Model stresu chirurgicznego guza myszy jest używany do zbadania, w jaki sposób pooperacyjne tłumienie odporności sprzyja chorobie przerzutowej i do oceny immunostymulujących terapii okołooperacyjnych.
Artykuł metodologiczny
Mysi model stresu chirurgicznego w celu zbadania mechanizmów pooperacyjnej immunosupresji i oceny nowych immunoterapii okołooperacyjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chirurgiczna resekcja jest podstawowym sposobem leczenia dla większości pacjentów z rakiem, ale operacja wywołuje dysfunkcję układu odpornościowego, co zostało powiązane z rozwojem choroby przerzutowej w modelach zwierzęcych i u pacjentów z rakiem. Prace przedkliniczne przeprowadzone przez naszą grupę i innych wykazały głęboką supresję wrodzonych funkcji immunologicznych, w szczególności komórek NK w okresie pooperacyjnym, co odgrywa główną rolę w zwiększonym rozwoju przerzutów po operacji. Stosunkowo niewiele badań na zwierzętach i prób klinicznych koncentrowało się na charakterystyce i odwróceniu szkodliwych skutków chirurgii nowotworowej. Korzystając z rygorystycznego modelu zwierzęcego spontanicznie przerzutujących guzów i stresu chirurgicznego, wykazano poprawę chirurgii nowotworów w zakresie rozwoju przerzutów do płuc. W tym modelu komórki raka piersi 4T1 są wszczepiane do poduszeczki tłuszczowej ssaka myszy. W 14 dniu po implantacji guza u wszystkich zwierząt przeprowadza się całkowitą resekcję pierwotnego guza sutka. Podgrupa zwierząt jest poddawana dodatkowemu stresowi chirurgicznemu w postaci nefrektomii brzusznej. W 28 dniu określa się ilościowo guzki guza płuc. Gdy immunoterapię zastosowano bezpośrednio przed operacją, wykryto głęboką aktywację komórek odpornościowych, która zapobiegała rozwojowi przerzutów po operacji. Podczas gdy model chirurgii guza piersi 4T1 pozwala na symulację wpływu stresu chirurgicznego w jamie brzusznej na przerzuty guza, należy przetestować jego zastosowanie do innych typów nowotworów. Obecnym wyzwaniem jest zidentyfikowanie bezpiecznych i obiecujących immunoterapii w przedklinicznych modelach mysich i przełożenie ich na realne terapie okołooperacyjne, które można podawać pacjentom po operacjach onkologicznych w celu zapobiegania nawrotom choroby przerzutowej.
Wprowadzenie
Chirurgia jest kluczowym elementem leczenia nowotworów litych, ale pomimo całkowitej resekcji, u wielu pacjentów dochodzi do nawrotu przerzutów i ostatecznie umiera z powodu choroby. Coraz częściej okres pooperacyjny, w wyniku fizjologicznej reakcji na stres chirurgiczny, w tym krzepnięcia krwi, uwalniania czynników wzrostu i supresji immunologicznej, jest uznawany za krytyczny czas dla rozwoju przerzutów. Nasza grupa1,2 i pozostali3-5 wykazali, że bezpośredni okres pooperacyjny jest wyjątkowo podatnym czasem na powstawanie przerzutów.
Jednym z kluczowych mechanizmów odpowiedzialnych za prometastatyczne efekty operacji jest pooperacyjna dysfunkcja komórek NK (Natural Killer)1-3. Komórki NK są cytotoksycznymi limfocytami wrodzonego układu odpornościowego biorącymi udział w kontroli wzrostu guza i przerzutów6. Dysfunkcja komórek NK po operacji została udokumentowana zarówno u pacjentów1,7-9, jak i na modelach zwierzęcych1,10,11. Pooperacyjna supresja komórek NK koreluje ze zwiększonymi przerzutami w modelach zwierzęcych przerzutów spontanicznych i zagnieżdżonych1,11-14, podczas gdy w badaniach na ludziach niska aktywność NK w okresie okołooperacyjnym wiąże się z wyższym wskaźnikiem nawrotów raka i śmiertelności15,16.
