Obrazowanie kolców dendrytycznych pierwotnych neuronów hipokampa szczura za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z neuronów hipokampa in vitro za pomocą Mikroskopii Iluminacji Strukturalnej (SIM). Mikroskopia superrozdzielcza wykorzystująca SIM zapewnia rozdzielczość obrazu znacznie wykraczającą poza granicę dyfrakcji światła we wszystkich trzech wymiarach przestrzennych, umożliwiając obrazowanie pojedynczych kolców dendrytycznych z większą szczegółowością.

Streszczenie

Kolce dendrytyczne są wypukłościami wyłaniającymi się z dendrytu neuronu i reprezentują główne postsynaptyczne cele bodźców pobudzających w mózgu. Postęp technologiczny pozwolił zidentyfikować te struktury jako kluczowe elementy łączności neuronów i plastyczności synaptycznej. Ilościowa analiza morfologii kręgosłupa przy użyciu mikroskopii świetlnej pozostaje istotnym problemem ze względu na ograniczenia techniczne związane z wewnętrzną granicą załamania światła. Kolce dendrytyczne można łatwo zidentyfikować za pomocą konfokalnej laserowej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak pomiar subtelnych zmian w kształcie i rozmiarze kolców jest trudny, ponieważ wymiary kręgosłupa inne niż długość są zwykle mniejsze niż konwencjonalna rozdzielczość optyczna ustalona przez teoretyczny limit rozdzielczości mikroskopii świetlnej wynoszący 200 nm.

Kilka ostatnio opracowanych technik super rozdzielczości zostało wykorzystanych do obrazowania struktur komórkowych mniejszych niż 200 nm, w tym kolców dendrytycznych. Techniki te opierają się na klasycznych operacjach w dalekim terenie, a zatem pozwalają na wykorzystanie istniejących metod przygotowania próbki i obrazowanie poza powierzchnią próbki. Opisano tutaj działający protokół zastosowania mikroskopii oświetlenia strukturalnego o wysokiej rozdzielczości (SIM) do obrazowania kolców dendrytycznych w pierwotnych kulturach neuronów hipokampa. Możliwe zastosowania SIM pokrywają się z zastosowaniami mikroskopii konfokalnej. Jednak te dwie techniki mają różne zastosowania. SIM oferuje wyższą efektywną rozdzielczość boczną, podczas gdy mikroskopia konfokalna, dzięki zastosowaniu fizycznego otworu otworkowego, osiąga poprawę rozdzielczości kosztem usunięcia nieostrego światła. W tym protokole neurony pierwotne są hodowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych przy użyciu standardowego protokołu, transfekowane plazmidami DNA kodującymi białka fluorescencyjne i obrazowane za pomocą SIM. Cały opisany tu protokół trwa około 2 tygodni, ponieważ kolce dendrytyczne obrazuje się po 16-17 dniach in vitro, kiedy rozwój dendrytyczny jest optymalny. Po zakończeniu działania protokołu, kolce dendrytyczne mogą być rekonstruowane w 3D z serii stosów obrazów SIM za pomocą specjalistycznego oprogramowania.

