napotkać, w tym rozbieżne elementy, które mogą prowadzić do błędów błędnej klasyfikacji CTC. Ponadto opisano dostosowanie testu CSS w celu zbadania zdefiniowanych przez użytkownika cech białkowych wychwyconych CTC oraz porównywalną dostosowaną technikę CSS, która pozwala na wzbogacanie i wykrywanie CTC z małych objętości krwi w przedklinicznych mysich modelach przerzutów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na ludziach opisane w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Radę Etyki Badań Naukowych Uniwersytetu Zachodniego. Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Podkomitet ds. Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Zachodniego.

1. Standardowe liczenie CTC na podstawie próbek krwi pacjenta za pomocą CSS

1. Pobieranie próbek krwi ludzkiej i przygotowanie ich do przetwarzania na urządzeniu do przygotowywania

  1. Stosując standardowe techniki upuszczania krwi aseptycznej, należy pobrać co najmniej 8,0 ml krwi ludzkiej do probówki CellSave o pojemności 10 ml (zwanej dalej probówką ze środkiem konserwującym CTC), która zawiera kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i zastrzeżony komórkowy środek konserwujący. Odwróć probówkę 5 razy, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Próbki mogą być przetwarzane natychmiast lub przechowywane w temperaturze pokojowej przez okres do 96 godzin.
  2. Wyjmij odczynniki CSS z lodówki i pozwól im ogrzać się do temperatury pokojowej przed użyciem.
  3. Za pomocą jednorazowej pipety o pojemności 10 ml i automatycznego pipetatora należy pobrać 7,5 ml krwi z probówki konserwującej CTC i powoli dozować krew do odpowiednio oznakowanej probówki do obróbki przyrządów do przygotowywania.
  4. Dodać 6,5 ml buforu rozcieńczającego do każdej próbki. Wymieszaj przez odwrócenie próbki 5x. Odwirować próbkę o masie 800 x g przez 10 minut z hamulcem w pozycji "wyłączonej". Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie przyrządu przygotowawczego, aby załadować wszystkie próbki pacjenta do systemu w celu przetworzenia. Próbki muszą zostać przetworzone w ciągu 1 godziny od przygotowania.

2. Kontroluj przygotowanie do przetwarzania na instrumencie przygotowawczym

  1. Delikatnie zmieszaj fiolkę kontrolną i odwróć 5x, aby wymieszać.
  2. Ostrożnie zdjąć nakrętkę z fiolki kontrolnej i umieścić odwróconą probówkę do przetwarzania przyrządów do przygotowania na wierzchu niezakorkowanej fiolki. Jednym szybkim ruchem odwróć fiolkę kontrolną i wlej zawartość do probówki do obróbki. Po odwróceniu delikatnie przesunąć boki fiolki kontrolnej, aby uwolnić pozostałą zawartość.
  3. Ostrożnie wyjąć odwróconą fiolkę kontrolną z probówki do obróbki, upewniając się, że nie doszło do utraty płynu i odłożyć na bok. Za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl zebrać pozostałą zawartość z fiolki i pokrywki, a następnie delikatnie pipetować do probówki do roztworu pokarmowego.
  4. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie przyrządu przygotowawczego, aby załadować układ sterowania do systemu w celu przetworzenia.