Pomimo tego, obecnie nie ma terapii przeciwnowotworowych, które konkretnie dotyczyłyby zmian prometastatycznych, które występują bezpośrednio po operacji raka. Okres okołooperacyjny stanowi terapeutyczne okno możliwości, w którym można interweniować w procesie przerzutowym. Podczas gdy tradycyjne terapie przeciwnowotworowe, takie jak chemioterapia cytotoksyczna, są uważane za zbyt toksyczne, aby można je było podawać pacjentom powracającym do zdrowia po poważnej operacji17, terapie immunologiczne są idealnymi kandydatami do stosowania w okresie okołooperacyjnym. Okołooperacyjne zastosowanie rekombinowanych IL-2 i IFN-γ zostało zbadane we wczesnych fazach badań klinicznych, wykazując ich potencjał w zapobieganiu pooperacyjnej supresji komórek NK i poprawie przeżycia wolnego od progresji18-21. Niestety, dalszy rozwój został zahamowany przez tolerancję tej terapii nieswoistymi cytokinami w połączeniu z poważną operacją17. Wirusy są również silnymi niespecyficznymi aktywatorami komórek NK. Nasze badania wykazały wcześniej, że przedoperacyjne podawanie replikujących się wirusów, takich jak nowe przeciwnowotworowe wirusy onkolityczne (OV) i niereplikujących się szczepionek wirusowych, takich jak szczepionka przeciw grypie, może hamować indukowaną chirurgicznie dysfunkcję komórek NK i łagodzić chorobę przerzutową1,22.
Model chirurgiczny opisany w tym artykule ułatwił nam zrozumienie mechanizmów związanych z rozprzestrzenianiem się i wzrostem komórek nowotworowych po operacji i pozwolił nam na zbadanie nowych terapii celowanych, które mogą być stosowane w okresie okołooperacyjnym. Aby osiągnąć ten cel, opracowano zwierzęcy model stresu chirurgicznego i spontanicznych przerzutów wad. Model wykorzystuje guzy raka piersi myszy (BALB/c - 4T1), które są zdolne do spontanicznych przerzutów z pierwotnego gruczołu sutkowego do wielu odległych miejsc, w szczególności do płuc. W dniu 0 komórki raka piersi są wszczepiane do poduszeczki tłuszczowej piersi myszy. W 14 dniu po implantacji guza u wszystkich zwierząt przeprowadza się całkowitą resekcję pierwotnego guza sutka. Podgrupa zwierząt jest poddawana dodatkowemu stresowi chirurgicznemu w postaci nefrektomii brzusznej. W 28 dniu guzki guzka guza płuc u myszy poddanych stresowi chirurgicznemu i myszy kontrolnych bez operacji są izolowane i określane ilościowo. W tym zwierzęcym modelu raka i chirurgii badany jest wpływ operacji na przerzuty nowotworowe i po raz pierwszy testowana jest skuteczność okołooperacyjnego podawania innowacyjnych immunoterapii, w tym replikujących i niereplikujących immunostymulantów na bazie wirusa.
Protokół
1. Utrzymanie komórek nowotworowych 4T1 in vitro
- Hodowla niezmodyfikowanych komórek nowotworowych 4T1 w kompletnym DMEM (DMEM, 10% FBS, 1x penicylina/streptomycyna) na 10 cm płytkach do hodowli tkankowej. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Dziel kultury 2-3 razy w tygodniu. Aby utrzymać optymalną żywotność, komórki nie powinny przekraczać 80% konfluencji. Nie należy używać komórek do tworzenia guzów pierwotnych in vivo, jeśli hodowle były pasażowane in vitro przez >1 miesiąc, ponieważ zmniejsza to złośliwość i potencjał przerzutowy niż wcześniej pasażowane komórki.
2. Pobieranie komórek nowotworowych 4T1 do iniekcji
- Odessać pożywkę hodowlaną z płytki do hodowli tkankowej za pomocą pipety Pasteura.
- Dodać 10 ml 1x sterylnego PBS zawierającego 2 ml EDTA. Pozostawić roztwór PBS do inkubacji na płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 inkubatorze do hodowli tkankowych przez 5-7 minut.