Wprowadzenie

Kolce dendrytyczne to małe wybrzuszenie błony neuronalnej. Ta charakterystyczna struktura jest wyspecjalizowana w odbieraniu danych wejściowych z pojedynczej synapsy i reprezentuje obszar kontaktu fizycznego między dwoma neuronami. Najbardziej funkcjonalnie dojrzałe kolce dendrytyczne składają się z kulistej końcówki, zwanej głową, i cienkiej szyjki, która łączy głowę z trzonem dendrytycznym. Jednak kolce nie są statyczne i aktywnie się poruszają i zmieniają swoją morfologię w sposób ciągły, nawet w dorosłym mózgu ². W ciągu 2 tygodni pierwotne hodowle neuronów hipokampa szczurów pochodzące z późnego okresu embrionalnego lub wczesnego okresu pourodzeniowego rozwijają złożone altany dendrytyczne z licznymi wypukłościami błony, które ewoluują od wczesnych filipodiów do struktur przypominających kręgosłup ³. Na podstawie tego dynamicznego zachowania i innych cech uważa się, że kolce dendrytyczne stanowią anatomiczny substrat do przechowywania pamięci i transmisji synaptycznej ^4,5.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę, jaką rozmiar i kształt kolców dendrytycznych odgrywają w funkcji synaptycznej, ważne jest, aby dokładnie zmierzyć ich wymiary. Kolce mają długość od około 200 do 2000 nanometrów i można je łatwo zidentyfikować za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii fluorescencyjnej. Jednak wymiary kręgosłupa inne niż długość są zwykle niższe od rozdzielczości konwencjonalnych układów optycznych, teoretycznie ustalanej przez dyfrakcję około 200 nanometrów ⁶. Te zdolności rozdzielcze są niewystarczające do obrazowania drobniejszych szczegółów, takich jak szerokość kręgosłupa, szyi i głowy. Poświęcono wiele pracy w celu rozwiązania tego problemu, a wiele stosunkowo nowych technik mikroskopii superrozdzielczej zapewniło znaczny postęp. W szczególności możliwe jest osiągnięcie rozdzielczości wykraczającej poza klasyczną granicę bez odrzucenia światła emisyjnego dzięki zastosowaniu mikroskopii oświetlenia o strukturze bocznej (SIM) w szerokokątnym, niekonfokalnym mikroskopie ^7-10. Stosując tę technikę w połączeniu z technikami mikroskopii nieliniowej, teoretycznie możliwe jest poprawienie rozdzielczości bocznej mikroskopu optycznego o nieograniczony współczynnik ¹¹. Jednak w większości przypadków eksperymentalnych SIM pozwala na dwukrotne przekroczenie limitu rozdzielczości. Inne techniki mikroskopii optycznej o wysokiej rozdzielczości, takie jak mikroskopia wymuszonego zubożenia emisji (STED) ¹² i mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji (PALM) ¹², zostały zastosowane do obrazowania kolców dendrytycznych. Metody oparte na lokalizacji, takie jak PALM, wymagają bardzo dużej liczby obrazów RAW w celu uzyskania superrozdzielczości i dlatego mają ograniczoną prędkość. Z drugiej strony, STED może osiągać wysoką prędkość obrazowania, choć przy stosunkowo niskiej liczbie fotonów i małych polach widzenia, co może nie mieć miejsca w przypadku SIM ¹³.

W tym artykule celem jest dostarczenie działającego protokołu do obrazowania kolców dendrytycznych z pierwotnych neuronów hipokampa szczurów hodowanych in vitro za pomocą SIM. Protokół składa się z dwóch wyróżniających się faz: początkowej polegającej na ustanowieniu, rozwoju, transfekcji i immunohistochemii pierwotnych kultur neuronów hipokampa szczurów oraz fazy późnej poświęconej obrazowaniu próbek.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne z udziałem zwierząt zostały zoptymalizowane w celu zmniejszenia cierpienia zwierząt i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Eksperymentów na Zwierzętach, Uniwersytet w Amsterdamie, protokół DEC # DED204 i DED250.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

1. Przytnij szkiełka nakrywkowe do rozmiaru 15 mm x 15 mm za pomocą rysika z węglika spiekanego lub diamentu, tak aby pasowały do dołków płytki 12-dołkowej.
2. Podczas pracy pod wyciągiem należy rozpocząć powlekanie szkiełek nakrywkowych od całkowitego zanurzenia szkiełek nakrywkowych w stężonym roztworze kwasu azotowego (70% wag./wag.) w szklanym pojemniku. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie, wstrząśnij, a następnie inkubuj przez co najmniej 4 godziny. Możliwe jest ponowne użycie stężonego roztworu kwasu azotowego około 2 razy, ale może on stracić kolor pod wpływem światła.
3. Usunąć stężony roztwór kwasu azotowego i umyć szkiełka nakrywkowe cztery razy w wodzie destylowanej przez 30 minut, ostrożnie wstrząsając po każdym myciu.
4. Ostrożnie usuń wodę.
   Uwaga: kolejne trzy kroki wykonuje się w sterylnej komorze z przepływem laminarnym.
5. Namocz szkiełka nakrywkowe w 96% EtOH. Usunąć szkiełka nakrywkowe z roztworu EtOH i pozostawić do wyschnięcia.
6. Zapal szkiełka nakrywkowe i włóż je do szklanego pojemnika. Do obsługi szkiełek nakrywkowych używaj cienkich kleszczyków (na przykład kleszczyków Dumont nr 5).
7. Przykryj pojemnik folią aluminiową i piecz w piekarniku przez 12-16 godzin w temperaturze 180 °C. Upieczone szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 miesiąca, jeśli są szczelnie przykryte.

