Artykuł metodologiczny

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

44.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51278

⸱

28 czerwca 2014

 ,  ,  ,  , 
1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

W tym artykule

Podsumowanie

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Streszczenie

Bariera krew-mózg (BBB) specyficznie reguluje przepływ molekularny i komórkowy między krwią a tkanką nerwową. Naszym celem było opracowanie i scharakteryzowanie wysoce powtarzalnego syngenicznego modelu in vitro wirusa BBB u szczurów przy użyciu kohodowli pierwotnych komórek śródbłonka mózgu szczura (RBEC) i astrocytów w celu zbadania receptorów zaangażowanych w transcytozę w monowarstwie komórek śródbłonka. Astrocyty wyizolowano przez mechaniczną sekcję po trawieniu trypsyny i zamrożono w celu późniejszej wspólnej hodowli. RBEC wyizolowano z 5-tygodniowej kory mózgowej szczura. Mózgi zostały oczyszczone z opon mózgowych i istoty białej, a następnie mechanicznie zdysocjowane po trawieniu enzymatycznym. Następnie homogenat tkankowy odwirowano w albuminie surowicy bydlęcej w celu oddzielenia fragmentów naczyń krwionośnych od tkanki nerwowej. Fragmenty naczyń zostały poddane drugiemu trawieniu enzymatycznemu w celu uwolnienia komórek śródbłonka z ich macierzy zewnątrzkomórkowej. Pozostałe zanieczyszczające komórki, takie jak perycyty, zostały dodatkowo wyeliminowane przez posiew fragmentów mikronaczyń w pożywce zawierającej puromycynę. Następnie przeniesiono je do filtrów w celu wspólnej hodowli z astrocytami wyhodowanymi na dnie studzienek. RBEC wykazywał ekspresję wysokich poziomów białek ścisłego połączenia (TJ), takich jak okludyna, klaudyna-5 i ZO-1 z typową lokalizacją na granicach komórek. Transśródbłonkowy opór elektryczny (TEER) monowarstw śródbłonka mózgu, wskazujący na szczelność TJ, osiągnął średnio 300 omów·cm2. Współczynniki przepuszczalności śródbłonka (Pe) dla żółcienia lucyfera (LY) były wysoce powtarzalne ze średnią 0,26 ± 0,11 x 10-3 cm/min. Komórki śródbłonka mózgu zorganizowane w monowarstwy wykazywały ekspresję transportera wypływu P-glikoproteiny (P-gp), wykazywały spolaryzowany transport rodaminy 123, liganda dla P-gp, i wykazywały specyficzny transport transferyny-Cy3 i DiILDL przez monowarstwę komórek śródbłonka. Podsumowując, przedstawiamy protokół tworzenia modelu BBB in vitro, który jest wysoce powtarzalny ze względu na metody zapewnienia jakości i który jest odpowiedni do badań nad transporterami i receptorami BBB.

Wprowadzenie

Wiele leków opracowanych do leczenia zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego (OUN) nie jest w stanie dotrzeć do miąższu mózgu w stężeniach istotnych terapeutycznie. Bariera krew-mózg chroni tkankę nerwową mózgu przed wahaniami składu osocza, przed czynnikami chorobotwórczymi i utrzymuje homeostazę miąższu mózgu poprzez ograniczenie niespecyficznego przepływu jonów, peptydów, białek, a nawet komórek do i z mózgu1.

Cechy BBB są indukowane i utrzymywane przez bliskość i wzajemne przenikanie się komórek śródbłonka mikronaczyń mózgowych klasy wyspecjalizowanej a sąsiednimi elementami jednostki nerwowo-glejowo-naczyniowej (NGVU), takimi jak neurony, komórki glejowe (dokładniej astrocyty na końcach) i perycyty otoczone błoną podstawną, która składa się głównie z kolagenu typu IV, fibronektyny, lamininy i proteoglikanów2,3. Perycyty pokrywają około 22 - 32% śródbłonka na poziomie naczyń włosowatych i odgrywają ważną rolę w regulacji proliferacji śródbłonka, angiogenezy i procesów zapalnych. Komórki śródbłonka tworzą ciągły arkusz pokrywający wewnętrzną powierzchnię naczyń włosowatych. Są one połączone przez TJ, które tworzą strukturę przypominającą pas w okolicy wierzchołkowej i przyczyniają się do polaryzacji komórek. Astrocyty regulują właściwości BBB i są źródłem ważnych czynników regulacyjnych, takich jak TGF-β, GDNF, bFGF i IL-6. Astrocyty z niedoborem GFAP o niepełnej funkcjonalności nie są w stanie regulować właściwości BBB4. Neurony nie są bezpośrednio zaangażowane strukturalnie w tworzenie bariery krew-mózg, ale także regulują ważne aspekty ekspresji białek i funkcji bariery krew-mózg5.

W celu dalszego badania struktury, fizjologii i patologii BBB, opracowano modele in vitro BBB jako narzędzia badawcze. Komórki śródbłonka mózgu zostały wyekstrahowane od różnych gatunków w celu wdrożenia modeli BBB in vitro opartych na kulturach pierwotnych o niskim pasażowaniu od bydła6,7, świni8,9, szczura10,11,12, myszy13, a także człowieka14,15. Wiadomo, że modele te naśladują BBB in vivo, szczególnie gdy są hodowane wspólnie z komórkami glejowymi szczurów lub myszy i / lub perycytów16,12 i / lub astrocytów pochodzących z nerwowych komórek progenitorowych17 i / lub neuronów18. Modele "in lab" są często produkowane z gryzoni, ponieważ umożliwiają eksperymenty i porównania in vitro / in vivo i/lub badanie komórek śródbłonka mózgu wytworzonych z modeli transgenicznych19.

Nowo opracowane modele BBB in vitro zostały również zaprojektowane, aby pomóc przewidzieć pobieranie przez mózg potencjalnych kandydatów na leki na OUN przed testami in vivo 15,20,21,3,6,22,11,23. Metody in vitro Modele bariery krew-mózg są zwykle używane do porównywania transportu leków z: i) znaną penetracją do OUN lub z niską przepuszczalnością przez barierę krew-mózg i brakiem efektów centralnych, oraz ii) pozornym Pe tych samych leków mierzonym w modelach zwierzęcych tego samego gatunku. Leki, które łatwo przenikają przez barierę krew-mózg, są w większości lipofilowe i przenikają przez błony komórkowe śródbłonka mózgu poprzez swobodną dyfuzję za pośrednictwem lipidów (kofeina, karbamazepina itp.). Ujemnie transportowane leki, takie jak digoksyna, werapamil lub cyklosporyna A, są aktywnie wytłaczane przez transportery wypływu śródbłonka mózgu, takie jak P-gp. Jednak wiele z nowo opracowanych cząsteczek terapeutycznych to biofarmaceutyki, takie jak białka rekombinowane, siRNA lub przeciwciała monoklonalne. Większość z nich nie przekracza bariery krew-mózg z powodu: i) braku specyficznych transporterów oraz ii) ciasno upakowanej warstwy komórek śródbłonka, które uniemożliwiają cząsteczkom o dużej masie cząsteczkowej przejście przez komórkę parakomórkową. Mając te ograniczenia, strategie "konia trojańskiego" zostały wdrożone przy użyciu wektorów (przeciwciał, peptydów) przeciwko znanym receptorom w BBB, zaangażowanym w transport lub transcytozę za pośrednictwem receptora (RMT), takim jak receptor transferyny (Tf) (TfR), receptor insuliny (IR) lub członkowie rodziny receptorów związanych z receptorem LDL (LDLR), LRP1). Takie receptory znaleziono na izolowanych naczyniach włosowatych mózgu oraz w BBB in vivo24,25. Profile transkrypcyjne dla tych receptorów, w szczególności tych z rodziny LDLR, przeanalizowano i porównano między komórkami śródbłonka mózgu a komórkami śródbłonka mózgu hodowanymi wspólnie z astrocytami lub w naczyniach włosowatych mózgu bezpośrednio po ich ekstrakcji z mózgu26. Pardridge24 otworzył pole z przeciwciałem OX-26 przeciwko receptorowi transferyny (TfR), a następnie przeciwciałami przeciwko receptorowi insuliny i receptorowi insulinowego czynnika wzrostu27,28. Dzięki tym wektorom opartym na przeciwciałach, firma ArmaGen Technologies opracowała technologię molekularnej platformy konia trojańskiego BBB do dostarczania leków, w tym białek, przez BBB29. Literatura jest bogata w dane pokazujące ekspresję LRP1 w komórkach śródbłonka mózgu i jego rolę jako silnego receptora endocytarnego/zmiatającego. Analiza Western blot sugerowała, że LRP1 ulega ekspresji we frakcjach wzbogaconych w naczynia włosowate mózgu i komórkach śródbłonka naczyń włosowatych mózgu szczura30. Firmy takie jak Angiochem celują w LRP1 za pomocą wektorów peptydowych pochodzących z aprotyniny, które promują efektywny napływ leków przez barierę BBB31. Jednak LRP1 jest również zaangażowany w aktywny transport Aβ i jego wypływ/klirens z miąższu mózgu do krwi32. Takie dane obejmują LRP1 w dwukierunkowym transporcie przez barierę krew-mózg w zależności od jego ligandów. biOasis opracowuje technologię Transcend wykorzystującą białko melanotransferynę do transportu leków biologicznych, takich jak enzymy lizosomalne i przeciwciała, przez barierę krew-mózg33, podczas gdy VECT-HORUS opracowuje wektory peptydowe, które celują w LDLR34. Istnieją dane sugerujące, że LRP i LDLR mogą być wykorzystywane do transportu różnych cząsteczek, takich jak enzymy lizosomalne35,36 lub kompleksy nanocząstek przez BBB37.