- Zebrać roztwór PBS z płytki, przepłukać płytkę 2-3x roztworem, przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g, w temperaturze 4 °C, w wirówce stołowej.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w DMEM bez surowicy.
- Określ stężenie komórek za pomocą licznika komórek.
- Rozcieńczyć komórki pożywką bez surowicy do 1x106 komórek/500 μl (1x105 komórek/50 μl (do wstrzykiwań i umieścić komórki na lodzie.
3. Wstrzykiwanie myszom komórek nowotworowych 4T1
Wszystkie przeprowadzone badania na zwierzętach były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi Służb Weterynaryjnych ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Ottawie, zaleceniami dla wszystkich zwierząt otrzymujących zastrzyki ortotopowe lub implanty nowotworowe.
- Myszy należy leczyć podskórnie buprenorfiną (0,05 mg/kg) na 1 godzinę przed zabiegiem w celu leczenia bólu.
- Indukować i utrzymywać mysz w znieczuleniu za pomocą 2,5% izofluranu w czasie trwania wstrzyknięcia. Ściśnij podnóżek myszy, aby wykryć reakcję odruchową. Jeśli nie zostanie wykryty, osiągany jest skuteczny poziom znieczulenia. Następnie nakładany jest sterylny lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
- Załaduj strzykawkę 30 G 1/2 cala "Ultra-fine" z dokładnie 50 μl zawiesiny komórek. Upewnij się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z kolumny strzykawki, stukając w bok strzykawki w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
- Umieść mysz (pod narkozą) brzuszną stroną do góry.
- Oczyścić miejsce wstrzyknięcia za pomocą wacika nasączonego alkoholem i wprowadzić igłę poziomo i bezpośrednio do 4. poduszeczki tłuszczowej sutka, powoli dozować objętość strzykawki.
- Użyj bawełnianego wacika, aby usunąć wszelkie możliwe wycieki.
- Pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu.
- Podtrzymuj buprenorfinę (0,05 mg/kg) w leczeniu bólu, podawaną podskórnie co 8 godzin przez 2 dni.
4. Leczenie okołooperacyjne u myszy 4T1 z BALB/c
Schemat leczenia i sposób podania szczepionki przeciw grypie jest identyczny jak w przypadku przedoperacyjnego leczenia wirusa onkolitycznego.
- Po 13 dniach od wstrzyknięcia komórek nowotworowych zmierz guz pierwotny za pomocą zewnętrznej suwmiarki. Zmierz największą średnicę (długość) wzdłużną i największą średnicę poprzeczną (szerokość) za pomocą suwmiarki. Zmodyfikowany wzór elipsoidalny służy do obliczania objętości guza (objętość guza = 1/2 (długość Ã — szerokość2)
- Po 13 dniach od wstrzyknięcia komórek nowotworowych guz pierwotny powinien mieć około 1 cm3. Po osiągnięciu tego pomiaru guza należy przygotować odczynnik do terapii okołooperacyjnej.
- Wirus onkolityczny jest jednym z innowacyjnych środków terapeutycznych, które można podawać w okresie okołooperacyjnym. Przygotować wirusa onkolitycznego (1x109 PFU/1 ml) w 1x sterylnym PBS i umieścić na lodzie przed wstrzyknięciem.
- Zabezpiecz i umieść mysz w ograniczniku w celu dożylnego wstrzyknięcia żyły ogonowej.
- Delikatnie podgrzej ogon myszy w ciepłej wodzie z kranu, aby uwidocznić boczne żyły ogonowe.
- Załaduj 27 G 1/2 do "strzykawki insulinowej" dokładnie 100 μl terapii wirusem onkolitycznym . Upewnij się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z kolumny strzykawki.
- Wstrzyknąć myszowi 1x108 PFU/100 μl/mysz do jednej z bocznych żył ogonowych. Jeśli igła zostanie prawidłowo wprowadzona do żyły bocznej, nie powinien być odczuwany żaden opór podczas wciskania strzykawki.
