Zanurzone drukowanie komórek na zmodyfikowanej powierzchni za pomocą mikroskopu z ciągłym przepływem

Summary

Ta technologia druku mikroprzepływowego 3D drukuje tablice komórek na zanurzonych powierzchniach. Opisujemy, w jaki sposób układy komórek są dostarczane mikroprzepływowo w komórkach przepływowych 3D na zanurzone powierzchnie. Drukując na zanurzonych powierzchniach, stworzono mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach.

Abstract

Drukowanie komórek do zastosowań mikromatrycowych wiąże się z poważnymi wyzwaniami, w tym problemem utrzymania fizjologicznie istotnego fenotypu komórki po wydrukowaniu, słabą organizacją i dystrybucją pożądanych komórek oraz niezdolnością do dostarczania leków i/lub składników odżywczych do wybranych obszarów w układzie. Nasza technologia druku mikroprzepływowego 3D jest wyjątkowo zdolna do uszczelniania i drukowania tablic komórek na zanurzonych powierzchniach w sposób zautomatyzowany i multipleksowany. Konstrukcja płynów 3D z matrycą komórek mikroprzepływowych (MFCA) umożliwia opuszczenie końcówki głowicy drukującej do studni lub naczynia wypełnionego cieczą i dociśnięcie do powierzchni w celu utworzenia uszczelnienia. Miękka silikonowa końcówka głowicy drukującej zachowuje się jak uszczelka i jest w stanie utworzyć odwracalne uszczelnienie poprzez wywieranie nacisku lub cofanie. Inne technologie drukowania komórek, takie jak drukarki szpilkowe lub atramentowe, nie mogą drukować w zastosowaniach zanurzonych. Drukowanie na zanurzonej powierzchni jest niezbędne do utrzymania fenotypów komórek i monitorowania tych komórek na powierzchni bez naruszania charakterystyki powierzchni materiału. Drukując na zanurzonych powierzchniach, wytwarzane są mikromacierze komórkowe, które umożliwiają badania przesiewowe leków i ocenę cytotoksyczności w wielu obszarach, w tym w raku, cukrzycy, stanach zapalnych, infekcjach i chorobach sercowo-naczyniowych.

Introduction

Ostatnie postępy w przemyśle farmaceutycznym doprowadziły do wzrostu zainteresowania wykorzystaniem mikromacierzy komórkowych w procesie odkrywania leków do badań przesiewowych leków i analiz cytotoksykologicznych^1,2,3. Opracowanie wysokoprzepustowych testów in vitro i metod badań przesiewowych z wykorzystaniem mikromacierzy komórkowych ułatwiłoby szybki i opłacalny rozwój potencjalnych leków, a także przyczyniłoby się do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat komórki^1,4. Tradycyjne podejście do badań przesiewowych z wykorzystaniem komórek wykorzystuje konwencjonalne platformy z płytkami studziennymi; Podejście to jest jednak ograniczone ze względu na wysokie koszty, ograniczoną przepustowość i ograniczoną zdolność do uzyskiwania informacji ilościowych na temat funkcji komórek^1,5. Ze względu na te ograniczenia, badania nad technologiami mikromacierzy komórkowych rozwijają się w zakresie molekularnej charakterystyki biologicznej, inżynierii tkankowej i badań przesiewowych leków^1,6. Do zalet mikromacierzy komórkowych zalicza się mniejsze zużycie próbek, minimalny wpływ informacji o maskowaniu niejednorodności fenotypu komórkowego, a co najważniejsze, możliwość automatyzacji testów dla zastosowań o większej przepustowości^1,7,8.

Przemysł farmaceutyczny obecnie wykorzystuje wysokoprzepustowe testy przesiewowe oparte na komórkach z jednowarstwowymi hodowlami komórkowymi 2D do badań przesiewowych leków na płytkach mikromiareczkowych⁹. Multipleksowanie komórek w studzienkach płytek do mikromiareczkowania oferuje potencjał wyższej przepustowości dzięki unikalnym opcjom eksperymentalnym. Co więcej, obecne technologie mikromacierzy komórkowych pozwalają na wysuszenie komórek, co może radykalnie zmienić fenotyp komórek w porównaniu z in vivo^10,11. Aby przezwyciężyć te problemy, zaprojektowano MFCA, który pokazano na rysunku 1. Konstrukcja płynów MFCA 3D umożliwia opuszczenie końcówki głowicy drukującej na rysunku 1 do kąpieli i dociśnięcie do powierzchni w celu utworzenia uszczelnienia. Miękka silikonowa końcówka głowicy drukującej zachowuje się jak uszczelka i tworzy odwracalne uszczelnienie. Technologia MFCA jest wyjątkowo dostosowana do interakcji z zanurzonymi powierzchniami, co jest wymagane zarówno w przypadku kultur komórkowych, jak i systemów warstw tkanek, i jest trudne lub niemożliwe w przypadku większości innych podejść. Piny lub druk atramentowy nie będą działać, a urządzenia mikroprzepływowe 2D nie nadają się do osadzania lub łączenia z dużymi tablicami dyskretnych plamek. Ponadto, poprzez miniaturyzację i lokalizację eksperymentu - mikromacierzy komórkowej - MFCA pokonuje główne problemy związane z wysokoprzepustowymi testami przesiewowymi opartymi na komórkach.