2. Powłoka szkiełka nakrywkowego

Procedura powlekania szkiełkiem nakrywkowym sprzyja przyczepianiu neuronów do powierzchni szkła i arboryzacji dendrytycznej ¹⁴.

1. W sterylnym kapturze laminarnym użyj sterylnych małych kleszczyków, aby umieścić poszczególne szkiełka nakrywkowe w pojedynczych dołkach 12-dołkowej płytki.
2. Dodać 500 μl roztworu poli-L-lizyny (lub ilość wystarczającą do zanurzenia szkiełek nakrywkowych).
3. Zawiń talerz w folię aluminiową, aby zapobiec parowaniu i pozostaw go na noc w temperaturze pokojowej.
4. Przed rozpoczęciem hodowli należy ostrożnie odessać roztwór poli-L-lizyny w sterylnym kapturze laminarnym.
5. Umyj każdą studzienkę dwukrotnie 1 ml sterylnej wody, zapobiegając ich wyschnięciu.
6. Całkowicie odessać wodę, dodać 1 ml podłoża galwanicznego i pozostawić szkiełka nakrywkowe w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż będą gotowe do płytki komórek. Zaleca się pokrycie komórek w ciągu 24 godzin.

3. Usuwanie mózgów z zarodków szczurów E16-E19

1. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne, podgrzewając je przez noc w suchym sterylizatorze lub myjąc je 70% EtOH. Dokładnie wysuszyć, jeśli używany jest EtOH.
2. Przygotuj kilka naczyń o średnicy 30 mm z 1x buforem HBSS i trzymaj je na lodzie.
3. Poddać matkę eutanazji za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia Euthasolu (160 mg/kg Euthasol w objętości ± 0,4 ml).
4. Sprawdź, czy nie ma odruchów.
5. Spryskaj brzuch zapory 70% EtOH.
6. Wykonaj nacięcie wzdłuż brzucha i usuń macicę.
7. Usuń zarodki z macicy i umieść je na szalce Petriego o średnicy 100 mm.
8. Usuń głowy zarodków dużymi nożyczkami i umieść je na nowej szalce Petriego zawierającej zimny bufor HBSS.
   Uwaga: od tego momentu do kroku 7.1 procedura jest wykonywana w sterylnych warunkach w komorze laminarnej.
9. Przytrzymaj głowy wzdłuż boków dużymi kleszczami.
10. Małymi nożyczkami wykonaj strzałkowe nacięcie w skórze na czubku głowy, a następnie bocznie oderwij skórę dużymi kleszczami.
11. Użyj tego samego podejścia, co w kroku 3.10, aby usunąć czaszkę. Wykonaj cięcie strzałkowe, zaczynając od końca ogonowego; delikatnie otwierając czaszkę bez uszkadzania tkanki mózgowej. Odchyl dwie połówki czaszki na boki, odsłaniając mózg.
12. Za pomocą szpatułki wyjmij mózg i umieść go w świeżym, zimnym 1x HBSS.

4. Sekcja hipokampa

Bardzo ważne jest, aby sekcja była przeprowadzana jak najszybciej w sterylnych warunkach, aby zapewnić żywotność komórek. Próbki należy przechowywać w niskiej temperaturze na lodzie.