5. Całkowita resekcja guza pierwotnego i nefrektomia lewego brzucha
- Po 14 dniach od wstrzyknięcia komórek nowotworowych rozpocznij rutynową opiekę okołooperacyjną zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez University of Ottawa Animal Care and Veterinary Service. Myszy należy leczyć podskórnie buprenorfiną (0,05 mg/kg) na 1 godzinę przed zabiegiem w celu leczenia bólu. Podczas zabiegu należy wywołać i utrzymać znieczulenie za pomocą 2,5% izofluranu. W warunkach sterylizacji i przy użyciu sterylnych narzędzi chirurgicznych miejsce operowane jest golone i szorowane. Zwierzętom podaje się płyny podskórne i lubrykant do oczu przed operacją.
- Wykonaj małe nacięcie (o długości 1-2 cm), aby delikatnie i całkowicie usunąć pierwotny guz 4T1 z poduszeczki tłuszczowej sutka.
- Zamknij nacięcie 2-3 zszywkami 9 mm.
- Odsłoń brzuch, przecinając skórę i warstwę podskórną wzdłuż brzusznej linii środkowej myszy.
- Wykonaj nacięcie na kresie białej (3-4 cm), aby uzyskać dostęp do otrzewnej myszy.
- Odsłoń lewą wewnętrzną stronę brzucha, przesuwając leżące nad nią jelita na bok. Upewnij się, że jelita są wilgotne sterylną gazą nasączoną solą fizjologiczną.
- Używając kleszczy chirurgicznych, delikatnie chwyć lewą nerkę.
- Za pomocą powlekanego woskiem plecionego jedwabnego szwu 3-0 zawiązanego w pętlę, podwiąż wnękę lewej nerki i zabezpiecz 3 węzłami chirurgicznymi. Usuń lewą nerkę nożyczkami chirurgicznymi.
- Sprawdź dokładnie krawat szwów, aby upewnić się, że osiągnięto odpowiednią hemostazę.
- Zamknij warstwę podskórną ciągłym szwem pętelkowym za pomocą plecionego plecionego wchłanialnego 5-0, a następnie zszyj warstwę skóry za pomocą zszywek 9 mm. Kroki od 5.2 do 5.10 powinny wymagać 10 minut na zwierzę.
- Podtrzymuj buprenorfinę (0,05 mg/kg) w leczeniu bólu, podawaną podskórnie co 8 godzin przez 2 dni.
6. Eutanazja myszy oraz przetwarzanie i kwantyfikacja obciążenia nowotworem płuc
- Po 28 dniach od wstrzyknięcia guza 4T1 należy poddać myszy eutanazji zgodnie z protokołem opieki nad zwierzętami i usługami weterynaryjnymi na Uniwersytecie w Ottawie.
- Spryskaj mysz 70% etanolem.
- Wykonaj wstępne nacięcie nożyczkami tuż pod klatką piersiową.
- Odsłoń klatkę piersiową, przecinając skórę i warstwę podskórną wzdłuż brzusznej linii środkowej jamy klatki piersiowej myszy.
- Wykonaj boczne nacięcia przez skórę i tkankę z każdej strony, aż do szyi myszy.
- Wypreparuj płuca, delikatnie chwytając płuco, jednocześnie odcinając tkankę łączną powyżej i poniżej płuc.
- Wstępnie namocz wyekstrahowane płuca w zimnym PBS, aby usunąć resztki krwi, a następnie umieść w 10% buforowanej formalinie.
- Sfotografuj każde płuco w celu oceny przerzutów guza. Zważ płuca w celu ilościowego określenia obciążenia guza.
Wyniki
Opracowano powtarzalny model stresu chirurgicznego u myszy, który prowadzi do gwałtownego nasilenia przerzutów do płuc. W 28. dniu po inokulacji guza 4T1 (i 14 dni po resekcji guza +/- nefrektomii brzusznej) pobrano płuca i poddano je wizualizacji w celu wykrycia przerzutów. Operacja wyraźnie zwiększa liczbę przerzutów do płuc w porównaniu z myszami nieleczonymi, co wykazano na fotografiach płuc (Rycina 1A), podczas liczenia guzków w płucach (Rycina 1B) oraz na podstawie masy płuc (Rycina 1C). Przedoperacyjne podanie replikującego wirusa onkolitycznego oraz inaktywowanej szczepionki przeciw grypie znacząco niweluje prometastatyczne efekty operacji nowotworu (Ryciny 1A-C).