CFM wykorzystuje sieci kanałów 3D do cyklicznego przepływu próbek płynów o małej objętości w mikroskopijnych miejscach na powierzchni^12,13. Dzięki drukowaniu przepływowemu, biomolekuły, komórki i inne odczynniki są utrzymywane w płynnym środowisku przez cały proces drukowania, co umożliwia drukowanie wrażliwych biomolekuł i komórek bez ekspozycji na powietrze, co utrudnia obecne techniki drukowania komórek. Możliwe jest również drukowanie bezpośrednio z surowego materiału, takiego jak hybrydoma lub supernatanty, pod warunkiem, że na powierzchni matrycy znajduje się mechanizm wychwytywania. Celem tego manuskryptu jest szczegółowe wyjaśnienie zanurzonego drukowania dwóch typów komórek na powierzchni.

Protocol

1. Przygotowanie hodowli komórkowej

1. Przechowuj zapasy komórek NIH/3T3 w ciekłym azocie, aż będą gotowe do użycia.
2. Przygotuj kompletną pożywkę dla komórek NIH/3T3 za pomocą zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 mM buforem HEPES, 50 jednostek/ml penicyliny i 50 μg/ml streptomycyny.
3. Rozmrażać komórki przez 2-3 minuty w wstrząsającej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
4. Zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki i odwirować przy 1 500 x g przez 3 minuty.
5. Usunąć supernatant komórkowy bez naruszania osadu komórkowego.
6. Zawiesić komórki w 5 ml pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.
   1. Pobrać 10 μl zawiesiny komórek i umieścić w probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
   2. Dodać 10 μl błękitu trypanowego do zawiesiny komórek i wymieszać końcówką pipety.
   3. Pobrać pipetą 10 μl wybarwionych komórek do komory hemocytometru.
   4. Policz komórki w hemocytometrze przy 10-krotnym powiększeniu.
      1. Policz żywe komórki (małe, białe kulki) na 4 z 9 dużych kwadratów. Policz tylko żywe komórki, które nie wydają się ciemnoniebieskie z plamy Trypan Blue.
      2. Oblicz średnią liczbę komórek na duży kwadrat, co daje liczbę komórek x 10⁴ komórki/ml w oryginalnej zawiesinie komórek.
      3. Komórki nasienne o gęstości 1 x10⁵ komórek/ml o łącznej objętości 5 ml w każdej kolbie T25.
   5. Hoduj komórki do zbieżności od 70% do 80% przed rozpoczęciem eksperymentów. Odświeżaj nośniki co 2-3 dni lub w razie potrzeby.

2. Przygotowanie powierzchni druku

1. Zaznacz markerem prostokąt na spodzie 12-dołkowej płytki z polistyrenu poddanego działaniu kultur tkankowych (TCTPS) o rozmiarze głowicy drukującej (7 mm x 19 mm).
2. Odpipetować 50 μl płodowej surowicy bydlęcej do prostokątnego obszaru i rozprowadzić ją po całym obszarze za pomocą końcówki.
3. Pozostaw szalkę Petriego w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego O/N, aby plamka surowicy całkowicie wyschła. Płytki te należy przygotować nie później niż 2 dni przed użyciem.