3. Skanowanie próbki na instrumencie analitycznym

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie przyrządu przygotowawczego, aby usunąć wszystkie próbki z systemu. Luźno zakręć każdy wkład z urządzeniem magnetycznym i postukaj w urządzenie magnetyczne za pomocą rąk lub ławki laboratoryjnej, aby uwolnić wszelkie pęcherzyki, które przykleiły się do krawędzi wkładu. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków mocno zakręć wkład, połóż urządzenie magnetyczne płasko i inkubuj w ciemności przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej. Próbki należy zeskanować w ciągu 24 godzin od przygotowania.
  2. Włącz przyrząd analityczny i zainicjuj lampę. Po podgrzaniu (~15 min) załaduj kasetę weryfikacyjną systemu na przyrząd analityczny i wybierz zakładkę Test kontroli jakości. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wykonać niezbędne środki kontroli jakości.
  3. Załaduj próbkę do przyrządu analitycznego i wybierz kartę Test pacjenta. Zostaną wyświetlone wszystkie zapisane informacje z przyrządu przygotowawczego. Kliknij przycisk Start, aby zainicjować skanowanie próbki. System wykona zgrubne ustawienie ostrości i wykrywanie krawędzi na wkładzie urządzenia magnetycznego.
  4. W razie potrzeby wyreguluj wszystkie krawędzie za pomocą kierunkowych. Wybierz opcję Akceptuj. System wykona precyzyjną ostrość i rozpocznie skanowanie próbki.
  5. Po skanowaniu kontrolnym wyniki powinny zostać zweryfikowane przy użyciu zdefiniowanych kryteriów dla komórek wzbogaconych o wysokie (CK+DAPI+CD45-APC+) i niskie (CK+DAPI+CD45-FITC+) stężenia. Po zeskanowaniu próbki pacjenta należy dokonać przeglądu wyników pod kątem wykrytych CTC przy użyciu zdefiniowanych kryteriów CTC (CK+DAPI+CD45-).

2. Charakterystyka CTC dla znaczników zdefiniowanych przez użytkownika za pomocą CSS

1. Przygotowanie znaczników zdefiniowanych przez użytkownika i inicjalizacja instrumentu

  1. Rozcieńczyć badane przeciwciało za pomocą rozcieńczalnika Bond Primary Antibody do pożądanego stężenia w kubku z odczynnikiem markerowym, stosując następujący wzór, gdzie stężenie robocze jest stężeniem przeciwciała po dodaniu do próbki, a stężenie podstawowe jest stężeniem przeciwciała w kubku na odczynnik. W przypadku wielu próbek należy dostosować objętości przeciwciał zgodnie z opisem w Tabeli 1. Umieść kubek na odczynnik ze znacznikiem w pozycji 1 w kartridżu z odczynnikiem i załaduj wkład na CSS.
    Stężenie podstawowe = (Stężenie robocze x 850 μl) / 150 μl
  2. Pobrać krew, przygotować próbki i załadować przyrząd przygotowawczy zgodnie z opisem w powyższym standardowym liczeniu CTC z próbek krwi pacjenta przy użyciu protokołu CSS. Aby włączyć dodawanie markera niestandardowego, wybierz Test zdefiniowany przez użytkownika po wyświetleniu monitu przez przyrząd przygotowawczy. Wprowadź nazwę znacznika i wybierz pozycję Zapisz. Gdy próbki są ładowane do urządzenia, operator zostanie poproszony o wskazanie, które z nich powinny otrzymać niestandardowy znacznik, wybierając Tak lub Nie w razie potrzeby.

2. Próbkowanie markerów zdefiniowanych przez użytkownika na urządzeniu do analizy

  1. Włącz przyrząd analityczny, zainicjuj lampę i przeprowadź kontrolę jakości oraz weryfikację systemu zgodnie z opisem w sekcji 3.2 standardowego liczenia CTC z próbek krwi pacjenta przy użyciu protokołu CSS.
  2. Załaduj próbkę do przyrządu analitycznego i wybierz kartę Ustawienia. Aby zainicjować kanał FITC, wybierz CellSearch CTC jako identyfikator zestawu w sekcji Protokoły testowe. Z tego menu wybierz CTC Research, kliknij przycisk Edytuj i ustaw czas ekspozycji zgodnie z potrzebami. Zaleca się, aby nie przekraczać czasu ekspozycji wynoszącego 1,0 sekundy podczas korzystania z zestawu CSS CTC, ponieważ może to zwiększyć przenikanie do innych kanałów fluorescencyjnych wykorzystywanych do identyfikacji CTC.