Aby ustalić, czy komórki NK odgrywają rolę pośredniczącą w zapobieganiu przerzutom po leczeniu szczepionką, zastosowano farmakologiczną deplecję komórek NK przy użyciu przeciwciał przeciwko asialo-GM-1 w modelu przerzutów nowotworowych. W przypadku braku komórek NK zaobserwowano zniesienie efektu terapeutycznego immunoterapii okołooperacyjnej (Rycina 2A oraz 2B). Dane te sugerują, że eliminacja przerzutów nowotworowych w naszym modelu stresu chirurgicznego jest zapośredniczona głównie przez aktywację komórek NK przez wirusa onkolitycznego i szczepionkę przeciw grypie oraz następującą po niej lizę nowotworu zależną od komórek NK. Aby dalej scharakteryzować funkcję komórek NK po okołooperacyjnym podaniu wirusa onkolitycznego i szczepionki przeciw grypie, oceniono zdolność komórek NK do zabijania ex vivo. W skrócie, połączone i posortowane komórki NK DX5+ wyizolowano ze splenocytów myszy poddanych stresowi chirurgicznemu oraz myszy kontrolnych. Hodowano je wspólnie przez 4 hr z komórkami docelowymi YAC-1 znakowanymi chromem, przy różnych stosunkach efektora do celu, a następnie zmierzono uwalnianie chromu do supernatantu za pomocą licznika gamma. Zaobserwowano znaczący deficyt cytotoksyczności komórek NK wywołany operacją, a także znaczną regenerację zdolności zabijania przez komórki NK po okołooperacyjnym podaniu wirusa onkolitycznego i szczepionki przeciw grypie w porównaniu do samej operacji (Rycina 2C oraz 2D). Podsumowując, wyniki te wykazują, że okołooperacyjną supresję komórek NK można skutecznie leczyć, a chorobę przerzutową redukować za pomocą nowych terapii immunostymulujących.
Rysunek 1. Nowy onkolityczny wirus przeciwnowotworowy i szczepionka przeciw grypie jako terapia okołoperacyjna przeciwko indukowanemu chirurgicznie nasileniu przerzutów do płuc. Ocena przerzutów guza 4T1 do płuc w 28. dniu w indicated grupach terapeutycznych na podstawie (A) zdjęć reprezentatywnych płuc, (B) zliczenia guzków nowotworowych w płucach oraz (C) masy płuc. Dane są reprezentatywne dla 3 podobnych eksperymentów z n=5-10/grupa (*, p =0.01;**, p <0.0001; n.s., brak istotności). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rysunek 2. Stres chirurgiczny zwiększa liczbę przerzutów nowotworowych do płuc poprzez upośledzenie komórek NK. (A,B) Ilościowe oznaczenie przerzutów nowotworowych do płuc u myszy poddanych stresowi chirurgicznemu i leczonych nową terapią okołoperacyjną. (C,D) Zdolność oczyszczonych komórek NK DX5+ pochodzących od myszy poddanych stresowi chirurgicznemu oraz od nieleczonych kontroli do zabijania komórek nowotworowych. Dane przedstawiono jako średni procent (+/- SD) uwalniania chromu z trzech powtórzeń dla wskazanych stosunków E:T. Dane są reprezentatywne dla 3 podobnych eksperymentów, gdzie n=4-5/grupa (*, p =0.01;**, p <0.005; n.s., brak istotności statystycznej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Dyskusja
Resekcja chirurgiczna jest podstawą terapii pacjentów z miejscowymi litymi nowotworami złośliwymi. Nawet przy całkowitej resekcji u wielu pacjentów dochodzi do nawrotu przerzutów i ostatecznie umiera z powodu choroby. Bezpośredni okres pooperacyjny stanowi idealne środowisko do powstawania przerzutów nowotworowych, modulowanych w dużej mierze przez pooperacyjną supresję komórek NK. Mimo to pozostaje oknem terapeutycznym, które jest w dużej mierze ignorowane. Obecnie nie ma standardowych okołooperacyjnych terapii przeciwnowotworowych mających na celu zapobieganie przerzutom pooperacyjnym. Obecnym wyzwaniem jest zidentyfikowanie bezpiecznych i obiecujących terapii, które aktywują komórki NK w okresie okołooperacyjnym, zapobiegając w ten sposób powstawaniu choroby z mikroprzerzutami. Terapie te muszą być rygorystycznie scharakteryzowane pod kątem bezpieczeństwa i skuteczności w przedklinicznych modelach zwierzęcych, a następnie przełożone na starannie zaprojektowane badania kliniczne.