1. Usuń i wyrzuć móżdżek cienkimi nożyczkami.
2. Oddziel dwie półkule mózgu, wykonując strzałkowe cięcie wzdłuż linii środkowej.
3. Weź każdą półkulę i umieść obie w nowym naczyniu o średnicy 30 mm zawierającym świeże zimne 1x HBSS.
4. Umieść każdą półkulę tak, aby płat skroniowy był skierowany w stronę dna naczynia.
   UWAGA: Od tego momentu zaleca się korzystanie z mikroskopu preparacyjnego.
5. Delikatnie przytrzymaj śródmózgowie za pomocą małych kleszczy i usuń śródmózgowie inną parą kleszczy. Pozostaw pozostałą część półkuli nienaruszoną, zawierającą korę i hipokamp.
6. Odwróć tkankę tak, aby hipokamp był teraz skierowany w stronę dna naczynia.
7. Delikatnie przytrzymaj półkulę na miejscu za pomocą cienkich kleszczyków. Używając kolejnych cienkich kleszczy, ostrożnie i delikatnie usuń opony mózgowe. Łatwiej jest zacząć od opuszki węchowej. Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić hipokampa.
8. Ustaw tkankę tak, aby hipokamp był teraz skierowany do góry. Hipokamp można teraz zobaczyć dzięki charakterystycznej strukturze w kształcie litery C.
9. Za pomocą cienkich kleszczy wypreparuj hipokamp. Zbierz go do nowego naczynia o średnicy 30 mm zawierającego świeże zimne 1x HBSS.

5. Dysocjacja komórek i powlekanie

1. Policz całkowitą liczbę hipokampów, a następnie pokrój je na małe kawałki.
2. Zebrać kawałki w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml 1x HBSS.
3. Wirować przy 300 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant.
4. Dodaj 6 μl trypsyny na hipokamp.
5. Inkubować maksymalnie 20 minut w temperaturze 37 °C. Mieszać po 3 minutach.
6. Przemyć dwa razy 5 ml świeżego zimnego 1x HBSS i wyrzucić supernatant.
7. Po drugim przemyciu dodać 1,5 ml podłoża galwanicznego podgrzanego do temperatury 37 °C. Surowica w pożywce galwanicznej dezaktywuje aktywność trypsyny.
8. Powoli rozcieraj 30x za pomocą wypolerowanej na ogniowo pipety Pasteura, aż wszystkie kawałki tkanki zostaną jednorodnie rozproszone w pojedyncze komórki. Unikaj bulgotania.
9. Dodać 5 ml podłoża galwanicznego podgrzanego do temperatury 37 °C.
10. Policz komórki za pomocą barwienia życiowego błękitem trypanowym.
11. Wysiewać 50 000 komórek z 12-dołkowej płytki na basenie w 1 ml pożywki galwanicznej, przygotowanej w sekcji 2 (całkowita objętość 2 ml).
12. Delikatnie kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki.
13. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Po 2-3 dniach zastąp połowę pożywki galwanicznej (0,5 ml) pożywką zawierającą 10 μM FUDR.
    Uwaga: Obrazowanie dendrytyczne kręgosłupa wykonuje się 16-17 dni po posiewie (16-17 dni in vitro, DIV).

6. Transfekcja pierwotnego neuronu hipokampa szczura za pomocą lipofekcaminy

Na DIV 14-15 neurony są transfekowane za pomocą następującego protokołu:

1. Przygotować plazmidowe DNA z ekspresją GFP i pożywkę inkubacyjną (10 ml pożywki Neurobasel ze 100 μl glutamaxu).
2. Podgrzać pożywkę inkubacyjną do temperatury 37 °C.
3. Przygotuj mieszankę DNA (probówka A). Do każdego szkiełka nakrywkowego dodać 1 μg DNA w 100 μl zwykłego podłoża Neurobase. Delikatnie wymieszaj.
4. Przygotować mieszaninę lipofeektaminy (probówka B). Do każdego szkiełka nakrywkowego dodać 2 μl lipofektaminy w 100 μl zwykłego podłoża Neurobasel. Delikatnie wymieszaj.
5. Dodawać mieszaninę lipopektaminy do mieszanki DNA kroplami.
6. Inkubować w okapie z przepływem laminarnym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Dodać 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki inkubacyjnej na płytkę 1.
8. Przechowywać płytkę 2 przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
9. Delikatnie dodać kroplami 200 μl mieszaniny DNA/lipofekcaminy do każdej studzienki i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
10. Za pomocą małych kleszczy podnieś szkiełka nakrywkowe zawierające neurony i przepłucz je, zanurzając je w 3 cm naczyniu zawierającym świeże, ciepłe podłoże Neurobasel i przenieś je na płytkę 2.
11. Inkubować transfekowane neurony w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 48 godzin.
12. Sprawdź skuteczność transfekcji 24 godziny po transfekcji.