Naszym polem zainteresowań jest dostarczanie leków do OUN za pomocą molekuł wektorowych i wektoryzowanych kandydatów na leki do leczenia chorób OUN. W szczególności dostarczanie leków przez barierę krew-mózg należy rozpatrywać w kontekście zapalenia nerwów, procesu, który może mieć różny zakres, ale jest prawdopodobnie wspólny dla wszystkich zmian i chorób OUN, w tym zapalenia mózgu, stwardnienia rozsianego, choroby Alzheimera itp. Zapalenie nerwów jest związane ze stanem zapalnym BBB i potencjalnie ze zmianami w fizjologii i przepuszczalności BBB, biorąc pod uwagę, że transport parakomórkowy i transkomórkowy może być wzmocniony w stanach patologicznych38,39,40,41,42,43. Na przykład TNF-α, TWEAK i inne cytokiny modulują stan zapalny, a eksperymenty z modelami BBB in vitro wykazały, że mogą zmieniać właściwości parakomórkowe monowarstwy komórek śródbłonka38,39,40 i że TNF-α prowadzi również do wzrostu transportu transkomórkowego LDL41, holotransferyny42 i laktoferyny43.

Naszym celem było opracowanie i scharakteryzowanie zoptymalizowanego i wysoce powtarzalnego modelu syngenicznego BBB u szczurów przy użyciu kokultur pierwotnych komórek śródbłonka mózgu i astrocytów. Użyliśmy 5-tygodniowych i nowonarodzonych szczurów rasy Wistar odpowiednio do produkcji komórek śródbłonka mózgu i produkcji astrocytów. Jednym z wyzwań było opracowanie protokołu umożliwiającego produkcję "odtwarzalnych co tydzień" modeli BBB. Aby osiągnąć ten cel, każdy etap protokołu produkcyjnego został wykonany w określonych dniach tygodnia, zaczynając od produkcji mikronaczyń mózgowych w środę pierwszego tygodnia. W ciągu ostatnich 3 lat sekcje były wykonywane prawie co tydzień. Aby jeszcze bardziej poprawić odtwarzalność kultur, ustanowiono system zapewnienia jakości. Wszystkie odczynniki i chemikalia zostały wymienione w bazie danych (data wprowadzenia, stan magazynowy, termin ważności itp.).

Model został scharakteryzowany według wielu kryteriów, takich jak organizacja i czystość komórek śródbłonka, TEER, przepuszczalność LY, odpowiedź na czynniki prozapalne, jakościowa i ilościowa ekspresja białek TJ, funkcjonalność transporterów wypływu, takich jak P-gp, oraz receptory zaangażowane w transcytozę w monowarstwie komórek śródbłonka, takie jak TfR lub LDLR.

Protokół

1. Produkcja astrocytów szczurów

Do każdego przygotowania użyj 10 nowonarodzonych szczurów rasy Wistar dowolnej płci.

  1. Złóż szczury w ofierze, obcinając głowy nożyczkami i natychmiast przenieś je na suchą szalkę Petriego pod kapturem z przepływem laminarnym. Usunąć mózgi z czaszki bez móżdżku i natychmiast przenieść je na szalkę Petriego zawierającą zimny bufor preparacyjny: HBSS uzupełniony 1% albuminą surowicy bydlęcej (niski poziom endotoksyny BSA), penicyliną 100 jednostek/ml i streptomycyną 100 μg/ml.
  2. Przetnij mózgi na pół, aby oddzielić 2 półkule mózgowe i przenieś je na czystą szalkę Petriego z buforem preparacyjnym na lodzie. Przeciąć nerw wzrokowy i usunąć opony mózgowe pod mikroskopem stereoskopowym.
  3. Dokładnie umyć kawałki kory mózgowej w 50 ml zimnego buforu do preparacji.
  4. Umieścić kawałki kory mózgowej z 3 mózgów w 15 ml probówce Falcon i rozdzielić przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół za pomocą jednorazowej pipety o pojemności 10 ml wyposażonej w niebieską końcówkę do 6 ml trypsyny 0,05% - EDTA 0,02% przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Dodać 24 ml DMEM uzupełnionego 10% FBS i następującymi antybiotykami, penicyliną 100 jednostek/ml i streptomycyną 100 μg/ml, pożywkę zwaną pożywką dla komórek glejowych (GCM) i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w RT. Partie FBS zostały wybrane i zatwierdzone pod kątem wzrostu i przeżycia naskórków astrocytów.
  6. Zawiesić osad zawierający zdysocjowane komórki w 10 ml GCM i rozmieścić w kolbie T o średnicy 75cm2 (T75). Zmień pożywkę następnego dnia, aby usunąć resztki komórek i DNA. Wymieniaj pożywki hodowlane dwa razy w tygodniu.
  7. Po 1 tygodniu proliferacji delikatnie wstrząsnąć komórkami glejowymi wytrząsarką orbitalną z prędkością 60 obr./min przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w GCM. Jeśli T75 nie może być umieszczony w inkubatorze z 5% CO2 / 95% powietrzem w wilgotnej atmosferze 37 °C, uzupełnij pożywkę 5 mM HEPES. Umyj komórki dwukrotnie, aby usunąć nieprzylegające komórki mikrogleju.
  8. Trzy tygodnie po wysianiu przemyj komórki dwukrotnie DPBS bez wapnia i magnezu. Dodać 3 ml ciepłej trypsyny 0,05%-EDTA 0,02%, inkubować w temperaturze 37 °C i czekać, aż warstwa komórkowa się rozproszy (zwykle 5 min). Zahamować aktywność trypsyny przez dodanie 10 ml GCM, przenieść zawiesinę komórkową do 15 ml probówki Falcona i odwirować przy 120 x g przez 8 min.
  9. Ponownie zawiesić osad astrocytów w 90% FBS – 10% DMSO, przenieść je do kriowiali (2 x 106 komórek na kriowial) i przechowywać w ciekłym azocie.

2. Izolacja mikronaczyń mózgu szczura

Nasze procedury eksperymentalne są zatwierdzone przez Komisję Etyki Wydziału Medycznego w Marsylii i są zgodne z krajowymi i europejskimi przepisami (dyrektywa UE nr 86/609). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.

  1. Do każdego preparatu i dla jednego eksperymentatora użyj 3 pięciotygodniowych szczurów rasy Wistar.
  2. W poniedziałek pierwszego tygodnia przygotować 2 kolby T75, pokrywając je kolagenem typu IV i fibronektyną, w stężeniu 1 μg/cm2 w sterylnej wodzie hodowlanej (10 ml na T75). Pozostawić do przylegania w temperaturze 37 °C do momentu wysiewu mikronaczyń.
  3. W środę rano pierwszego tygodnia poddać szczury eutanazji pod wpływem rosnącego strumienia CO2 w celu wywołania senności, utraty postawy i przerwy w oddychaniu, a następnie zwichnięcia szyjki macicy. Spryskaj głowice 70% etanolem. Odetnij głowy nożyczkami i przenieś je na suchą szalkę Petriego pod okapem z przepływem laminarnym.
  4. Usunąć mózgi z czaszki bez móżdżku i nerwów wzrokowych, a następnie przenieść je na szalkę Petriego schłodzoną na lodzie i wypełnioną zimnym buforem preparacyjnym (HBSS uzupełniony 1% BSA, penicylina 100 jednostek/ml i streptomycyna 100 μg/ml).
  5. Przetnij mózgi na pół, aby oddzielić 2 półkule mózgowe i oddzielić śródmózgowie od przodomózgowia. Przenieś przodomózgowie na czystą szalkę Petriego na lodzie z buforem preparacyjnym.
  6. Weź kilka półkul na nowej szalce Petriego z zimnym buforem preparacyjnym, aby ostrożnie usunąć opony mózgowe z przodomózgowia pod mikroskopem stereoskopowym z zakrzywionymi kleszczami nr 5. Następnie oczyść wnętrze mózgu, aby usunąć kołdrę z mieliny i uzyskać powłokę kory. Te kroki nie powinny zająć więcej niż 2 godziny w celu zachowania tkanek i przeżycia komórek.
  7. Odciąć korę mózgową od 3 mózgów do 6 ml zimnego buforu rozwarstwiającego w homogenizatorze o pojemności 7 ml przez 10 ruchów w górę iw dół każdym z 2 tłuczków o różnych odstępach, 71 μm, a następnie 20 μm.
  8. Podzielić zawiesinę w celu uzyskania ekwiwalentu 1 kory w 1 ml probówki Falcon o pojemności 50 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany szwaczek.
  9. Trawić zawiesinę z 1 kory za pomocą 1 ml roztworu enzymatycznego zawierającego mieszaninę kolagenaz / dypazy (60 μg/ml – 0,3 U/ml), DNazy typu I (35 μg/ml – 20 K jednostek/ml) i gentamycyny (50 μg/ml) w wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  10. Zmieszać 1 ml roztworu trawionego z 1 kory mózgowej z 10 ml 25 % BSA/HBSS 1X i rozdzielić przez odwirowanie zależne od gęstości przy 3 600 x g przez 15 minut w temperaturze suchej masy. Ostrożnie przenieść górny krążek (mielinę i miąższ mózgu) oraz supernatant do czystej probówki Falcona o pojemności 50 ml i powtórzyć wirowanie. Powstałą osadkę zawierającą mikronaczynia mózgowe przechowywać w temperaturze 4 °C.
  11. Ostrożnie wyrzuć górny dysk i supernatant. Zawiesić oba powstałe granulki zawierające mikronaczynia mózgowe za pomocą 1 ml zimnego HBSS 1X i przenieść do czystej probówki Falcon o pojemności 50 ml.
  12. Przemyć mikronaczynia przez dodanie 20 ml zimnego HBSS 1X i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut. Wyrzucić supernatant.
  13. Dalej trawić mikronaczynia z 1 kory za pomocą 1 ml tego samego roztworu enzymatycznego, jak opisano w kroku 2.9, przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w shakerze.
  14. Następnie wymieszaj strawione mikronaczynia z każdej z 3 kory w jednej probówce, a następnie rozdziel na dwie probówki Falcon o pojemności 50 ml, aby uzyskać mikronaczynia wyekstrahowane z odpowiednika półtorej (1,5) kory na probówkę. Dodać 30 ml zimnego buforu do rozwarstwiania i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Zawiesić osad mikronaczyniowy w 10 ml DMEM/F12 uzupełnionego 20% surowicą pochodzącą z osocza bydła ubogiego w płytki krwi, zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 2 ng/ml), heparyną (100 μg/ml), gentamycyną (50 μg/ml) i HEPES (2,5 mM), nazwaną pożywką z komórek śródbłonka (ECM) uzupełnioną puromycyną w stężeniu 4 μg/ml.
  16. Pobrać 2 powlekane kolby T75 z inkubatora, odessać nadmiar powłoki i umieścić mikronaczynia z każdej probówki w jednej kolbie T75 (mikronaczynia wyekstrahowane z 1,5 kory na kolbę T75).