3. Adaptacja standardowego CSSProtocol do stosowania w przedklinicznych modelach myszy

**Na podstawie zestawu Veridex Mouse/Rat CellCapture (już niedostępnego na rynku)

1. Pobieranie i przechowywanie krwi myszy

  1. Przed pobraniem krwi przepuść ~30 μl 0,5 M EDTA tam iz powrotem przez iz powrotem przez igłę 22 G, pozostawiając niewielką ilość EDTA w piaście.
  2. Zbierz co najmniej 50 μl krwi myszy od myszy, którym wcześniej wstrzyknięto ludzkie komórki nowotworowe drogą ortotopową, żyłą ogonową lub drogą wewnątrzsercową. Pobrać krew z żyły odpiszczelowej (do seryjnej analizy CTC) lub przez nakłucie serca (do końcowej analizy CTC). Wyjąć igłę i dozować krew do 1 ml probówki do pobierania krwi z mikrotainerem EDTA. Wymieszaj przez odwrócenie lub delikatnie przesuń probówkę, aby zapobiec krzepnięciu krwi. Krew może być przetworzona natychmiast lub przechowywana w temperaturze pokojowej przez okres do 48 godzin po dodaniu równej objętości komórkowego środka konserwującego CytoCex.

2. Wzbogacenie CTC

  1. Wyjmij odczynniki CSS z lodówki i pozwól im ogrzać się do temperatury pokojowej przed użyciem.
  2. Przenieść ekwiwalent 50 μl krwi pełnej do probówki do cytometrii przepływowej o wymiarach 12 mm x 75 mm. Dodać 500 μl buforu rozcieńczającego do każdej próbki, zmywając krew pozostałą na ściankach probówki. W razie potrzeby można użyć krótkiego wirowania wirówki, aby zebrać pozostałą krew.
  3. Delikatnie wymieszać ferrofluid anty-EpCAM i dodać 25 μl do każdej próbki, umieszczając końcówkę pipety bezpośrednio w próbce. Dodaj 25 μl odczynnika Capture Enhancement i delikatnie wymieszaj. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
  4. Umieścić probówki z próbkami w magnesie i inkubować przez 10 minut. Gdy probówki z próbkami nadal znajdują się w magnesie, użyj szklanej pipety, aby ostrożnie zassać pozostałą ciecz, nie dotykając ścianki rurki obok magnesu i wyrzuć.

3. Barwienie CTC

  1. Wyjmij probówki z próbką z magnesu i ponownie zawieś w 50 μl barwnika kwasu nukleinowego, 50 μl odczynnika barwiącego, 1,5 μl anty-mysiego CD45-APC, 5,0 μl anty-ludzkiego HLA-Alexa Fluor 488 i 100 μl odczynnika do permeabilizacji. W przypadku wielu próbek odczynniki te można wstępnie zmieszać, a do każdej probówki dodać 206,5 μl mieszaniny. Delikatnie wirować, aby wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  2. Dodać 500 μl buforu rozcieńczającego, delikatnie przemieszać, umieścić probówki z próbkami w magnesie i inkubować przez 10 minut. Gdy probówki z próbkami nadal znajdują się w magnesie, użyj szklanej pipety, aby ostrożnie zassać pozostałą ciecz, nie dotykając ścianki rurki obok magnesu i wyrzuć. Wyjąć probówki z próbkami z magnesu i ponownie zawiesić w 350 μl buforu rozcieńczającego. Delikatnie zmieszaj.

4. Ładowanie urządzenia magnetycznego

  1. Za pomocą końcówki ładującej żel ostrożnie przenieś całą objętość z probówki z próbką do wkładu w urządzeniu magnetycznym. Zacznij od dna wkładu i powoli wyjmuj końcówkę w miarę dozowania próbki.
  2. Po przeniesieniu całej próbki luźno zakryj wkład urządzenia magnetycznego i postukaj w urządzenie magnetyczne za pomocą rąk lub stołu laboratoryjnego, aby uwolnić wszelkie pęcherzyki, które przykleiły się do krawędzi wkładu, jak opisano w sekcji 3.1 standardowego liczenia CTC z próbek krwi pacjenta za pomocą CSS.
  3. Usuń wszelkie bąbelki za pomocą sterylnej igły 22 G, chwytając je między skosem a krawędzią wkładu. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków mocno zakręć wkład, połóż urządzenie magnetyczne płasko i inkubuj w ciemności przez co najmniej 10 minut. Próbki należy zeskanować w ciągu 24 godzin od przygotowania.