7. Barwienie immunologiczne i montowanie pierwotnych neuronów hipokampa szczura

Aby poprawić intensywność fluorescencji w transfekowanych komórkach, wykonaj protokół barwienia immunologicznego w celu zwiększenia wykrywania GFP 48 godzin po transfekcji.

1. Przygotować 4% PFA i 0,05 M TBS.
2. Podgrzać 4% roztwór PFA do temperatury 37 °C.
3. Delikatnie zassać pożywkę z dołków zawierających szkiełka nakrywkowe.
4. Ostrożnie dodaj 500 μl ciepłego 4% PFA, aby zapobiec uszkodzeniu dendrytów.
5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
6. Umyć 1x HBSS 3 razy przez 5 min.
   UWAGA: w tym momencie próbki mogą być przechowywane do 3 tygodni w temperaturze 4 °C lub natychmiast można rozpocząć barwienie immunologiczne.
7. Jeśli próbki były przechowywane, przemyć je 0,05 M TBS 3 razy przez 5 minut.
8. Blokować roztworem TBS-BSA (1%) w temperaturze pokojowej przez 30 min.
9. Umyć 0,05 M TBS 3 razy przez 5 min.
10. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało rozcieńczone w mieszance inkubacyjnej.
11. Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
12. Następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
13. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe.
14. Myć 0,05 M TBS 3x przez 5 min.
    UWAGA: od tego momentu szkiełka nakrywkowe należy chronić przed światłem.
15. Dodać drugorzędowe przeciwciało sprzężone fluorescencyjnie rozcieńczone w mieszaninie inkubacyjnej.
16. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
17. Usuń przeciwciało drugorzędowe.
18. Umyć 0,05 M TBS 3 razy przez 5 min.
19. Umyć 1X TB 2 razy przez 5 min.
20. Użyj cienkiej pęsety, aby usunąć szkiełka nakrywkowe z dołków.
21. Osusz nadmiar gruźlicy chusteczką i zamocuj szkiełka nakrywkowe za pomocą podłoża mocującego.
22. Uszczelnij lakierem do paznokci, aby zapobiec parowaniu medium montażowego.

8. Obrazowanie kręgosłupa dendrytycznego za pomocą mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Dendrytyczne obrazowanie kręgosłupa za pomocą systemu SIM opisanego w materiałach ma rozdzielczość boczną (XY) około 85-110 nm i rozdzielczość osiową (Z) między 200 - 250 nm, co zapewnia współczynnik 2-krotnej poprawy rozdzielczości w porównaniu do mikroskopii szerokokątnej.

UWAGA: Obrazowanie dendrytycznego kręgosłupa za pomocą karty SIM jest zwykle wykonywane 2 dni po kroku 7.22, ale może być wykonane do 3 tygodni później, jeśli próbki są przechowywane w ciemności i w kontrolowanej temperaturze 22 - 23 °C.