3. Oczyszczanie i rozprzestrzenianie prymokultur RBEC

  1. Oczyszczanie: Od środy do piątku dodać puromycynę w ilości 4 μg/ml do pożywki hodowlanej. Zmień medium w czwartek. W piątek umyj komórki i dodaj puromycynę w ilości 2 μg/ml do poniedziałku.
  2. Proliferacja: w poniedziałek drugiego tygodnia umyj komórki i dodaj insulinę, transferynę i suplement seleninu sodu do pożywki, aż kultury osiągną 90% zbieżności w środę drugiego tygodnia.

4. Różnicowanie: Ustawianie modelu BBB In Vitro

  1. W poniedziałek drugiego tygodnia przygotuj filtry (polietylen, 12 studzienek, wielkość porów 1,0 μm), pokrywając mieszanką kolagenu typu IV i fibronektyny w ilości 0,5 μg /cm2 w sterylnej wodzie hodowlanej (500 μl mieszanki w górnej komorze i 1,5 ml sterylnej wody hodowlanej w dolnej komorze). Pozostawić do przylegania w temperaturze 37 °C do wysiewu RBEC.
  2. W poniedziałek drugiego tygodnia, pięć dni przed ustanowieniem kokultury, rozmrozić astrocyty z kriowiali w temperaturze 37 °C i przenieść do 15 ml Falcona z 10 ml GCM. Odwirować zawiesinę o sile 120 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Ponownie zawiesić osad astrocytów w GCM i płytce o gęstości 30 x 103 komórki na cm, 2 w płytkach 12-dołkowych.
  4. W środę drugiego tygodnia, tuż przed dysocjacją RBEC z trypsyną, należy dwukrotnie przemyć wstępnie pokryty filtr pożywką DMEM/F12. Wstępnie napełnij komory ECM: 1,5 ml w dolnej komorze i 0,5 ml w górnej komorze.
  5. W środę drugiego tygodnia przemyj dwukrotnie RBEC DPBS bez wapnia i magnezu. Dodać 4 ml ciepłego roztworu trypsyny 0,05% - EDTA 0,02% o temperaturze 37 °C na kolbę T75 dokładnie przez 30 sekund. Następnie usuń 3,5 ml roztworu trypsyny i obserwuj pod mikroskopem. Kiedy warstwa komórek zacznie odłączać się od matrycy, pomóż im, delikatnie stukając w krawędź kolby T75, aż wszystkie komórki zaczną się unosić.
  6. Dodać 9 ml ECM do kolby T75 i przenieść do 15 ml probówki Falcon. Bardzo delikatnie rozdzielić zawiesinę komórek, pipetując 4 razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml wyposażonej w żółtą końcówkę (unikać tworzenia się pęcherzyków w roztworze). Policz komórki w zawiesinie (około 3 x 106 komórek/T75) i natychmiast pokryj je wstępnie pokrytymi i wstępnie napełnionymi filtrami o dużej gęstości (160 x 10,3 ogniwa/filtr, a więc około 18 filtrów/T75) (Rysunek 8). Następnego dnia (czwartek) zmień dwukrotnie pożywkę górnej komory, aby usunąć resztki komórek.
  7. W czwartek drugiego tygodnia, dzień przed ustanowieniem kohodowli, zastąp pożywkę do hodowli astrocytów 1,5 ml pożywki różnicującej (ECM z hydrokortyzonem przy 500 nM), którą można uzupełnić 1/3 kondycjonowanej pożywki z podstawnego przedziału poprzedniej kokultury (3 dni kontaktu między komórkami śródbłonka a astrocytami).
  8. Piątek drugiego tygodnia definiuje się jako dzień 0 różnicowania; pożywki hodowlane z filtrów zawierających RBEC zastąpić pożywką różnicującą. Przenieś filtry RBEC do studzienek zawierających astrocyty. W tych warunkach modele in vitro różnicują i wyrażają białka związane z połączeniami w ciągu 3 dni.
  9. Modele zachowują swoje optymalne zróżnicowanie przez kolejne 3 dni, między poniedziałkiem a środą trzeciego tygodnia.

Wyniki

Protokół produkcji
Protokół można podzielić na 3 fazy odpowiadające głównym zmianom w składzie pożywek hodowlanych: (a) oczyszczanie komórek śródbłonka z mikronaczyń, (b) proliferacja oraz (c) różnicowanie na filtrach (polietylenowe płytki 12-dołkowe o porowatości 1 μm) w kokulturze z astrocytami. Poszczególne etapy protokołu produkcji przypisano do konkretnych dni tygodnia w celu zwiększenia powtarzalności pierwotnych kultur komórkowych (Rycina 1). W środę pierwszego tygodnia, czyli 9 dni przed ustanowieniem systemu kokultury, wyizolowano mikronaczynia (Rycina 2A). Aby oczyścić komórki śródbłonka, kultury utrzymywano w obecności malejących stężeń puromycyny przez 5 dni. Większość komórek zanieczyszczających (głównie perycyty) została wyeliminowana, a wzrost komórek śródbłonka był wolniejszy bez modyfikacji ich fenotypu. Komórki wrzecionowate wyrastają z fragmentów naczyń włosowatych wyizolowanych z szarej substancji mózgu szczura (Rycina 2B). W poniedziałek drugiego tygodnia astrocyty szczura wysiano na dno płytek 12-dołkowych. W środę RBEC dodano do przedziału luminalnego filtrów. Wysoka gęstość wysiewu wynosząca 160 x 103 komórek/cm2 (Rycina 2C) pomaga uniknąć luk na obwodzie filtra (Rycina 2D) i zapewnia jednorodne różnicowanie monowarstwy komórek śródbłonka. Komórki wykazują typową wydłużoną morfologię wrzecionowatą, ustawiają się podłużnie i tworzą jednorodną monowarstwę. W czwartek pożywkę do hodowli astrocytów wymieniono na pożywkę do różnicowania kondycjonowaną poprzednimi pożywkami z kokultur (Rycina 2E). W piątek RBEC na filtrach hodowano w pożywce zawierającej 500 nM hydrokortyzonu, a filtry przeniesiono na płytki 12-dołkowe zawierające astrocyty. W trzecim tygodniu eksperymenty przeprowadzano od poniedziałku do środy.

Charakterystyka RBEC i określanie parametrów przepuszczalności monowarstwy
Charakterystykę RBEC przeprowadzono za pomocą immunobarwienia markerów śródbłonkowych i BBB, a także poprzez pomiary TEER, przepuszczalności LY oraz funkcjonalności transporterów effluksu, takich jak P-gp.

RBEC uzyskane metodą oczyszczania puromycyną (Rycina 1 i 2) rosły w formie niezachodzących na siebie, ciągłych monowarstw, które wykazywały zahamowanie wzrostu przy osiągnięciu konfluencji oraz charakteryzowały się ściśle przylegającą, wrzecionowatą morfologią. Hodowle RBEC wykazywały typowe markery komórek śródbłonka: stwierdzono pozytywne barwienie immunohistochemiczne dla cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka płytek krwi (Rycina 3A; CD31/PECAM) oraz ekspresję czynnika von Willebranda (Rycina 3B). Bez zastosowania puromycyny RBEC są szybko infiltrowane przez perycyty, wykryte za pomocą barwienia immunohistochemicznego na desminę (Rycina 3C). Kwaśne białko włókienkowe gleju (GFAP) ekspresjonowane przez astrocyty (Rycina 3D) jest ważnym markerem różnicowania astrocytów. Przy wysokiej liczbie pasaży astrocyty tracą zdolność do indukowania różnicowania komórek śródbłonka. Z tego powodu hodowle astrocytów zostały zestandaryzowane pod kątem czasu hodowli i poddano je tylko jednemu pasażowi.

Hodowla RBEC w pożywce uzupełnionej hydrokortyzonem, a następnie kokultura z astrocytami oraz z pożywką warunkową z dolnej komory poprzednich kokultur, doprowadziła do silnej indukcji połączeń ścisłych (TJs) między komórkami śródbłonka w porównaniu do RBEC hodowanych samodzielnie. Komórki wykazywały ekspresję białek klaudyny-5, ZO-1 i okludyny, które lokalizowały się w połączeniach międzykomórkowych, co wykazano za pomocą immunofluorescencji (Ryc. 4B-D) oraz analizy western blot dla białek ZO-1 i okludyny (Ryc. 4E). Rozkład morfologiczny w kontaktach międzykomórkowych w konfiguracji przypominającej zamek błyskawiczny odzwierciedla (a) szczelność monowarstwy, (b) mózgowe pochodzenie komórek śródbłonka naczyń włosowatych i (c) jest charakterystyczny dla wysokodiferencjowanych komórek śródbłonka mózgowego. Przepuszczalność parakomórkowa warstwy śródbłonka była monitorowana poprzez pomiar TEER oraz szybkości napływu LY (457 Da) z górnej do dolnej komory filtrów. TEER mierzono przy użyciu ENDOHM-12 dla kubków hodowlanych 12 mm podłączonych do woltomierza EVOM. Wartość TEER monowarstw śródbłonka mózgowego, wskazująca na szczelność TJs, osiągnęła średnio 300 ohm · cm2 (filtry z płytek 12-dołkowych, dane nie pokazano). Wartość Pe dla LY (Pe(LY), stosowana jako kontrola integralności bariery i inkubowana wspólnie z testowanymi związkami) osiągnęła średnio 0.26 ± 0.11 x 10-3 cm/min (Ryc. 4F) w okresie 1 roku.