5. Skanowanie ręcznie oddzielonych próbek na urządzeniu do analizy

  1. Włącz przyrząd analityczny, zainicjuj lampę i przeprowadź kontrolę jakości oraz weryfikację systemu zgodnie z opisem w sekcji 3.2 standardowego liczenia CTC z próbek krwi pacjenta przy użyciu protokołu CSS.
  2. Załaduj próbkę do przyrządu analitycznego i wybierz kartę Ustawienia. Wyczyść wszystkie istniejące dane na przycisku danych urządzenia magnetycznego, klikając przycisk Formatuj próbkę. Włącz kanał FITC i ustaw czas ekspozycji na 1.0 s, jak opisano w sekcji 2.2 charakterystyki CTC dla markerów zdefiniowanych przez użytkownika za pomocą CSS.
  3. Kliknij kartę Test pacjenta i wybierz opcję Edytuj, aby wprowadzić informacje o próbce. Wybierz CellSearch CTC jako identyfikator zestawu i badania CTC jako protokół testowy. Wprowadź pozostałe niezbędne informacje, jak oznaczono gwiazdką. Zapisz przykładowe informacje i kliknij przycisk Uruchom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Standardowy test zliczania CTC

Czułość i swoistość systemu CSS zostały dobrze udokumentowane w literaturze. Jednak w celu walidacji równoważnego odzysku CTC, próbki krwi ludzkiej od zdrowych ochotników, wzbogacone (1 000 komórek raka prostaty człowieka LNCaP) oraz niewzbogacone, przetworzono w systemie CSS zgodnie ze standardowym protokołem CSSCTC. Zgodnie z oczekiwaniami, próbki niewzbogacone były wolne od CTC (0,00±0,00%), a odzysk CTC w próbkach wzbogaconych wyniósł 86,9±4,71% (Rycina ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pomimo rozwoju wielu nowych technologii CTC od czasu wprowadzenia CSS w 2004 roku, technika ta jest nadal jedyną klinicznie zatwierdzoną technologią na rynku i dlatego jest uważana za obecny złoty standard w wykrywaniu i liczeniu CTC. Manuskrypt ten wykazał, że chociaż CSS ma rygorystyczne standardy kontroli jakości, może być narażony na stronniczość interpretacyjną i że identyfikacja CTC w próbkach od pacjentów znacznie różni się od identyfikacji w próbkach wzbogaconych. Zidentyfikowano sześć kategorii często rozbieżnyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor (A.L.A.) otrzymał dofinansowanie, które zostało zapewnione przez Janssen Oncology, którego firma macierzysta Johnson & Johnson jest również właścicielem Janssen Diagnostics LLC, która produkuje odczynniki i instrumenty użyte w tym artykule.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Ontario Institute of Cancer Research (#08NOV230), Canada Foundation for Innovation (#13199), Prostate Cancer Canada, Janssen Oncology, London Regional Cancer Program, oraz wsparcie darczyńców od Johna i Donny Bristol za pośrednictwem London Health Sciences Foundation (dla A.L.A.). L.E.L. jest wspierany przez Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship Doctoral Award. A.L.A jest wspierana przez CIHR New Investigator Award oraz Early Researcher Award przyznawaną przez Ministerstwo Badań i Innowacji Ontario.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 M EDTA
Anty-ludzki CD44-FITCBD Pharmigen555478
Anty-ludzki CD44-PEBD Pharmigen555479
Anty-ludzki HLA-Alexa Fluor 488BioLegend311415
Anty-mysi CD45-APCeBioscience17-0451-82
Bond Primary Antibody DiluentLeicaAR9352
Tubki konserwujące CellSaveVeridex952820 (20 szt.) 79100005 (100 szt.)
Zestaw kontrolny CTCCellSearch Veridex7900003
Zestaw CTC CellSearchVeridex7900001
Zestaw kontrolny CellSearch CXCVeridex7900018RUO
Zestaw CellSearch CXCVeridex7900017RUO
Bufor do narzędziVeridex7901003
Streck Cell Preservant (aka CytoChex)Streck213350
1 ml Strzykawka
10 ml Pipeta
1,000 &mikro; l Pipeta
1,000 &mikro; l Końcówki
12 mm x 75 mm Rurki przepływowe
200 µ l Końcówki
200 i mikro; l Pipeta
22 G Igła
5 3/4 cala Jednorazowa pipeta PasteuraVWR14672-200
5 ml Pipeta
Automatyczny pipet
Probówka kapilarna do pobierania krwi (EDTA)BD Microtainer365974
Analizator CellSearch IIVeridex9555Zawiera magnesy i kartridże weryfikacyjne
System AutoPrep CellSearch Wirówka
R& D SystemsMAG997
Mała żarówka lateksowaVWR82024-550
Vortex
serologicznado pipetładujące żelserologiczna Veridex 9541 Magnes MagCellect 

