$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Oświadczenie etyczne: Ta procedura jest zgodna z wytycznymi National Institutes of Health dla badań na zwierzętach (Przewodnik dla opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych) i jest zatwierdzona przez University of North Carolina Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Implantacja elektrody
Pierwszym krokiem jest wszczepienie elektrody. Na tym etapie elektroda jest jednostronnie wszczepiana do jądra podwzgórzowego (STN), małego jądra o znaczeniu translacyjnym w leczeniu choroby Parkinsona przy użyciu następujących metod:
- Sterylizuj cały sprzęt chirurgiczny za pomocą autoklawu lub roztworu antyseptycznego, jeśli autoklawowanie nie jest możliwe (np. w celu sterylizacji elektrod). Uwaga: jest to krótkoterminowa operacja przetrwania, dlatego niezbędna jest technika aseptyczna. Po zabiegu chirurgicznym zwierzęta mogą być obrazowane po krótkim okresie rekonwalescencji (48 godzin) lub nawet kilka tygodni później.
- Znieczulić szczura (dorosłe szczury Sprague-Dawley 250-400 g) za pomocą 2,5% izofluranu podawanego przez intubację dotchawiczą i respiratora dla małych zwierząt. Przymocuj szczura do stereotaktycznej ramy operacyjnej i przygotuj miejsce operacji przy użyciu technik aseptycznych.
- Przygotuj i upewnij się, że elektroda jest sterylna. Do tej procedury używana jest domowa 2-kanałowa elektroda wolframowa z mikrodrutem, chociaż wiele typów elektrod kompatybilnych z MRI będzie działać. Zastosowany typ elektrody może mieć wpływ na obszar tkanki uszkodzonej mechanicznie w wyniku zabiegu, obszar tkanki stymulowanej oraz dokładność implantacji, wpływając tym samym na ogólny wynik eksperymentu. Jeśli typ elektrody nie może być autoklawowany, użyj środka antyseptycznego powidonowo-jodowego, aby wysterylizować elektrodę w miarę możliwości.
- Za pomocą nożyczek usuń skórę głowy nad miejscem implantacji o średnicy około 1,5 cm, aby odsłonić bregmę i lambdę na czaszce. Usuń mięsień i powięź leżącą nad czaszką i zatamuj krwawienie za pomocą elektrokoagulacji.
- Podrap powierzchnię czaszki w wielu kierunkach skalpelem, aby poprawić przyczepność cementu dentystycznego (krok 1.8). Wypoziomuj Bregmę i Lambdę w kierunku poziomym.
- Aby wycelować w STN, w odległości 3,6 mm za Bregmą i 2,5 mm od linii bocznej do środkowej, użyj wiertarki elektrycznej z małą końcówką, aby utworzyć otwór na zadziory o średnicy około 1,5 mm. nuta: Dokładna lokalizacja STN w odniesieniu do współrzędnych stereotaktycznych może się różnić w zależności od szczepu, wagi i płci szczura. Dorosłe szczury tej samej płci powinny być wykorzystywane w celu zminimalizowania wszelkich różnic w lokalizacji. Jeśli to możliwe, należy wykorzystać przedoperacyjne skany anatomiczne lub śródoperacyjne nagrania elektryczne w celu zidentyfikowania lokalizacji STN na podstawie indywidualnego pacjenta. Ponadto miejsca zakończenia elektrod powinny być zweryfikowane histologicznie, aby zapewnić dokładność celu.
- Ostrożnie wykonaj nacięcie w oponie twardej i użyj małych kleszczy, aby przesunąć oponę twardą na boki otworu. Zatamuj krwawienie za pomocą sterylnej bawełny nasączonej solą fizjologiczną. Utwórz otwory na jedną lub więcej kompatybilnych z MR) i delikatnie włóż je do czaszki, aż będą stabilne. mogą być umieszczone w dowolnym miejscu, w którym nie będą zakłócać umieszczenia zewnętrznego łącznika elektrody DBS (np. nie bezpośrednio za ipsilaterem STN w stosunku do elektrody). Zalecamy umieszczenie na bocznych krawędziach czaszki, najlepiej bezpośrednio za szwem lambda. W tym momencie czaszka jest stosunkowo gruba, co zmniejsza prawdopodobieństwo, że uszkodzą korę mózgową". Uwaga: W tym protokole stosuje się mosiężne przycięte na długość 4-5 mm, chociaż odpowiednie są również plastikowe.