W celu wywołania stanu zapalnego RBEC zastosowano prozapalną cytokinę TNF-α w stężeniu 5 ng/ml przez 24 h, a odpowiedź zapalną monitorowano poprzez pomiar wydzielania CCL2 (MCP-1) przez RBEC w górnej komorze systemu hodowlanego, który wzrósł dwukrotnie z 120 ng/ml (kontrola nieleczona) do 250 ng/ml (Rycina 5A). Traktowanie TNF-α w stężeniu 5 ng/ml lub 50 ng/ml przez 24 h spowodowało również otwarcie BBB, co wykazało pomiar Pe(LY) (Rycina 5B).

P-gp zwizualizowano w zróżnicowanych RBEC za pomocą immunocytochemii (Rysunek 6A). Wiadomo, że lokalizacja P-gp jest silnie spolaryzowana i białko to jest wyrażane głównie w błonie apikalnej komórek śródbłonka44, podczas gdy transporter glutaminianu-1 (GLT-1) znajduje się głównie w frakcji bazolateralnej45. Aby ocenić stopień polaryzacji hodowanych RBEC, białka apikalne i bazolateralne oddzielono z preparatów błon plazmatycznych przy użyciu gradientów gęstości sacharozy46. Przeprowadzono analizę Western blot w celu oceny poziomów ekspresji P-gp i GLT-1 w preparatach błon plazmatycznych, apikalnych i bazalnych. Świeżo wyizolowane naczynia mikrokrążeniowe z mózgu szczura posłużyły jako najbliższe kontrole pozytywne dla dystrybucji tych białek in vivo (Rysunek 6B). Zarówno w naczyniach mikrokrążeniowych, jak i w preparatach błon zróżnicowanych RBEC, P-gp była wyrażana jako prążek 170 kDa, zlokalizowany głównie w frakcji błony apikalnej F1 (Rysunek 6B, C). Ekspresja GLT-1 była faktycznie stwierdzona w frakcji błony bazalnej F3 naczyń mikrokrążeniowych jako prążek 65-70 kDa, lecz nie została wykryta w hodowanych RBEC.

W równoległych eksperymentach aktywność funkcjonalną P-gp w monowarstwie komórek śródbłonka przetestowano, wykorzystując rhodamine 123 (R123) jako ligand. Efleks R123 w kierunku abluminalno-luminalnym (B do A) był 1,7 raza wyższy niż w kierunku przeciwnym (Ryc. 6D). Aby udowodnić udział P-gp, zastosowano specyficzne inhibitory P-gp: werapamil (25 µM, 30 min preinkubacji) oraz cyklosporynę A (1 µM, 30 min preinkubacji). Po zastosowaniu werapamilu i cyklosporyny akumulacja R123 w RBEC wzrosła odpowiednio 1,6-krotnie i 2-krotnie w porównaniu z nieleczoną kontrolą (Ryc. 6E).

Receptory zaangażowane w mechanizmy transcytozy zależnej od receptorów (RMT)
Model został dodatkowo scharakteryzowany pod kątem ekspresji różnych receptorów potencjalnie zaangażowanych w mechanizmy transcytozy w obrębie BBB, takich jak LRP1, LDLR lub TfR (Rysunek 7A).

Badania transportu funkcjonalnego przeprowadzono z wykorzystaniem ligandów dla TfR oraz LDLR. Żywe komórki RBEC inkubowano z transferryną szczurzą znakowaną CY3 (Tf-Cy3) przez 180 min w temperaturze 37 °C (Rysunek 7B, C). Ilościowe oznaczenie wychwytu i transportu Tf-Cy3 w szczurzym modelu bariery krew-mózg in vitro wykazało, że nachylenie krzywych nieznacznie zmalało powyżej 2,400 picomoli (Rysunek 7B), co sugeruje, że wiązanie/wychwyt miały charakter nasycalny. Ponadto nasycenie wiązania/wychwytu korelowało z akumulacją Tf w dolnej komorze. Aby potwierdzić tę obserwację, Tf-Cy3 w stężeniu 1,200 picomoli (wznosząca część krzywej) inkubowano z nadmiarem niefluorescencyjnej Tf w stężeniu 4,800 picomoli (plateau/nasycenie) (Rysunek 7C). Eksperymenty te wykazały spadek akumulacji Tf-Cy3 w dolnej komorze i potwierdziły nasycalny mechanizm typowy dla oddziaływania ligand-receptor w naszym modelu BBB in vitro.

Podobnie, funkcjonalność LDLR została wykazana poprzez wychwyt i transport jego liganda DiILDL przez monowarstwę komórek śródbłonka (Rycyna 7D, E). Żywe komórki RBEC inkubowano z DiILDL przez 30 min w temperaturze 37 °C. Wiązanie/wychwyt nie korelowało z akumulacją DiILDL w dolnej komorze (Rycyna 7D). Ilościowe oznaczenie transportu DiILDL wykazało, że nachylenie krzywych malało powyżej 2 µg, co sugeruje, że transport w naszym modelu był nasycalny i związany z receptorami. Azotek sodu dodano w stężeniu 0,05% na 15 min przed inkubacją z DiILDL (Rycyna 7E). Brak toksyczności inkubacji z azotkiem sodu w stężeniu 0,05% oceniono poprzez pomiar Pe(LY) (dane nie pokazano). Eksperymenty te wykazały zmniejszoną akumulację DiILDL w dolnej komorze. Ogólnie nasze wyniki sugerują występowanie RMT dla DiILDL w naszym modelu BBB in vitro.

Inne in vitro modele BBB oparte na komórkach śródbłonka rdzenia kręgowego szczura lub mózgu myszy
Trawienie enzymatyczne mieszaniną kolagenaz / dispazy jest jednym z głównych parametrów, które należy kontrolować pod kątem żywotności komórek i wydajności pozyskiwania mikronaczyń mózgowych. Stężenie enzymu, a co ważniejsze, stosunek ilości enzymu do tkanki, musi być precyzyjnie skalibrowany dla mózgu szczura, rdzenia kręgowego szczura oraz mózgu myszy. Gęstość wysiewu mikronaczyń oraz liczba komórek śródbłonka niezbędna do osiągnięcia 90% konfluencji (9 dni po wysiewie mikronaczyń) są ze sobą powiązane i stanowią istotne parametry wpływające na poprawę wzrostu komórek, ograniczenie liczby podwojeń populacji oraz jakość modeli. Mikronaczynia rdzenia kręgowego szczura otrzymywano zgodnie z tym samym protokołem, który opisano tutaj dla mikronaczyń mózgu szczura (w zakresie ilości tkanki: 2 rdzenie kręgowe odpowiadają w przybliżeniu 1 mózgowi), aby uzyskać taką samą liczbę komórek na kolbę T75 w tym samym czasie. Opony mózgowe z mózgów 5-tygodniowych myszy C57Bl6 były trudne do usunięcia, ponieważ przylegają do kory. Krótka inkubacja mózgu z dispazą wydaje się ułatwiać usuwanie opon. Kluczowe parametry przyczyniające się do wytworzenia powtarzalnych monowarstw komórek śródbłonka z mózgu szczura, rdzenia kręgowego szczura i mózgu myszy zostały podkreślone i podsumowane na Rysunku 8.

Proces izolacji i oczyszczania mikronaczyń mózgu szczura; schemat przedstawiający 3-tygodniowy harmonogram eksperymentu.
Rycina 1. Schemat blokowy podsumowujący główne etapy przygotowania modelu BBB in vitro. Poszczególne etapy protokołu produkcji zostały przypisane do konkretnych dni tygodnia w celu zwiększenia powtarzalności pierwotnych kultur komórek śródbłonka. Protokół rozpoczyna się w środę pierwszego tygodnia od produkcji mikronaczyń z 5-tygodniowych szczurów Wistar.

Mikroskopia hodowli komórkowych, fazy wzrostu; schemat układu eksperymentalnego, proces adhezji komórek.
Rycina 2. Mikrofotografie w kontraście fazowym RBEC, astrocytów i systemu kokultury. (A) Fragmenty mikronaczyń 5-tygodniowych szczurów Wistar w momencie wysiewania. (B) Trzydniowe hodowle RBEC traktowane przez 2 dni puromycyną, substratem P-gp, w stężeniu 4 µg/ml. (C) Czyste, konfluentne monowarstwy endotelialne w 1. dniu po wysiewaniu na filtry Millipore płytki 12-dołkowej powleczonej kolagenem typu IV i fibronektyną. (D) Jednorodność monowarstwy komórek na obrzeżach filtra wkładki. (E) Konfluentna hodowla astrocytów w dniu ustanowienia kokultury, wykazująca charakterystyczną morfologię plastra miodu. (F) Schemat przedstawiający system kokultury z lokalizacją mikrofotografii z paneli C, D i E.

Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej komórek barwionych na cytoszkielet i jądra; analiza struktury komórkowej.
Rysunek 3. Charakterystyka kultur RBEC za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. (A) Komórki śródbłonka mózgu wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej śródbłonka PECAM/CD31 na obwodzie komórki, (B) czynnik von Willebranda (VWF) wykazuje względnie punktowe barwienie, jaśniejsze i bardziej zagregowane w niektórych komórkach niż w innych oraz skoncentrowane w strefie okołojądrowej. (C) W przypadku braku traktowania kultur RBEC puromycyną, wykrywane są perycyty z dodatnim barwieniem immunologicznym na desminę (na zielono), które posiadają charakterystyczne małe, okrągłe jądra. (D) Astrocyty wykazują ekspresję kwaśnego białka włóknistego gleju (GFAP). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia immunofluorescencyjna komórek śródbłonka, analiza ekspresji białek, Western blot, model BHE.
Rycina 4. Charakterystyka immunocytochemiczna szczurzego modelu BHE in vitro oraz przepuszczalność parakomórkowa LY przez monowarstwę śródbłonka. Monowarstwę komórek barwiono immunocytochemicznie z użyciem (A) wimentyny, aby wykazać konfluentną monowarstwę komórek śródbłonka mózgowego o niezakładającej się morfologii i typowych komórkach wrzecionowatych o budowie śródbłonkowej, oraz ekspresję białek połączeń ścisłych: (B) claudin-5, (C) ZO-1 i (D) okludyny, wykrytej również za pomocą metody western blot dla białek ZO-1 i okludyny (E). (F) Szczelność monowarstwy w modelu BHE w płytce 12-dołkowej oceniano poprzez pomiar transportu lucifer yellow (LY-CH, sól dilitu), małej hydrofilowej cząsteczki (MW 457 Da) znanej z tego, że jest zatrzymywana przez BHE. W skrócie, LY inkubowano w górnej komorze układu hodowlanego w kontakcie z komórkami śródbłonka mózgowego przez 60 min w 37 °C. Po tym czasie zebrano medium z dolnej komory, a fluorescencję określono za pomocą analizy fluorymetrycznej ze spektrofluorymetrem przy wzbudzeniu 430 nm i emisji 535 nm. Wyniki wyrażono jako przepuszczalność lub Pe w 10-3 cm/min. Barierę uznaje się za przepuszczalną lub otwartą, gdy Pe dla LY wynosi powyżej 0,6x10-3 cm/min. Podczas każdego 1-godzinnego eksperymentu wykreślono średnią objętość oczyszczoną w funkcji czasu i oszacowano nachylenie za pomocą analizy regresji liniowej. Nachylenie krzywej oczyszczania dla filtrów kontrolnych z powłoką z kolagenu typu IV-fibronektyny oznaczono jako PSf, a nachylenie krzywej oczyszczania dla filtrów z monowarstwami komórek śródbłonka mózgowego jako PSt. Wartość PS dla monowarstwy śródbłonka (PSe) obliczono z: Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Równanie skuteczności komponentu elektrycznego, pokazuje 1/Pse = 1/Pst - 1/Psf; wyświetlanie wzoru.

Wartości PSe podzielono przez powierzchnię porowatej membrany (1,1 cm2 dla filtrów Millipore w płytkach 12-dołkowych), a otrzymany wynik stanowił współczynnik przepuszczalności (Pe), którego średnia wyniosła 0,26 ± 0,11 x 10-3 cm/min. Wyniki przedstawiono za pomocą pionowego wykresu rozrzutu dla n = 90 testów (średnia z n = 3 do n = 6 monowarstw na test).

Wykresy słupkowe uwalniania MCP-1 i przepuszczalności parakomórkowej; efekty TNF-α na RBEC w ciągu 24 godzin.
Rycina 5. In vitro odpowiedź modelu Bbariery krew-mózg na traktowanie pro zapalnym czynnikiem TNF-α. Pożywka z układu hodowlanego została wymieniona bezpośrednio przed traktowaniem TNF-α w stężeniu 5 ng/ml w komorze górnej przez 6 h, 12 h i 24 h. Uwalnianie CCL2 przez RBEC w komorze górnej zostało ilościowo określone za pomocą testu ELISA w porównaniu z nie traktowaną kontrolą. Należy zauważyć, że poziomy MCP-1 wzrastają nieznacznie w funkcji czasu, nawet w studniach nie traktowanych. Integralność bariery komórek śródbłonka, mierzona za pomocą endothelial Pe dla LY Pe(LY), wykazała wzrost przepuszczalności monowarstwy po 24 h traktowania TNF-α w stężeniach 5 ng/ml lub 50 ng/ml w zakresie odpowiednio 0,62 ± 0,02 x 10-3 cm/min i 0,7 ± 0,01 x 10-3 cm/min, w porównaniu z kontrolą wynoszącą 0,33 ± 0,03 x 10-3 cm/min (test t Studenta, p < 0,05).

Mikroskopia immunofluorescencyjna, ekspresja białek, Western blot, wykres aktywności transportowej RBEC.
Rycina 6. Funkcjonalność transportera eflluksyjnego P-gp i polaryzacja RBEC. Ekspresja transportera eflluksyjnego P-gp w komórkach śródbłonka mózgowego współhodowanych z astrocytami oceniana metodą immunocytochemiczną (A) oraz Western blot (B i C). Białka błony komórkowej wyekstrahowano za pomocą zestawu do frakcjonowania białek komórkowych. Błony plazmatyczne uzyskano poprzez lizę hipotoniczną i wirowanie różnicowe w celu usunięcia organelli i jąder. Rozdzielenie białek apikalnych i bazolateralnych z błon plazmatycznych przeprowadzono za pomocą gradientu gęstości sacharozy. P-gp lokalizował się głównie we frakcji apikalnej (F1), podczas gdy transporter glutaminianu-1 (GLT-1) lokalizował się głównie we frakcji bazolateralnej (F3). Oczyszczone mikonaczynia przed wysianiem posłużyły jako kontrola lokalizacji tych białek in vivo. Aktywność P-gp określono poprzez pomiar polaryzacji transportu R123, liganda P-gp. Strumień 1 µM R123 mierzono przez 1 hr w 37 °C w kierunku luminalno-abluminalnym (A do B) oraz w przeciwnym kierunku abluminalno-luminalnym (B do A). Ten sam eksperyment przeprowadzono bez RBEC, aby ocenić dyfuzję pasywną przez filtr wkładki, a dane znormalizowano względem tej wartości w celu obliczenia Pe(R123) (metodę obliczania Pe opisano w legendzie do Ryciny 5). Zawartość R123 w obu przedziałach mierzono spektrofluorymetrem (długość fali wzbudzenia 485 nm, długość fali emisji 535 nm). Dane przedstawiono jako 100% transportu luminalno-abluminalnego na podstawie Pe(R123) (A do B). Verapamil (25 µM, 30 min preinkubacji) oraz cyklosporyna A (1 µM, 30 min preinkubacji) zostały użyte jako referencyjne inhibitory P-gp. Akumulację R123 w RBEC mierzono po 2 hr z lub bez preinkubacji z inhibitorami P-gp (test t Studenta, p < 0.05). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat poboru i transportu komórkowego; obejmuje obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej białek (LRP1, LDLR) oraz wykresy poboru przedstawiające wyniki transportu Tf-Cy3 i DiILDL w różnych czasach inkubacji.
Rycina 7. Charakterystyka receptorów uczestniczących w transcytozie zależnej od receptorów (RMT). (A) Zróżnicowana monowarstwa RBEC została poddana immunobarwieniu przeciwciałami przeciwko receptorowi 1 lipoprotein o niskiej gęstości (LRP1) oraz receptorowi lipoprotein o niskiej gęstości (LDLR). Obraz konfokalny RBEC badanych pod kątem poboru DiILDL, fluorescencyjnego ligandu LDLR, oraz poboru szczurzej Transferryny-Cy3, fluorescencyjnego ligandu TfR, wykazuje punktowe barwienie na powierzchni komórek, z pewną agregacją w regionie okołojądrowym. (B) Szczurzą Tf-Cy3 dodano do górnej komory zawierającej zróżnicowaną monowarstwę RBEC w stężeniach 75, 150, 300, 600, 1 200, 2 400 i 4 800 pikomoli / insert przez 180 min w 37 °C (200 µL w górnej komorze i 1 200 µL w dolnej komorze). Po tym czasie fluorescencję Cy3 oznaczono ilościowo w lizacie komórkowym (200 µL PBS 0,1 % Triton X100) oraz w dolnej komorze za pomocą analizy fluorymetrycznej ze spektrofluorometrem przy wzbudzeniu 550 nm i emisji 570 nm. Jednostki fluorescencji przeliczono na pikomole, korzystając z liniowego zakresu pracy. (C) W eksperymentach nad nasyceniem szczurzą Tf-Cy3 dodano do górnej komory zawierającej zróżnicowaną monowarstwę RBEC w ilości 1 200 pikomoli / insert przez 180 min w 37 °C z 15-minutową preinkubacją lub bez niej z użyciem 4 800 pikomoli / insert niefluorescencyjnej Tf. Transport do dolnej komory oznaczono ilościowo jak w punkcie (B) (test t Studenta, p < 0,05). (D) DiILDL dodano do górnej komory zawierającej zróżnicowaną monowarstwę RBEC w ilościach 1, 2, 4 i 8 µg / insert przez 30 min w 37 °C (200 µl w górnej komorze i 1 200 µl w dolnej komorze). Po tym czasie fluorescencję DiI oznaczono ilościowo w lizacie komórkowym (200 µl PBS 0,1 % Triton X100) oraz w dolnej komorze za pomocą analizy fluorymetrycznej ze spektrofluorometrem przy wzbudzeniu 554 nm i emisji 571 nm. Jednostki fluorescencji przeliczono na µg, korzystając z liniowego zakresu pracy. (E) W eksperymentach nad blokowaniem transportu azotek sodu dodano w stężeniu 0,05 % na 15 min przed inkubacją DiILDL w ilości 2 µg / insert przez 30 min w 37 °C. Transport do dolnej komory oznaczono ilościowo jak w punkcie (D) (test t Studenta, p < 0,05). Brak toksyczności inkubacji azotkiem sodu w stężeniu 0,05 % oceniono poprzez pomiar Pe(LY) (dane nie pokazano). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Badanie mózgu szczura; obrazy immunofluorescencyjne ZO-1, okludyny; dane dotyczące konfluencji komórek; tabela eksperymentalna.
Rycina 8. In vitro modele BHE z komórek śródbłonka rdzenia kręgowego szczura lub z mózgu myszy. Tabela przedstawia kluczowe parametry izolacji mikronaczyń z mózgu szczura, rdzenia kręgowego szczura i mózgu myszy. Mikrofotografie przedstawiają immunobarwienie ZO1 i okludyny w monowarstwach komórek śródbłonka przygotowanych z mózgu szczura, rdzenia kręgowego szczura i mózgu myszy.