Bibliografia

  1. Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics. 63 (1), 11-30 (2013).
  2. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat. Rev. Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  3. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nat. Rev. Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  4. Cristofanilli, M., Budd, G. T., et al. Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. New Engl. J. Med. 351 (8), 781-791 (2004).
  5. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  6. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Prognostic significance of circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer. Ann. Oncol. 20 (7), 1223-1229 (2009).
  7. Hayes, D. F., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells at each follow-up time point during therapy of metastatic breast cancer patients predict progression-free and overall survival. Clin. Cancer Res. 12 (14), 4218-4224 (2006).
  8. Budd, G. T., Cristofanilli, M., et al. Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin. Cancer Res. 12 (21), 6403-6409 (2006).
  9. Olmos, D., Arkenau, H. -T., et al. Circulating tumour cell (CTC) counts as intermediate end points in castration-resistant prostate cancer (CRPC): a single-centre experience. Ann. Oncol. 20 (1), 27-33 (2009).
  10. De Bono, J. S., Scher, H. I., et al. Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin. Cancer Res. 14 (19), 6302-6309 (2008).
  11. Allan, A. L., Keeney, M. Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic. J. Oncol. 2010, 426218 (2010).
  12. Lowes, L. E., Goodale, D., Keeney, M., Allan, A. L. Image cytometry analysis of circulating tumor cells. Methods Cell Biol. 102, 261-290 (2011).
  13. Lianidou, E. S., Markou, A. Circulating tumor cells in breast cancer: detection systems, molecular characterization, and future challenges. Clin. Chem. 57 (9), 1242-1255 (2011).
  14. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Circulating tumor cells: liquid biopsy of cancer. Clin. Chem. 59 (1), 110-118 (2013).
  15. Parkinson, D. R., Dracopoli, N., et al. Considerations in the development of circulating tumor cell technology for clinical use. J. Transl. Med. 10, 138 (2012).
  16. Lowes, L. E., Hedley, B. D., Keeney, M., Allan, A. L. User-defined protein marker assay development for characterization of circulating tumor cells using the CellSearch system. Cytomet. A. 81 (11), 983-995 (2012).
  17. Fehm, T., Müller, V., et al. HER2 status of circulating tumor cells in patients with metastatic breast cancer: a prospective, multicenter trial. Breast Cancer Res. Treat. 124 (2), 403-412 (2010).
  18. Liu, Y., Liu, Q., et al. Circulating tumor cells in HER2-positive metastatic breast cancer patients: a valuable prognostic and predictive biomarker. BMC Cancer. 13, 202 (2013).
  19. Slamon, D. J., Leyland-Jones, B., et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. New Engl. J. Med. 344 (11), 783-792 (2001).
  20. Marty, M., Cognetti, F., et al. Randomized phase II trial of the efficacy and safety of trastuzumab combined with docetaxel in patients with human epidermal growth factor receptor 2-positive metastatic breast cancer administered as first-line treatment: the M77001 study group. J. Clin. Oncol. 23 (19), 4265-4274 (2005).
  21. Slamon, D., Eiermann, W., et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. New Engl. J. Med. 365 (14), 1273-1283 (2011).