- Umieść elektrodę na ramieniu stereotaktycznym, upewniając się, że jest prosta i pionowa. Przyłóż elektrodę do Bregmy, a następnie przesuń elektrodę dokładnie 3,6 mm za Bregma i 2,5 mm z boku do linii środkowej i dotknij elektrodą powierzchni kory mózgowej. Z powierzchni kory włóż elektrodę 7,8 mm brzusznie. Współrzędne te są wyznaczane przez odniesienie do atlasu neuroanatomicznego1.
- Umieść warstwę cementu dentystycznego na czaszce, w tym czaszki i punkt wprowadzenia elektrody. Poczekaj, aż cement całkowicie stwardnieje przed wyjęciem elektrody z ramy stereotaktycznej. Zegnij elektrodę do tyłu i użyj dodatkowego cementu, aby pokryć resztę przewodu elektrody i łącznika, aby zapewnić trwałość.
2. Przygotowanie do fMRI
Drugim krokiem jest przygotowanie do fMRI, w tym ustawienie cewki i ustawienie sprzętu do monitorowania fizjologicznego.
- Zabezpiecz głowę zwierzęcia, aby zapobiec ruchowi podczas skanowania. Uwaga: Do mocowania głowy stosuje się tutaj niestandardowy plastikowy system prętów wewnątrzusznych. Umieść pręty w kanałach słuchowych i przymocuj do głowicy tak, aby głowica obracała się płynnie w kierunku pionowym bez obrotu w poziomie. Zabezpiecz pozycję głowy, mocując górne zęby do aparatu.
- Całkowicie znieczulić szczura i monitorować CO2 w pobliżu układu oddechowego, aby zapewnić stabilność podczas wszystkich skanów. Aby utrzymać znieczulenie, wentylację i kontrolować poziom CO2 w powietrzu podczas skanowania, zastosowano tutaj system wentylacji małych zwierząt kompatybilny z MR w połączeniu z parownikiem izofluranu, chociaż w podobny sposób można stosować różne środki znieczulające i uspokajające. Ustaw respirator na 45 oddechów/min z umiarkowaną objętością, około 500 ml/min powietrza jako objętość wyjściową. Ustawić izofluran na 2% i przenieść szczura do pomieszczenia skanowania. Podłącz wyjście respiratora do rurki dotchawiczej szczura i mocno dociśnij, aby zabezpieczyć. Kapnometrię należy uzyskać za pomocą rurki podłączonej jak najbliżej łącznika rurki dotchawiczej. Dostosuj objętość wentylacji, aby wytworzyć CO2 na końcu pływu od 2,6% do 3,3%.
- Użyj uchwytu na małe zwierzęta kompatybilnego z MR, aby włożyć szczura do skanera z cyrkulacyjną kąpielą z gorącą wodą w celu kontroli temperatury. Przyklej podkładkę wanny do uchwytu i przykryj ją czystym papierem chłonnym. Umieść szczura na łóżku z gorącą wodą.
- Monitorowanie temperatury i poziomu dwutlenku węgla jest niezbędne do BOLD fMRI, a nasycenie krwi tętniczej tlenem i tętno są również przydatnymi parametrami fizjologicznymi. Włóż sondę temperatury doodbytnicy kompatybilną z MR i przyklej ją do podstawy ogona, a następnie dostosuj temperaturę łaźni wodnej, aby utrzymać normalną temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Monitoruj nasycenie krwi tętniczej tlenem i tętno za pomocą systemu pulsoksymetrii dla małych zwierząt, utrzymując je odpowiednio na poziomie 95-98% i 250-350 uderzeń na minutę, które mogą się różnić w zależności od rodzaju zastosowanych środków znieczulających. Na nasycenie tlenem i tętno ma wpływ głębokość znieczulenia, objętość wentylacji i szybkość wentylacji. Objętość i szybkość wentylacji mogą wymagać starannego zrównoważenia w celu utrzymania odpowiedniego poziomu CO2 w okresie końcowym i odpowiedniego nasycenia tlenem.