Dyskusja

Opisujemy wdrożenie cotygodniowego powtarzalnego protokołu izolacji i posiewu mikronaczyń mózgowych, po oczyszczeniu i hodowli RBEC oraz dalszym tworzeniu kokultur z pierwotnymi astrocytami szczurów w celu wygenerowania modelu BBB in vitro o charakterystycznych właściwościach BBB.

Pomyślne ustanowienie standaryzowanych kultur BBB in vitro wymaga optymalnych warunków w wielu kolejnych etapach procesu. Model został (a) zoptymalizowany w celu uzyskania najniższej przepuszczalności parakomórkowej, która pozostaje "Świętym Graalem" modeli BBB in vitro , oraz (b) zwalidowany pod kątem mechanizmów wypływu i RMT.

Produkcja, oczyszczanie i proliferacja RBEC

Największym wyzwaniem podczas uprawy RBEC jest osiągnięcie odtwarzalności między różnymi kulturami. Standaryzacja protokołu wymaga wysokiej jakości narzędzi do preparacji, wysokiej jakości odczynników i przestrzegania dat ważności odczynników. Eksperymentator musi być biegły w mikropreparowaniu pod mikroskopem stereoskopowym w celu szybkiego usunięcia opon mózgowych i dużych naczyń z powierzchni kory. Po wyizolowaniu i mechanicznej dysocjacji mózgów jednym z głównych wyzwań jest optymalne trawienie enzymatyczne świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgowych. Rodzaj i jakość użytych enzymów ma kluczowe znaczenie. Zastosowano mieszaninę kolagenaz typu I i II oraz dypazy w wysokim stężeniu o małej zmienności między partiami. Ważny jest również czas trwania trawienia enzymatycznego oraz stosunek stężenia enzymu do masy tkanki i objętości trawienia. Najlepszą wydajność produkcji mikronaczyń mózgowych uzyskano przy użyciu odpowiednika kory mózgowej z 1 mózgu w 1 ml kolagenazy / mieszanki dispazy w stężeniu 60 μg/ml podczas obu trawień, odpowiednio 30 min i 1 godz.

Kluczowe jest również eliminowanie komórek zanieczyszczających (astrocytów i głównie perycytów). Komórki te namnażają się szybciej niż komórki śródbłonka i nie tworzą ścisłych połączeń z tymi ostatnimi, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się jednorodnej monowarstwy komórkowej o dobrej restrykcyjności parakomórkowej. Biorąc pod uwagę, że komórki śródbłonka mózgu wyrażają znacznie wyższe poziomy pomp wypływowych, zwłaszcza P-gp, w porównaniu z innymi typami komórek występującymi w mikronaczyniach, lepiej tolerują one toksyczne stężenia leków ligandowych P-gp, podczas gdy komórki nieśródbłonkowe są eliminowane. Po leczeniu Puromycyną w dawce 4 μg/ml przez pierwsze dwa dni, po dwóch kolejnych dniach podawano dawkę 2 μg/ml w celu uzyskania dobrej czystości komórek śródbłonka. Ta selekcja może również faworyzować komórki śródbłonka naczyń włosowatych w porównaniu z komórkami z żyłek, tętniczek przedwłosowatych lub większych mikronaczyń i prowadzić do ciaśniejszych monowarstw. Ponadto użycie surowicy bydlęcej pochodzącej z osocza o niskiej jakości jest konieczne do uzyskania czystych kultur komórek śródbłonka47,48. Surowica pochodząca z osocza nie zawiera płytkowego czynnika wzrostu (PDGF), który jest mitogenny dla fibroblastów, komórek mięśni gładkich, a tym samym dla perycytów.

Zaobserwowaliśmy, że leczenie plastiku i filtrów mieszanką kolagenu typu IV od myszy i ludzkiej fibronektyny daje znaczącą przewagę, z 2-krotnym wzrostem wydajności proliferacji w porównaniu z tradycyjnie zalecanym kolagenem typu I ze szczurzego ogona. Ważne wskazówki dotyczące proliferacji komórek są dostarczane przez macierz zewnątrzkomórkową, taką jak aktywacja integryny i czynnika wzrostu (bFGF)49. Opisano stężenie buforu i pH pożywki hodowlanej jako pozytywnie wpływające na szczelność okołokomórkową50 i zaobserwowaliśmy lepszą odtwarzalność między kulturami po dodaniu buforu HEPES w 5 mM.

Zróżnicowanie RBEC: Ustanowienie wspólnej kultury na filtrach wsuwanych

Gdy komórki śródbłonka mózgu zostaną oczyszczone i będą się namnażać przez 6 dni, można je umieścić na filtrach. Posiewanie komórek o dużej gęstości ma kluczowe znaczenie dla uzyskania idealnej warstwy monocznej. Gęstość wysiewu 160x103 komórki na 12-dołkowe filtry płytkowe była konieczna i wystarczająca do uzyskania zlewającej się monowarstwy 24 godziny po wysiewie. Jednak izolacja pierwotnych komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu od ich środowiska jest paradoksem w budowie modelu BBB in vitro , ponieważ wiadomo, że komórki pierwotne, a zwłaszcza komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu, są silnie regulowane przez środowisko i czynniki indukcyjne wytwarzane przez różne otaczające typy komórek. Komórki śródbłonka naczyń włosowatych mózgu hodowane samodzielnie szybko się różnicują i tracą pewne specyficzne markery śródbłonka mózgu. Tak więc pierwotne komórki śródbłonka powinny być używane przy niskim pasażu (P1) i ponownie połączone, przynajmniej częściowo, ze swoim środowiskiem poprzez kohodowlę z astrocytami lub pożywką kondycjonowaną przez astrocyty47,51. Dotyczy to różnicowania astrocytów, ponieważ komórki śródbłonka mózgu i astrocyty są zaangażowane w dwukierunkową indukcję. Hodowla RBEC z astrocytami doprowadziła do silnej indukcji międzyśródbłonkowego TJ52,23. Molekularne mechanizmy reindukcji pozostają w dużej mierze nieznane, a w kilku laboratoriach trwają badania mające na celu zidentyfikowanie specyficznych czynników modulujących wydzielanych przez astrocyty, które mogą promować optymalne różnicowanie komórek śródbłonka53,54. Wykazano, że czynniki wydzielane przez komórki śródbłonka mózgu, w tym czynnik hamujący białaczkę (LIF), indukują różnicowanie astrocytów55,56. Przed ustanowieniem wspólnej hodowli astrocyty wystawiono na działanie pożywki różnicującej zawierającej agonistę receptora glikokortykosteroidowego hydrokortyzonu i pożywki kondycjonowanej współkulturą. Hydrokortyzon jest znany z tego, że poprawia szczelność komórek śródbłonka mózgu i jest stosowany w modelach BBB, zwłaszcza z komórek śródbłonka szczura57 i myszy58,59 . Kondycjonowaną pożywkę pobiera się z dolnego przedziału systemu kohodowli komórek śródbłonka/astrocytów po 3 dniach i zamraża do późniejszego wykorzystania. Zastosowanie pożywki kondycjonowanej współhodowlą skróciło czas różnicowania komórek śródbłonka do 3 dni przy optymalnej przepuszczalności parakomórkowej przez kolejne 2 dni, a także poprawiło odtwarzalność między kulturami.

Ogólnie rzecz biorąc, opisany przez nas protokół daje powtarzalny TEER powyżej 300 omów ·cm2 i średni współczynnik przepuszczalności parakomórkowej Pe(LY) wynoszący 0,26 ± 0,11 x 10-3 cm/min, podobnie jak najlepsze pierwotne modele BBB oparte na komórkach22,12. Protokół, który opisujemy w niniejszym manuskrypcie z proponowaną modulacją trawienia enzymatycznego mikronaczyń, może zostać rozszerzony na komórki śródbłonka z rdzenia kręgowego szczura60 i z mózgu myszy.

Charakterystyka molekularna i funkcjonalna

Oprócz indukcji TJ, astrocyty przyczyniają się również do ekspresji transporterów wypływu, takich jak P-gp, w komórkach śródbłonka mózgu61. Rzeczywiście pokazujemy ekspresję transportera wypływu P-gp w modelu BBB i pokazujemy polarność lokalizacji pompy wypływowej P-gp za pomocą podejść biochemicznych oraz aktywności P-gp za pomocą testu funkcjonalnego. Ekspresję GLT-1 wykryto we frakcji błony podstawnej mikronaczyń, ale nie wykryto jej w hodowanym RBEC. Stawiamy hipotezę, że GLT-1 był regulowany w dół w naszej hodowli RBEC w porównaniu z warunkami in vivo , a zatem nie był wykrywalny przez analizę western blot. Nadmiar glutaminianu jest neurotoksyczny i in vivo GLT-1 jest odpowiedzialny za wypływ glutaminianu z przedziału podstawnego (miąższu) do przedziału wierzchołkowego (krążenie krwi). W hodowlach astrocytów ekspresja GLT-1 pozostaje bardzo niska i jest indukowana przez dodanie glutaminianu do pożywki62,63.

Potwierdzamy również ekspresję transporterów napływu na błonie wierzchołkowej, takich jak LRP1, LDLR i TfR. Funkcjonalność TfR i LDLR wykazano za pomocą eksperymentów wiązania i transportu Tf-Cy3 i DiLDL ze strony luminalnej do abluminalnej monowarstwy, jak wcześniej wykazano w przypadku bydlęcego modelu BBB in vitro 64. Co ciekawe, wykazano, że zapotrzebowanie na lipidy od astrocytów zwiększa ekspresję LDLR na komórkach śródbłonka naczyń włosowatych mózgu65,66 , co dodatkowo potwierdza fizjologiczny przesłuch między astrocytami a komórkami śródbłonka mózgu, w tym in vitro. Zdecydowaliśmy się na przykład transportu za pomocą barwników fluorescencyjnych, takich jak Cy3 i DiI, biorąc pod uwagę, że analiza spektrofluorymetryczna jest dostępna w większości laboratoriów i może okazać się przydatna do walidacji modeli BBB in vitro . Jednak kwantyfikacja fluorescencji jest znacznie mniej czuła niż radioaktywność i wymaga zwiększenia liczby eksperymentów w celu uzyskania istotnych danych. Idealnie, Tf i LDL są zwykle znakowane radioaktywnie (jod 125) do takich eksperymentów wiązania/wychwytu i transportu.