1. Włącz laser 488 nm, lampę rtęciową, stage kontroler, kontroler piezoelektryczny, lampę halogenową do światła przechodzącego i komputer i uruchom oprogramowanie SIM w trybie "ANDOR dla N-SIM".
2. Wyczyść obiektyw 100x TIRF trzykrotnie 95% etanolem i, jeśli to konieczne, eterem naftowym.
3. Użyj następujących ustawień filtra: 520 LP z dichroikiem 488.
4. Nałóż kroplę olejku immersyjnego na obiektyw. Sprawdź, czy w kropli oleju nie ma pęcherzyków powietrza. Przesuń obiektyw w górę, aż olej dotknie próbki.
   Uwaga: Umieść osłonę nad stolikiem, aby chronić próbkę przed światłem otoczenia i przyciemnij światła w pomieszczeniu tak bardzo, jak to możliwe.
5. Ustaw kołnierz korekcyjny obiektywu na 37 °C, 200 μm, aby uzyskać najlepszą symetrię PSF. Aby ustawić prawidłową pozycję kołnierza, najpierw ustaw pierścień obiektywu w optymalnej pozycji nominalnej, a następnie sprawdź próbkę koralików o długości 100 nm. Zgodnie z najlepszą symetrią PSF, nieznacznie zmień położenie kołnierza wokół nominalnego.
6. Do oświetlenia użyj siatki 3D-SIM (3D 1layer 100X/1.49 wszystkie długości fal). Aby rozpocząć wyrównywanie siatki, umieść wybrany blok siatki w iluminatorze SIM z założonym obiektywem 100X 1.49. Użyj próbki kulki 100 nm zamontowanej w podłożu, o stężeniu pozwalającym na wyizolowanie 10-15 kulek w celu uzyskania pola widzenia (FOV). Po ustawieniu kołnierza korekcyjnego obiektywu w żądanej pozycji wybierz podświetlenie 3D-SIM i rozpocznij procedurę ustawiania pod kierunkiem oprogramowania. Uruchomi (5 faz) x (1 kierunek) x (100 płaszczyzn z), z których zrekonstruuje FOV za pomocą koralików. Po wybraniu pojedynczego ściegu za pomocą odpowiedniego ROI, obejmującego cały koralik, w tym nieostre rozmyte światło, oprogramowanie rozpocznie automatyczne dopasowanie PSF i dostosuje pozycję siatki zgodnie z wynikiem.
7. Aby sprawdzić działanie mikroskopu, należy powtarzać wyrównanie siatki co 2 tygodnie, ze względu na możliwą niewspółosiowość spowodowaną ruchami stołu i/lub dryftem temperatury. Ponadto sprawdź również intensywność i stabilność lasera zgodnie z sugestiami producenta.
8. Trzykrotnie oczyść powierzchnię próbki 95% etanolem.
   Uwaga: Aby zapoznać się z kolejnymi krokami, patrz rysunek 3, aby zapoznać się z ponadview paneli sterowania i prawidłowych ustawień w oprogramowaniu SIM.
9. W oprogramowaniu SIM wybierz Optical Configuration Eye FITC i wybierz pusty blok filtra w Turret 1 do kontroli wizualnej przy białym świetle.
10. Ustaw prędkość ustawiania ostrości i prędkość przesuwu stołu XY na "Fine".
11. Otwórz migawkę i szybko ustaw ostrość na próbce.
12. Ponownie zamknij migawkę i ustaw współrzędną Z na zero.
13. Wybierz zielony filtr w wieżyczce 1 do kontroli wizualnej za pomocą zielonego kanału.
14. Ustaw intensywność lampy rtęciowej na najniższe ustawienie.
15. Ostrożnie podejdź do granicy próbki, upewniając się, że obiektyw nie dotyka szczeliwa.
16. Otwórz migawkę i szybko przeskanuj próbkę z najniższą możliwą intensywnością.
17. Po napotkaniu wystarczająco jasnego dendrytu zainteresowania i wyśrodkowaniu interesującego segmentu w polu widzenia, zamknij migawkę.
18. Ustaw oprogramowanie na konfigurację optyczną 3D-SIM 488, a ustawienia kamery na tryb odczytu EM, wzmocnienie 1 MHz 16-bit, czas naświetlania 100 ms, moc lasera 5% i wzmocnienie EM 200,
    UWAGA: Sprawdź, czy zielony filtr w Wieżyczce 2 jest zaznaczony i czy Wieżyczka 1 jest pusta.
19. Sprawdź, czy siatka jest ustawiona na "Ruchomy" i kliknij przycisk Na żywo, aby wyświetlić próbkę w świetle lasera i przez kamerę.
20. Uaktywnienie tabeli przeglądowej.
21. W razie potrzeby wyśrodkuj obiekt zainteresowania i ustaw ostrość z szybkością ustawioną na Extra Fine.
    UWAGA: w trybie odczytu EM gain 1 MHz 16-bit docelowa intensywność dla dobrego obrazu SIM wynosi od 30 000 do 45 000.
22. Szybko dostosuj ustawienia kamery, aby uzyskać wartość intensywności w zakresie 30 000-45 000 w trybie odczytu, wzmocnienie EM, 1 MHz, 16-bitowe. Początkowo użycie:
    1. Moc lasera: 0% - 20% (przy próbkach przygotowanych zgodnie z powyższym opisem wystarczy 5% lub 2,6 mW)
    2. Czas ekspozycji: 50 ms-2 s
    3. Tryb odczytu: wzmocnienie EM 1 MHz 16-bit
    4. Wzmocnienie EM: 0-300
    5. Zysk konwersji: 1x - 5.1x
    6. Format dla transmisji na żywo: Bez kategoryzacji
    7. Format przechwytywania: Bez binningu
       UWAGA: przy tych ustawieniach rutynowo osiąga się wybielenie 6,3% ± 1,3%, mieszcząc się w granicach 10% dopuszczalnego maksymalnego wybielania, co może znacząco wpłynąć na jakość obrazu ¹⁵.
23. Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby wyłączyć podgląd na żywo.
24. Skonfiguruj ustawienia stosu 3D Z w panelu Sekwencja ND, aby:
    1. Zakres: 2 μm
    2. Wielkość zestawu: 120 nm
    3. Płaszczyzna Z
    4. Kliknij pozycję początkową
    5. Wybierz konfigurację optyczną 3D-SIM 488 w sekcji Lambda
25. Wybierz 3D-SIM jako tryb akwizycji w padzie N-SIM.
26. Uruchom akwizycję ND Sequence i zapisz nieprzetworzone dane.
27. Ponownie wybierz Optical Configuration Eye FITC i powtarzaj kroki 8.15-8.27, aż cała próbka zostanie zobrazowana
28. Rekonstrukcja obrazu 3D: Dane uzyskane w kroku 8.23 można zrekonstruować od razu lub później. Zacznij od zrekonstruowania stosu Z z domyślnymi ustawieniami rekonstrukcji w trybie Reconstruct Slice lub Reconstruct Stack i dostosuj w razie potrzeby.
    UWAGA: aby uzyskać najlepsze wyniki, stosy Z powinny być wykonane ze wskazanym rozmiarem kroku i zrekonstruowane w trybie Reconstruct Stack. Zawsze sprawdzaj poprawność zrekonstruowanego obrazu, porównując go z surowymi danymi lub, najlepiej, z obrazem szerokokątnym. Parametry, które można dostosować do procesu rekonstrukcji, to kontrast i tłumienie szumów o wysokiej częstotliwości. Oba te czynniki wpływają na to, w jaki sposób różne właściwości surowego obrazu są brane pod uwagę podczas procesu rekonstrukcji. W przypadku surowych danych o małej głębokości modulacji parametr kontrastu odgrywa ważną rolę. Jeśli użytkownik posiada zestawy danych o niskim stosunku sygnału do szumu, parametr tłumienia szumów o wysokiej częstotliwości może mieć poważny wpływ na jakość rekonstrukcji.
29. Po zakończeniu obrazowania wyśrodkuj stolik XY i przesuń obiektyw całkowicie w dół do pozycji spoczynkowej.
30. Odmontuj próbkę i wyczyść zarówno próbkę, jak i obiektyw 95% etanolem.
31. Wyłącz oprogramowanie i komputer oraz wyłącz wszystkie inne urządzenia.
32. Rekonstrukcję 3D i klasyfikację grzbietu pozyskanych obrazów można przeprowadzić po konwersji plików do formatu TIFF zgodnie z opisem przed użyciem oprogramowania NeuronStudio (patrz Rysunek 4) ¹⁶.
33. Do rekonstrukcji w oprogramowaniu NeuronStudios należy użyć następujących parametrów:
    1. Objętość: Wymiary woksela: X: 0,03 μm; Y: 0,03 μm; Z: 0,120 μm.
    2. Wykrywanie dendrytów: Współczynnik dołączenia: 1,3; Minimalna długość: 5 μm; Współczynnik dyskretyzacji: 1; Wyrównaj skrzyżowania: Tak.
    3. Wykrywanie kręgosłupa: Minimalna wysokość: 0,2 μm; Maksymalna wysokość: 5.001 μm; Maksymalna szerokość: 3 μm; Minimalny rozmiar przysadzistości: 10 wokseli; Minimalny nieprzysadzisty rozmiar: 5 wokseli.
    4. Klasyfikator kręgosłupa: Stosunek szyi (stosunek głowy do szyi): 1,1; Cienki stosunek: 2,5; Wielkość grzyba: 0,35 μm;
34. Parametry NeuronStudio używane do renderingu: kształt wierzchołka neurytu: zaćmienie bryły; Kolor wierzchołka neurytu: według typu; Kształt krawędzi neurytowej: linia; Kolor krawędzi neurytowej: jednokolorowy; Kształt kręgosłupa: solidne zaćmienie; Kolor grzbietu: według typu.
    Uwaga: Po rekonstrukcji 3D możliwe jest również ustawienie renderowania objętościowego. Domyślny próg został ustawiony na 20 z aktywną opcją "Regeneruj renderowanie woluminu". Krycie zostało ustawione za pomocą opcji "Automatyczna intensywność". Aktywne były również opcje "Tylko powierzchnia" i "Użyj wstępnego renderowania punktów"