Głównym założeniem opracowania mysiego modelu stresu chirurgicznego jest zbadanie mechanizmów supresji immunologicznej i rozprzestrzeniania się przerzutów po operacji oraz ocena innowacyjnych immunoterapii z potencjałem do przyszłego zastosowania u pacjentów z rakiem poddawanych operacji usunięcia guza pierwotnego. Aby osiągnąć ten cel, opracowano model mysiego raka sutka 4T1 w połączeniu ze stresem chirurgicznym. Podczas gdy linia komórkowa 4T1 jest mysim "rakiem sutka", powodem stosowania tej linii komórkowej jest odtwarzalność spontanicznych przerzutów, która pozwala nam ocenić skutki stresu chirurgicznego w realistycznym modelu raka. W tym kontekście rzeczywiste pochodzenie nowotworu jest mniej ważne niż potencjał przerzutowy i biologia guza. Drugim kluczowym elementem naszego modelu jest opracowanie procedury chirurgicznej na zwierzętach, która ma być bardzo podobna do chirurgii nowotworów u ludzi. W tym zwierzęcym modelu stresu chirurgicznego pierwotny guz piersi 4T1 jest wycinany po osiągnięciu 1 cm3. Ponieważ operacje onkologiczne u ludzi wiążą się ze znaczną supresją immunologiczną, dodatkowo wykonuje się nefrektomię z otwartym brzuchem w grupach leczonych "stresem chirurgicznym". W porównaniu z bardziej konwencjonalną resekcją guza u ludzi, inwazyjny charakter pełnej lewej nefrektomii jest bardzo porównywalny z wieloma rodzajami leczenia chirurgicznego nowotworów litych, w tym chirurgią raka jelita grubego, raka jajnika, raka nerki, raka trzustki, raka płuc i przełyku. Ponadto twierdzimy, że głębokie zmiany fizjologiczne, które zachodzą w okresie okołooperacyjnym, z powodu laparotomii + nefrektomii, odpowiednio odtwarzają przytłaczające zmiany fizjologiczne, które zachodzą po inwazyjnej operacji w przypadku większości litych nowotworów złośliwych. Aby kontrolować czynniki okołooperacyjne, które mogą prowadzić do nadmiernego stresu chirurgicznego i śmiertelności, czas trwania znieczulenia i operacji oraz utrzymanie temperatury ciała podczas operacji jest precyzyjnie określony. Wszystkie te parametry są precyzyjnie wykonane i zdefiniowane w naszym protokole chirurgicznym, aby odzwierciedlić rutynową opiekę okołooperacyjną u pacjentów z rakiem.
Czas leczenia okołooperacyjnego jest dodatkowym krytycznym elementem modelu ratownictwa okołooperacyjnego. Myszy z guzem 4T1 były wcześniej leczone 3 schematami szczepionki przeciw grypie: neoadjuwantową (podawaną 5 dni przed operacją), okołooperacyjną (podawaną w tym samym dniu operacji) i okołooperacyjną + wielodawkową (podawaną w dniu operacji, a następnie 2 dodatkowe dawki podane w odstępie 5 dni). Co ciekawe, wszystkie 3 sposoby leczenia szczepionką znacznie zmniejszyły przerzuty do płuc22. Jednak szczepionka przeciw grypie podawana okołooperacyjnie jako pojedyncza dawka najskuteczniej zmniejszała przerzuty. Podsumowując, eksperymenty te podkreślają znaczenie bezpośredniego okresu okołooperacyjnego jako wąskiego okna terapeutycznego do interwencji w procesie przerzutowym.