3. Drukowanie zanurzone

1. Wypłucz głowicę drukującą wodą destylowaną.
   1. Napełnij szalkę Petriego o średnicy 60 mm wodą destylowaną i zanurz głowicę drukującą w powierzchni.
   2. Przepływać wodę destylowaną przez każdą z linii przez 2 minuty z prędkością 150 μl/min za pomocą pompy pneumatycznej.
   3. Wylej wodę z szalki Petriego i napełnij ją czystą wodą.
   4. Przesuń głowicę drukującą w górę i w dół w wodzie 3 razy.
2. Dokuj środek głowicy drukującej nad miejscem pokrytym serum we wstępnie przygotowanej płytce 12-dołkowej.
3. Zalać głowicę drukującą wstępnie podgrzanym kompletnym nośnikiem o pojemności 300 μl na kanał.
4. Wydrukuj zawieszone komórki w stężeniu 50 000 komórek/ml na powierzchni i 60 μl/min, 100 μl na kanał.
5. Umieść głowicę drukującą przytwierdzoną do powierzchni, a kolektor w inkubatorze do hodowli komórkowych ustaw na 5% CO₂ i 37 °C na 2 godziny.
6. Po 2-godzinnej inkubacji zdejmij głowicę drukującą i umieść pokrywkę na naczyniu hodowlanym. Czas, w którym głowica drukująca została usunięta, jest uważany za punkt czasowy 0 godzin.

4. Standardowa hodowla komórkowa

1. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do jednej z 12-dołkowych płytek TCTPS z plamkami surowicy, przygotowanych w kroku 2.
2. Pobrać 1 ml pozostałej zawiesiny komórek z etapu 2 i pipetować do pojedynczego dołka na 12-dołkowej płytce TCTPS. W ten sposób powstanie kultura zawierająca 50 000 komórek w naczyniu.
3. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2 godziny.
4. Po 2-godzinnej inkubacji rozpocznij odmierzanie czasu; dla spójności między próbkami drukowanymi a wysiewanymi uważa się ten punkt czasowy 0 godzin.

5. Wizualizacja kultury

1. Po 0, 2, 24 i 48 godzinach pobierz komórki z każdej z dwóch metod opisanych powyżej i zobrazuj za pomocą standardowego mikroskopu odwróconego.
   1. Wybarwić komórki za pomocą jodku propidyny, czerwonego barwnika fluorescencyjnego, który jest wprowadzany tylko do jądra martwych komórek.
      1. Delikatnie opłucz komórki 3 razy 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z wapniem i magnezem (PBS++), aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
      2. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanego PBS++ do każdego naczynia hodowlanego.
      3. Dodać 1 μl roztworu podstawowego jodku propidyny (1 mg/ml) do każdego naczynia hodowlanego.
      4. Inkubować komórki wybarwione jodkiem propidyny w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
   2. Zobrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu przy powiększeniu 10x i 40x.
2. Wyrzuć komórki do odpowiedniego pojemnika na zagrożenie biologiczne.

Results

Komórki linii komórkowej fibroblastów NIH/3T3 zostały wydrukowane lub umieszczone na zanurzonej powierzchni. Komórki hodowano do gęstości 5 X 10⁴ komórek na ml. Komórki wysiewano przy użyciu tradycyjnych technik hodowli komórkowych. Komórki wydrukowano przy użyciu wielkoformatowej, dwunastoprzepływowej głowicy drukującej komórkowej, w której kanały są większe (~500 μm) niż CFM używany do białek i innych biomolekuł. Komórki zostały wydrukowane lub wysiane na powierzchni pokrytej surowicą. Proces drukowania poka...

Discussion

Opisana tutaj technologia druku mikroprzepływowego 3D jest wyjątkowo zdolna do mikroprzepływowego drukowania tablic komórek w studni wypełnionej cieczą, tj. Zanurzonej powierzchni. Drukując na zanurzonych powierzchniach, można wytworzyć mikromacierze komórkowe, które utrzymują fizjologicznie istotny fenotyp komórkowy komórek, a także zdolność do multipleksowania komórek na dnie pojedynczej studzienki Rysunek 4. Wyniki tego badania pokazują, że mikroprzepływowe drukowanie komórek powoduje przyłąc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikroskop z ciągłym przepływem	Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 komórki	ATCC	CRL-1658
Dubbleco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092	Pożywka bazowa do komórek
Bufor HEPES	Invitrogen	15630-080	Dodatek do pożywek komórkowych (kontrola pH)
Pirogronian sodu	Invitrogen	11360-070	Dodatek do pożywek komórkowych
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen		Dodatek do pożywek komórkowych
Błękit trypanowy	Invitrogen	15250-061	Barwnik do liczenia
Hemocytometr	Fisher	267110	Komora komórkowa do zliczania komórek
Nikon Eclipse TS100	Nikon		Służy do sprawdzania komórek
Nikon Eclipse TE2000-U	Nikon		Służy do zbierania obrazów
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (z wapniem i magnezem)	Invitrogen	14040-133	Płukanie komórek przed pasażowaniem i przed barwieniem za pomocą PI
TrypLE Express	Invitrogen	A12177-01	Służy do usuwania komórek z powierzchni