Wyniki

Opisany tutaj jest ustandaryzowany protokół pracy do obrazowania kolców dendrytycznych z pierwotnych neuronów hipokampa szczura in vitro za pomocą SIM. Przebieg pracy protokołu i jego kluczowe kroki przedstawiono na rysunku 1. Ogólnie rzecz biorąc, protokół wymaga około 2 tygodni prac eksperymentalnych oddzielonych w pierwszej fazie przygotowania próbki, w tym hodowli, rozwoju i transfekcji pierwotnych neuronów hipokampa szczura i immunohistochemii oraz drugiej fazie obrazowania próbki przy użyc...

Dyskusja

W artykule opisano działający protokół obrazowania kolców dendrytycznych z pierwotnych neuronów hipokampa szczurów hodowanych in vitro przy użyciu karty SIM. Pierwotna metoda hodowli neuronów hipokampa jest adaptacją oryginalnej metody opisanej przez Kaecha i Bankera ¹⁸. Główne różnice to użycie pożywki hodowlanej Neurobasal/B27, która eliminuje wymóg hodowli astrogleju, oraz dodanie inhibitora mitotycznego FUDR w dniu 3, który wspomaga przeżycie neuronów przy jednoczesnym hamowaniu proliferacji gleju...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze
drobne Duże kleszcze
Cienkie nożyczki
Duże nożyczki
szpatułka Mikroskop
preparacyjny z oświetleniem Mikroskop
37 & Stopniach; C Kąpiel
			hodowli komórkowych z przepływem laminarnym
Wysokotemperaturowy suchy piec
Palnik
Inkubator do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 & deg; C)
Wytrząsarka
			do mikrowirówek
[nagłówek]
Konfiguracja mikroskopu oświetlenia strukturalnego firmy Nikon składająca się z:
Odwrócony mikroskop badawczy Nikon Eclipse Ti z systemem
Nikon CFI Apo TIRF 100x soczewka obiektywu olejowego (nie dotyczy. 1.49)
4 koherentne lasery szafirowe (długość fali wyjściowej 458, 488, 514 i 561 nm)
Oświetlacz
Kontroler stolika Nikon Kontroler
			MCL Nano-Drive
Lampa rtęciowa Nikon Intensilight C-HGFIE Mikroskop
SIM Regulacja
Kamera iXon DU897 iXon DU897
systemem Microsoft Windows 7 Home Edition Nikon
' s Pakiet
Olejek