  22. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin. Exp. Metast. 15 (3), 272-306 (1997).
  23. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry A. 75 (4), 344-355 (2009).
  24. Gorges, T. M., Tinhofer, I., et al. Circulating tumour cells escape from EpCAM-based detection due to epithelial-to-mesenchymal transition. BMC Cancer. 12, 178 (2012).
  25. Eliane, J. -P., Repollet, M., et al. Monitoring serial changes in circulating human breast cancer cells in murine xenograft models. Cancer Res. 68 (14), 5529-5532 (2008).
  26. White Pages, V. eridex , Available from: http://www.veridex.com/pdf/CXC_Application_Guideline.PDF (2008).
  27. Flores, L. M., Kindelberger, D. W., et al. Improving the yield of circulating tumour cells facilitates molecular characterisation and recognition of discordant HER2 amplification in breast. 102 (10), 1495-1502 (2010).
  28. Sieuwerts, A. M., Kraan, J., et al. Molecular characterization of circulating tumor cells in large quantities of contaminating leukocytes by a multiplex real-time PCR. Breast Cancer Res. Treat. 118 (3), 455-468 (2009).
  29. Cohen, S. J., Ja Punt, C., et al. Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression-free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 26 (19), 3213-3221 (2008).
  30. Allard, W. J., Matera, J., et al. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10 (20), 6897-6904 (2004).
  31. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y. J., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
  32. Yang, J., Weinberg, R. A Epithelial-mesenchymal transition: at the crossroads of development and tumor metastasis. Dev. Cell. 14 (6), 818-829 (2008).
  33. Gradilone, A., Raimondi, C., et al. Circulating tumour cells lacking cytokeratin in breast cancer: the importance of being mesenchymal. J. Cell. Mol. Med. 15 (5), 1066-1070 (2011).
  34. Königsberg, R., Obermayr, E., et al. Detection of EpCAM positive and negative circulating tumor cells in metastatic breast cancer patients. Acta Oncol. 50 (5), 700-710 (2011).
  35. Kasimir-Bauer, S., Hoffmann, O., Wallwiener, D., Kimmig, R., Fehm, T. Expression of stem cell and epithelial-mesenchymal transition markers in primary breast cancer patients with circulating tumor cells. Breast Cancer Res. 14 (1), (2012).
  36. Mego, M., Mani, S. A., et al. Expression of epithelial-mesenchymal transition-inducing transcription factors in primary breast cancer: The effect of neoadjuvant therapy. Int. J. Cancer. 130 (4), 808-816 (2012).
  37. Yu, M., Bardia, A., et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science. 339 (6119), 580-584 (2013).
  38. Armstrong, A. J., Marengo, M. S., et al. Circulating tumor cells from patients with advanced prostate and breast cancer display both epithelial and mesenchymal markers. Mol. Cancer Res. 9 (8), 997-1007 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kr ce kom rki nowotworowesystem poszukiwania kom rekwzbogacanie CTCcharakterystyka CTCmarkery definiowane przez u ytkownikamysie modele ksenoprzeszczep wselekcja pozytywna EpCAMbarwienie r nicoweprob wka do cytometrii przep ywowejkartrid urz dzenia magnetycznego
Adaptacja półautomatycznych testów na krążące komórki nowotworowe (CTC) do zastosowań klinicznych i przedklinicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.