- Cewka powierzchniowa jest potrzebna do akwizycji BOLD fMRI. Umieść cewkę powierzchniową jak najbliżej powierzchni głowy. Po zabezpieczeniu umieść pastę do zębów na powierzchni głowy na cementowej nasadce, aby zmniejszyć artefakty podatności w pobliżu powierzchni mózgu. Uwaga: Używamy domowej roboty cewki powierzchniowej nadajnika-odbiornika o średnicy wewnętrznej około 1,6 cm, chociaż większe cewki powierzchniowe mogą być używane do optymalizacji odpowiedzi BOLD w głębszych obszarach podkorowych.
- Podłącz elektrodę stymulującą do programowalnego systemu stymulatora elektrycznego. Uwaga: Używamy specjalnie zaprojektowanego programowalnego systemu wyzwalania TTL podłączonego do stymulatora bipolarnego w celu dostarczania impulsów elektrycznych zsynchronizowanych z wzbudzeniami RF ze skanów MR.
- W celu uspokojenia i paraliżu podczas zbierania danych fMRI należy zastosować koktajl deksmedetomidyny (0,1 mg/kg/godz., i.p.) i pankuronium (1 mg/kg/godz., i.p.) w połączeniu z małą dawką izofluranu w stężeniu 0,5%, aby zapobiec aktywności padaczkowej2. Do infuzji leku należy użyć pompy strzykawkowej zgodnej z MR, jeśli pompa ma być umieszczona w środowisku magnetycznym. Alternatywnie, niekompatybilną pompę można umieścić poza środowiskiem magnetycznym, pod warunkiem, że używany jest przedłużony przewód cewnika.
3. Pozyskiwanie danych fMRI
Trzecim krokiem jest akwizycja fMRI, w tym pozycjonowanie, podkładkowanie, skany anatomiczne i skany funkcjonalne. Zastosowano tu system o naprężeniu 9,4 Tesli z cewką powierzchniową domowej roboty, chociaż technika ta może być zaadaptowana do innych systemów wysokopolowych i komercyjnie produkowanych cewek MRI.
- Włóż szczura do skanera i umieść go na środku magnesu. Użyj trójpłaszczyznowego obrazu zwiadowczego, aby precyzyjnie wyśrodkować szczura w magnesie w odniesieniu do obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania, oraz podkładki FASTMAP, aby ujednolicić pole magnetyczne w obszarach zainteresowania.
- Użyj strzałkowej sekwencji rzadkiej ważonej T2 (FOV, 2,56 x 2,56 cm2; rozmiar matrycy, 256 x 256; grubość warstwy, 1,5 mm; TR/TE, 1500/11 ms; współczynnik RARY, 8; Flip Angle, 180°), aby znaleźć położenie spoidła przedniego i wyrównać kolejne obrazy do tego miejsca. Wyrównywanie ośmiowarstwowych pojedynczych skanów GE-EPI (FOV, 2,56 x 2,56 cm2; rozmiar matrycy, 96 x 96, zrekonstruowany do 128 x 128; grubość warstwy, 1 mm; TR/TE, 1000/14 ms) do tego punktu z orientacją koronalną.