Okołooperacyjne stosowanie innowacyjnych immunoterapii, takich jak wirus onkolityczny i szczepionki, było ograniczone wyłącznie do naszej grupy badawczej. Po raz pierwszy wykazaliśmy, że okołooperacyjne podawanie nowych onkolitycznych wirusów ORF i krowianki może odwrócić supresję komórek NK po operacji w modelach zwierzęcych1. Co ważniejsze, to uratowanie funkcji immunologicznej koreluje ze zmniejszeniem pooperacyjnego powstawania przerzutów. W badaniach z udziałem ludzi pacjenci po operacji nowotworowej mieli zmniejszoną cytotoksyczność komórek NK, a okołooperacyjna OV znacznie zwiększa aktywność komórek NK u pacjentów z rakiem1. Stosując komercyjnie dostępne szczepionki profilaktyczne, wykazaliśmy, że okołooperacyjne podawanie szczepionki przeciw grypie znacznie zmniejszyło przerzuty nowotworu i poprawiło cytotoksyczność komórek NK w przedklinicznych modelach nowotworowych. W badaniach na ludziach szczepionka przeciw grypie znacząco zwiększyła aktywność komórek NK u zdrowych dawców i pacjentów po operacjach nowotworowych22.
W celu zmniejszenia nawrotów raka stosuje się wiele podejść, w tym chemioterapię i radioterapię, ale terapie te są zwykle stosowane na kilka tygodni lub miesięcy przed (neoadiuwant) lub po (adiuwantowa) operacji. Badania w tej dziedzinie pokazują, że bezpośredni okres pooperacyjny ma kluczowe znaczenie dla określenia długoterminowych wskaźników nawrotów nowotworu. Dlatego interwencje kliniczne w postaci immunoterapii w tym krytycznym okresie mogą przynieść znaczne długoterminowe korzyści. Nasze badania z wykorzystaniem mysiego modelu spontanicznych przerzutów do płuc i stresu chirurgicznego stanowią wyjątkową okazję do zbadania nowych terapii i określenia ich potencjału w zapobieganiu okołooperacyjnej immunosupresji u pacjentów po operacjach onkologicznych, a tym samym zmniejszeniu częstości nawrotów raka.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Autorzy pragną podziękować Kim Yates, Eileen Franklin i Rebecce Tjepkema (Animal Care and Veterinary Services, University of Ottawa) za pomoc w operacjach na zwierzętach. Lee-Hwa Tai jest wspierany przez Fonds de recherche santé Quebec Fellowship. Ta praca była wspierana przez granty operacyjne z Canadian Cancer Society Research Institute Innovation Grant, Nagroda Wczesnego Badacza Ministerstwa Badań i Rozwoju Ontario oraz Kanadyjska Fundacja Innowacji – Leader's Opportunity Grant dla Rebecci Auer.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle (DMEM) | Corning Cell-Gro | 10-013-CV | |
| Inaktywowana płodowa surowica bydlęca (FBS) | HyClone | SH30396.03 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Gibco | 15070-063 | |
| 1x Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) | Corning Cell Gro | 21-031-CV | |
| Buprenorfina | Chiron, Guelph | ||
| Isoflurane | Baxter Corp | 1001936040 | |
| 1/2 Ultracienka strzykawka | Terumo | 30 G, SS05M3009 | |
| 9 mm Zszywki | Braintree | ACS BX | |
| 5-0 Pleciony szew wchłanialny | Covidien | UL-202 | |
| 3-0 Woskowy pleciony jedwabny szew | Covidien | S-194 | |
| Formalin | Fisher | SF100-20 | |
| 4T1 Komórki nowotworowe | ATCC | CRL-2539 | |
| Myszy BALB / c | Rivers Labs | Kod szczepu: 028 |
Bibliografia
- Tai, L. H., et al. Preventing postoperative metastatic disease by inhibiting surgery-induced dysfunction in natural killer cells. Cancer Res. 73, 97-107 (2013).
- Seth, R., et al. Surgical Stress Promotes the Development of Cancer Metastases by a Coagulation-Dependent Mechanism Involving Natural Killer Cells in a Murine Model. Ann. Surg. , (2012).