Pokazujemy również, że zróżnicowana monowarstwa komórek śródbłonka uzyskana za pomocą proponowanego protokołu reaguje na stan zapalny wywołany przez TNF-α, co ujawnia się przez uwolnienie CCL2 i otwarcie BBB. CCL2 (MCP-1) i jego receptor CCR2 są zaangażowane w patologie OUN, takie jak stwardnienie rozsiane, eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE)67, uraz OUN68 i są znane jako mediatory migracji leukocytów do OUN w stanach neurozapalnych69,70. Na podstawie testowanego protokołu nie możemy stwierdzić spolaryzowanego wydzielania CCL2, ponieważ otwarcie BBB pozwala stężeniu CCL2 zrównoważyć się zarówno między górnymi (wierzchołkowymi), jak i dolnymi (podstawnymi) przedziałami. W związku z tym wyraźnie zaniżamy ilość CCL2 wytwarzanego przez RBEC w komplemencie wierzchołkowym po 24 godzinach (Figura 5A).

Ogólny przegląd i ograniczenia modeli BBB in vitro: In Vivo kontra porównania in vitro i gryzonie kontra ludzie

Wiele obiecujących leków na OUN, które okazały się skuteczne w pasażu BBB in vitro , nie powiodło się w badaniach klinicznych z powodu braku przewidywalności na podstawie modeli BBB in vitro , często opartych na komórkach wyizolowanych z innych gatunków niż człowiek. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, modele BBB in vitro są prawdopodobnie bardziej predykcyjne, jeśli chodzi o badanie mechanistycznych aspektów sieci białkowych, transdukcji sygnału, transporterów i receptorów. Każdy mechanizm, szlak lub cel, który ma być badany in vitro , musi być scharakteryzowany pod kątem jego regulacji przez uzupełniające się sygnały środowiskowe (inne typy komórek, substancje chemiczne, białka) i połączony z badaniami in situ z tymi samymi gatunkami zwierząt oraz, jeśli to możliwe, z mikronaczyniami i komórkami śródbłonka wyizolowanymi od ludzi, z ograniczeniami i ostrożnością przywołanymi poniżej.

Metody in vitro Modele BBB muszą być postrzegane jako systemy autonomiczne, odizolowane od regulacji ciała, ale nadal obdarzone ważnymi właściwościami in vivo i potencjałem regulacji przez sygnały środowiskowe. Nie zaproponowano jeszcze "idealnego" modelu BBB in vitro 71,72,73 , ponieważ monowarstwy komórek śródbłonka nie mają wielu ważnych składników jednostki nerwowo-glejowej (NGVU) i są odizolowane od regulacji krwi i ciała. Brak perycytów74,16 lub neuronów17,18 lub różnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej używanej do powlekania tworzywem sztucznym lub pożywki hodowlanej i surowicy używanej do wzrostu komórek w najpowszechniejszych i "najłatwiejszych do wykonania" modelach BBB in vitro opartych na komórkach śródbłonka zróżnicowanych astrocytami może modulować ekspresję białka w porównaniu z sytuacją in vivo75. Modele te mogą wyrażać wiele transporterów wyświetlanych in vivo, ale nie wszystkie. W niektórych przypadkach parametry transportu najpierw zweryfikowano w izolowanych mikronaczyniach (najbardziej zbliżonych do sytuacji in vivo ), a następnie zbadano w systemach hodowli komórkowych76,61.

Badania z zakresu biologii molekularnej pozwoliły na scharakteryzowanie ekspresji genów i białek w izolowanych mikronaczyniach i kulturach komórek śródbłonka o niskim pasażu tego samego gatunku i między różnymi gatunkami, najczęściej od małych zwierząt, takich jak gryzonie (myszy i szczury) lub od krów i świń w porównaniu z ludźmi77,78,75,15. Porównanie transkryptomiczne między komórkami śródbłonka mikronaczyń mózgowych in vivo i in vitro wykazało liczne transkrypty genów, które ulegały zróżnicowanej ekspresji i najczęściej znacznie obniżone in vitro. Transkrypty kodujące transportery napływu, takie jak TfR i białka biorące udział w transporcie pęcherzyków, są głównie regulowane w dół w hodowanych komórkach śródbłonka mózgu, co sugeruje ogólny spadek endocytozy i transportu pęcherzykowego w takich komórkach. Manipulacja kulturą pod kątem czystości (leczenie puromycyną) i leczenie hydrokortyzonem może pomóc w przywróceniu bardziej "in vivo" profilu ekspresji genów77. Badania transkryptomiczne ujawniły również istotne różnice między gatunkami, które dodatkowo komplikują przewidywania dotyczące przyjmowania narkotyków przez ludzi w oparciu o modele BBB in vitro gryzoni 75. Metody in vitro Opisano modele BBB polegające na jednoczesnej hodowli ludzkich komórek śródbłonka i astrocytów15. Chociaż modele te są istotne, są trudniejsze do regularnego wdrażania, ponieważ wymagają regulowanego dostępu do pośmiertnych tkanek ludzkich i występują niejednorodności w jakości/właściwościach komórek śródbłonka ludzkiego mózgu w zależności od wieku, chorób i ewentualnego leczenia dawców. Należy dołożyć starań w celu opracowania nowych modeli in vitro , które lepiej odwzorowują fizjologiczne, anatomiczne i funkcjonalne cechy wirusa BBB in vivo . Kohodowle obejmujące trzy typy komórek są bardzo restrykcyjne i wydają się trudne do rutynowego wdrożenia. Do tej pory najbardziej złożonymi modelami BBB in vitro są dynamiczne modele in vitro (DIV-BBB), które obejmują organizację podobną do naczynia z astrocytami i obejmują przepływ pożywki naśladującej przepływ krwi 75,79,80,81,82,83,84,85. Kiedy komórki śródbłonka mózgu są wystawione na przepływ, wygenerowane naprężenie ścinające aktywuje mechanoprzetworniki na powierzchni komórki, które modulują ekspresję różnych genów zaangażowanych w fizjologię komórek śródbłonka, takich jak podział komórek, różnicowanie, migracja i apoptoza80. In vivo naprężenie ścinające generowane przez przepływ krwi jest odpowiedzialne za zatrzymanie mitotyczne na styku komórki, co pozwala na utworzenie monowarstwy komórek śródbłonka w naczyniach krwionośnych80. Analiza genomiczna i proteomiczna prawidłowych komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu wykazała wpływ naprężenia ścinającego na fizjologię śródbłonkaBBB 84. Naprężenie ścinające jest odpowiedzialne za przeżycie komórek, wyższy stopień adhezji komórek śródbłonka, indukcję pompy wypływowej i lepszą polaryzację transporterów75, regulację metabolizmu glukozy75,86, utlenianie za pośrednictwem enzymów CYP45075 oraz regulację przepuszczalności parakomórkowej poprzez zwiększenie ekspresji genów kodujących międzykomórkowe elementy połączeniowe, takie jak okludyna i ZO-187,75,80 a co za tym idzie wysoki TEER około 1 500 - 2 000 omów · cm2, najbliższy znanym parametrom in vivo 79,80

W przemyśle biotechnologicznym i farmaceutycznym rutynowe badania przesiewowe leków, a nawet wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) oraz wysiłki na rzecz ograniczenia eksperymentów na zwierzętach doprowadziły do opracowania różnych linii komórkowych, które mają być wykorzystywane do zastąpienia pierwotnej hodowli komórek śródbłonka mózgu, które pozostają trudniejsze do rutynowego stworzenia. W większości przypadków pierwotne hodowle komórek śródbłonka mózgu były transdukowane genem unieśmiertelniającym (SV40 lub wirus polioma duży antygen T lub adenowirus E1A), albo przez transfekcję plazmidowego DNA, albo przez infekcję za pomocą wektorów retrowirusowych88,89,75. Opracowano kilka linii komórek śródbłonka pochodzenia mózgowego, takich jak linie komórek szczurzych RBE4, GP8 / 3.9, GPNT, RBEC1, TR-BBB lub rBCEC488,75, linia komórkowa myszy b.End390,75, linia komórek świń PBMEC / C1-2 87,75 i linia komórek ludzkich hCMEC / D389,75. Inne modele opierają się na komórkach pochodzenia niemózgowego, takich jak nerka psa Madin-Darby (MDCK) lub linie komórkowe Caco212,75. Wśród różnych linii komórkowych śródbłonka ludzkiego mózgu, hCMEC / D3 jest szeroko cytowany i ulepszany jako model BBB od czasu jego powstania w 2005 r.91,92. Podobnie jak hodowle pierwotne, linie komórkowe mają zalety i ograniczenia. Są łatwiejsze w obsłudze niż kultury pierwotne, mają wydłużoną żywotność, są dobrze scharakteryzowane i umożliwiają powtarzalność między eksperymentami na dużą skalę. Jednak linie komórkowe mogą utracić funkcje specyficzne dla tkanki, utracić regulację środowiska i uzyskać fenotyp molekularny zupełnie inny niż komórki in vivo75,89. W szczególności monowarstwy wytworzone z linii komórkowych charakteryzują się zmniejszoną szczelnością, niskim TEER i wykazują zmienność profilu transportera75,89. W związku z tym często preferowane są eksperymenty na zwierzętach lub badania na komórkach pierwotnych, pomimo ich dodatkowej złożoności.

Oświadczenia

Michel Khrestchatisky jest dyrektorem laboratorium UMR7259, współzałożycielem i doradcą naukowym firmy biotechnologicznej VECT-HÓRUS.