- W przypadku skanów funkcjonalnych należy użyć 70 kolejnych skanów EPI z 1-sekundową rozdzielczością czasową zsynchronizowaną z wyjściem stymulacji, ustawioną na 20 sekund spoczynku, 10-sekundową stymulację, a następnie 40-sekundową przerwę. Odczekaj co najmniej 90 sekund między skanami, aby umożliwić powrót do stanu nerwowo-naczyniowego. Uzyskaj wiele powtarzających się skanów dla każdego parametru stymulacji, aby poprawić stosunek sygnału do szumu poprzez uśrednianie. Użyj serii fikcyjnych skanów (zwykle 4-8) bezpośrednio przed skanowaniem w celu redukcji szumów. Potwierdź odpowiedź BOLD w momencie pozyskiwania obrazu, aby zapewnić powodzenie eksperymentu, stosując metodę opisaną w sekcji 4, chociaż uśrednianie, korejestracja i zdzieranie czaszki mogą zostać pominięte w tym ustawieniu.
- Po zakończeniu skanowania funkcjonalnego należy użyć sekwencji RARE spin-echo ważonej metodą T2 (FOV, 2,56 x 2,56 cm2; rozmiar matrycy, 256 x 256; grubość warstwy, 1 mm; TR/TE, 2500/33 ms; średnie, 8) w celu zmierzenia anatomicznego położenia elektrody in vivo. Uzyskaj wiele odcinków koronalnych i strzałkowych, aby zmierzyć końcówkę artefaktu elektrody wzdłuż osi przedniej/tylnej, przyśrodkowej/bocznej i grzbietowej/brzusznej oraz potwierdzić umieszczenie elektrody. Mikroskopia rezonansu magnetycznego o wysokiej rozdzielczości (FOV, 1,8 x 1,28 cm; rozmiar matrycy, 360 x 256; grubość warstwy, 0,5 mm; TR/TE, 2500/12,6 ms; współczynnik RZADKOŚCI, 8; średnie, 280) mogą być wykorzystane do zbadania dokładnego położenia przewodu elektrody po usunięciu w stosunku do pobliskich struktur neuroanatomicznych i potwierdzenia dokładności umieszczenia elektrody3.
4. Przetwarzanie i analiza danych fMRI
Czwartym krokiem jest przetwarzanie i analiza danych fMRI, w tym generowanie map odpowiedzi i obliczanie procentowej zmiany sygnału BOLD. Można stosować niestandardowe programy działające w środowisku komputerowym (np. MATLAB) lub komercyjne narzędzia programowe fMRI (np. SPM, FSL lub AFNI).
- Zacznij od korejestracji obrazu i uśrednienia danych, najpierw w obrębie obiektu według częstotliwości, a następnie w odniesieniu do całego obiektu. Uwaga: Osiągamy to za pomocą kodów SPM.
- Wykonaj zdejmowanie izolacji czaszki w celu usunięcia tkanki innej niż mózgowa przy użyciu ręcznie zdefiniowanego obszaru zainteresowania (ROI) z progowaniem sygnału. Można stosować algorytmy automatycznego usuwania czaszki.
- Skompiluj mapy odpowiedzi, obliczając współczynnik korelacji związku między odpowiedzią BOLD w czasie a paradygmatem stymulacji dla każdego woksela. Konieczne może być opóźnienie paradygmatu o kilka sekund, aby uwzględnić opóźnienie w odpowiedzi hemodynamicznej. Ustanowiono istotny poziom na P < 0.05 po korekcie Bonferroniego. Można zastosować inne metody statystyczne. Korekcja dla wielokrotnych porównań przy użyciu teorii pola losowego lub korekcja na poziomie klastra oparta na losowym polu Gaussa może być wykonana zamiast poprawki Bonferroniego w celu uzyskania bardziej czułej analizy4. Uwaga: Opóźnienie hemodynamiczne może się różnić w zależności od docelowych regionów mózgu, zastosowanych środków farmakologicznych i parametrów fizjologicznych. Kluczowe znaczenie ma kontrolowanie tych parametrów, aby zapobiec zmienności w obrębie obiektu i między podmiotami.
- Określ ilościowo odpowiedź BOLD, definiując zwrot z inwestycji w celu wyodrębnienia danych dotyczących przebiegu czasowego. Uśrednij procentową zmianę sygnału dla wszystkich wokseli w tej samej strukturze anatomicznej. Można również zastosować analizę wokselową przy użyciu ogólnego modelu liniowego5.