- Shakhar, G., Ben-Eliyahu, S. Potential prophylactic measures against postoperative immunosuppression: could they reduce recurrence rates in oncological patients. Ann. Surg. Oncol. 10, 972-992 (2003).
- Shiromizu, A., et al. Effect of laparotomy and laparoscopy on the establishment of lung metastasis in a murine model. Surgery. 128, 799-805 (2000).
- Tsuchiya, Y., et al. Increased surgical stress promotes tumor metastasis. Surgery. 133, 547-555 (2003).
- Lanier, L. L. NK cell recognition. Annu. Rev. Immunol. 23, 225-274 (2005).
- Espi, A., Arenas, J., Garcia-Granero, E., Marti, E., Lledo, S. Relationship of curative surgery on natural killer cell activity in colorectal cancer. Dis. Colon Rectum. 39, 429-434 (1996).
- Pollock, R. E., Lotzova, E., Stanford, S. D. Mechanism of surgical stress impairment of human perioperative natural killer cell cytotoxicity. Arch. Surg. 126, 338-342 (1991).
- Pollock, R. E., Lotzova, E., Stanford, S. D. Surgical stress impairs natural killer cell programming of tumor for lysis in patients with sarcomas and other solid tumors. Cancer. 70, 2192-2202 (1992).
- Ben-Eliyahu, S., Page, G. G., Yirmiya, R., Shakhar, G. Evidence that stress and surgical interventions promote tumor development by suppressing natural killer cell activity. Int. J. Cancer. 80, 880-888 (1999).
- Page, G. G., Blakely, W. P., Ben-Eliyahu, S. Evidence that postoperative pain is a mediator of the tumor-promoting effects of surgery in rats. Pain. 90, 191-199 (2001).
- Glasner, A., et al. Improving survival rates in two models of spontaneous postoperative metastasis in mice by combined administration of a beta-adrenergic antagonist and a cyclooxygenase-2 inhibitor. J. Immunol. 184, 2449-2457 (2010).
- Benish, M., et al. Perioperative use of beta-blockers and COX-2 inhibitors may improve immune competence and reduce the risk of tumor metastasis. Ann. Surg. Oncol. 15, 2042-2052 (2008).
- Goldfarb, Y., et al. Improving postoperative immune status and resistance to cancer metastasis: a combined perioperative approach of immunostimulation and prevention of excessive surgical stress responses. Ann. Surg. 253, 798-810 (2011).
- Tartter, P. I., Steinberg, B., Barron, D. M., Martinelli, G. The prognostic significance of natural killer cytotoxicity in patients with colorectal cancer. Arch. Surg. 122, 1264-1268 (1987).
- Fujisawa, T., Yamaguchi, Y. Autologous tumor killing activity as a prognostic factor in primary resected nonsmall cell carcinoma of the lung. Cancer. 79, 474-481 (1997).
- Guillot, B., Bessis, D., Dereure, O. Mucocutaneous side effects of antineoplastic chemotherapy. Expert Opin. Drug Saf. 3, 579-587 (2004).
- Deehan, D. J., Heys, S. D., Ashby, J., Eremin, O. Interleukin-2 (IL-2) augments host cellular immune reactivity in the perioperative period in patients with malignant disease. Eur. J. Surg. Oncol. 21, 16-22 (1995).
- Houvenaeghel, G., et al. Tolerance and feasibility of perioperative treatment with interferon-alpha 2a in advanced cancers. Int. Surg. 82, 165-169 (1997).
- Klatte, T., et al. Perioperative immunomodulation with interleukin-2 in patients with renal cell carcinoma: results of a controlled phase II trial. Br. J. Cancer. 95, 1167-1173 (2006).
- Oosterling, S. J., et al. Perioperative IFN-alpha to avoid surgically induced immune suppression in colorectal cancer patients. Histol. Histopathol. 21, 753-760 (2006).
- Tai, L. H., et al. Perioperative influenza vaccination reduces post-operative metastatic disease by reversing surgery-induced dysfunction in natural killer cells. Clin Cancer Res. , (2013).
Przedruki i uprawnienia