Podziękowania

Wsparcie finansowe dla VECT-HORUS jest potwierdzone przez Fonds Unique Interministériel (projekt FUI/ MEDUL) oraz dla VECT-HORUS i laboratorium UMR7259 przez Agence Nationale de la Recherche (wspólne projekty ANR, TIMPAD, VECtoBrain, VEC2Brain, ADHOC i PREVENTAD). Laboratorium UMR7259 dziękuje również za wsparcie finansowe ze strony CNRS i Uniwersytetu w Aix-Marsylii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BSA frakcja V niska endotoksynaPAAK45-011-500g4 ° C 
Penicylina-streptomycynaInvitrogen15140-122-20° C
0,05% Trypsyna-EDTA (1X)Invitrogen25300-054-20° C
DMEM wysoki poziom glukozyInvitrogen61965-0264 ° C 
Surowica bydlęcapłodu Invitrogen10270-098-20° C / 1 rok
Kolby T75Becton Dickinson Falcon353135
bufor HEPES (1 M)Invitrogen15630-0564 ° C / 1 rok
Mysz z kolagenem typu IV (10 x 1 mg)Becton Dickinson356233-20 ° C / 1 miesiąc
Fibronectin humain osocze (5 mg)Becton Dickinson356008-20 ° C / 1 miesiąc
Nożyczki sprężynowe Vannas, proste (9 cm)Fine Science Tools91500-09
Nożyczki, proste (9 cm)Fine Science Tools14568-09
Kleszcze Dumont #5/45 (11 cm)Fine Science Tools11251-35
Graefe Kleszcze, szerokość końcówki 0,8 mmFine Science Tools11050-10
Graefe Kleszcze, szerokość końcówki krzywej 0,8 mmFine Science Tools11051-10
Kolagenazy / mieszanina dypazy (2 x 5 mg)Roche Diagnostics05 401 054 001-20° C / 3 miesiące
DNaza I (100 mg / 569 KU / mg)Sigma AldrichDN25-100mg-20 ° C / 1 rok
Gentamycyna (10 mg / ml)Invitrogen15710-0494 ° C / 1 rok
DMEM/F12Invitrogen31331-0284 &stopnie; C 
Surowica bydlęca z osocza ubogiego w płytki krwi (500 ml)ClinisciencesBT-214-100-20° C / 1 rok
bFGF (10 &mikro; g)Invitrogen13256-029-20° C / 6 miesięcy
Heparyna Na sól z błony śluzowej świni Grade ISigma AldrichH3149-100KU4 ° C / 1 rok
PuromycinSigma AldrichP8833-10mg-20 ° C / 6 miesięcy
ITSXInvitrogen51500-0564 &stopnie; C / 1 rok
Polietylenowa wkładka do zawieszania komórek do płytek 12-dołkowychMilliporePIRP15R48Porowatość: 1 &mikro; m
Powierzchnia: 1,1 cm2
HydrokortyzonSigmaAldrich H0888-1g-20 ° C / 1 rok
Mysz anty-CD31 / PECAM ChemiconMAB1393, klon TLD-3A12 (1 mg/mL)1/200 - utrwalenie PFA 4%
Królik anty-Von WillebrandChemiconAB73561/200 - utrwalenie PFA 4%
Mysz anty-DesmineChemiconMAB34301/200 - utrwalenie PFA 4%
Mysz anty-VimentineInvitrogen, Zymed08-0052 klon V9, (58 &mikro; g/ml) 1/50 - utrwalenie PFA 4%
Mysz anty-Claudin-5Invitrogen, Zymed35-2500, (500 &mikro; g/ml)1/200 - utrwalanie PFA 4%
Królik anty-ZO-1Invitrogen, Zymed61-7300 (250 &mikro; g/ml)1/200 - utrwalacz PFA 4%
Królik anty-Okludyna Invitrogen, Zymed71-1500 (250 &mikro; g/ml)1/200 - utrwalenie PFA 4%
Alexa Fluor 488, 594 sprzężone przeciwciała drugorzędoweInvitrogen1/800
Lucifer Yellow CH, sól dilithiumSigma AldrichL0259-20° C
TNF-alfa człowiekPeproTech300-01A-20° C
Rat MCP-1 Zestaw ELISAPeproTech900-K594 & stopnie; C / -20 ° C
Mysia anty-glikoproteina PCovance, EurogentecSIG-38710-1000, klon C219 (1 mg / ml)1/400 - utrwalenie PFA 4%
1/200 (western blot)
Królik anty-GLT-1Abcamab416211/1,000 (western blot)
Rodamina 123Sigma Aldrich837024 ° C
Chlorowodorek werapamiluSigma AldrichV46294 ° C
Cyklosporyna ASigma Aldrich300244 ° C
Monoklonalny receptor makroglobuliny anty-a2 (CD91, LRP1) przeciwko łańcuchowi b aminokwasu 4291-4344 w powtórzeniu EGFAmerican Diagnostica3501 (100 &mikro; g/ml)1/5 - utrwalenie PFA 4%
Mysz anty-LDLRR& Systemy DAF2255 (200 µ g/ml)1/50 - utrwalenie PFA 4%
Transferyna dla szczurów-Cy3GentaurJOR1600504 ° C
DiILDLInvitrogenL-34824 ° Z

Bibliografia

  1. Rubin, L. L., Staddon, J. M. The cell biology of the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. 22, 11-28 (1999).
  2. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5-23 (2005).
  3. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  4. Pekny, M., Stanness, K. A., Eliasson, C., Betsholtz, C., Janigro, D. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice. Glia. 22 (4), 390-400 (1998).
  5. Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J Appl Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
  6. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. J Neurochem. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  7. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicol In Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. Porcine brain microvessel endothelial cells as an in vitro model to predict in vivo blood-brain barrier permeability. Drug Metab Dispos. 34 (11), 1935-1943 (2006).
  9. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Res. 1521, 1-15 (2012).
  10. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  11. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochem Int. 54 (3-4), 253-263 (2009).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Coisne, C., et al. Mouse syngenic in vitro blood-brain barrier model: a new tool to examine inflammatory events in cerebral endothelium. Lab Invest. 85 (6), 734-746 (2005).
  14. Josserand, V., et al. Evaluation of drug penetration into the brain: a double study by in vivo imaging with positron emission tomography and using an in vitro model of the human blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 316 (1), 79-86 (2006).
  15. Lacombe, O., et al. In vitro primary human and animal cell-based blood-brain barrier models as a screening tool in drug discovery. Mol Pharm. 8 (3), 651-663 (2011).
  16. Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  17. Lippmann, E. S., Weidenfeller, C., Svendsen, C. N., Shusta, E. V. Blood-brain barrier modeling with co-cultured neural progenitor cell-derived astrocytes and neurons. J Neurochem. 119 (3), 507-520 (2011).
  18. Xue, Q., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  19. Sohet, F., Daneman, R. Genetic mouse models to study blood-brain barrier development and function. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 3 (2013).
  20. Shayan, G., Choi, Y. S., Shusta, E. V., Shuler, M. L., Lee, K. H. Murine in vitro model of the blood-brain barrier for evaluating drug transport. Eur J Pharm Sci. 42 (1-2), 148-155 (2011).
  21. Cecchelli, R., et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  22. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  23. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Res. 1150, 1-1 (2007).
  24. Pardridge, W. M., Buciak, J. L., Friden, P. M. Selective transport of an anti-transferrin receptor antibody through the blood-brain barrier in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 259 (1), 66-70 (1991).
  25. Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. J Neurochem. 53 (2), 340-345 (1989).
  26. Gosselet, F., Candela, P., Sevin, E., Berezowski, V., Cecchelli, R., Fenart, L. Transcriptional profiles of receptors and transporters involved in brain cholesterol homeostasis at the blood-brain barrier: use of an in vitro model. Brain Res. 1249, 34-42 (2009).
  27. Pardridge, W. M. Vector-mediated drug delivery to the brain. Adv Drug Deliv Rev. 36 (2-3), 299-321 (1999).
  28. Pardridge, W. M., Boado, R. J. Reengineering biopharmaceuticals for targeted delivery across the blood-brain barrier. Methods Enzymol. 503, 269-292 (2012).
  29. Boado, R. J., Lu, J. Z., Hui, E. K., Sumbria, R. K., Pardridge, W. M. Pharmacokinetics and brain uptake in the rhesus monkey of a fusion protein of arylsulfatase a and a monoclonal antibody against the human insulin receptor. Biotechnol Bioeng. 110 (5), 1456-1465 (2013).
  30. Ito, S., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Functional characterization of the brain-to-blood efflux clearance of human amyloid-beta peptide (1-40) across the rat blood-brain barrier. Neurosci Res. 56 (3), 246-252 (2006).
  31. Demeule, M., et al. Identification and design of peptides as a new drug delivery system for the brain. J Pharmacol Exp Ther. 324 (3), 1064-1072 (2008).
  32. Yamada, K., et al. The low density lipoprotein receptor-related protein 1 mediates uptake of amyloid beta peptides in an in vitro model of the blood-brain barrier cells. J Biol Chem. 283 (50), 34554-34562 (2008).
  33. Gabathuler, R. New protein vectors for physiological transfer of therapeutic agents to the central nervous system. Biol Aujourdhui. 206 (3), 191-203 (2012).
  34. Malcor, J. D., et al. Chemical optimization of new ligands of the low-density lipoprotein receptor as potential vectors for central nervous system targeting. J Med Chem. 55 (5), 2227-2241 (2012).
  35. Wang, D., et al. Engineering a lysosomal enzyme with a derivative of receptor-binding domain of apoE enables delivery across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (8), 2999-3004 (2013).
  36. Spencer, B. J., Verma, I. M. Targeted delivery of proteins across the blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7594-7599 (2007).
  37. Kreuter, J., et al. Apolipoprotein-mediated transport of nanoparticle-bound drugs across the blood-brain barrier. J Drug Target. 10 (4), 317-325 (2002).
  38. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Brain endothelial cell-cell junctions: how to 'open' the blood brain barrier. Curr Neuropharmacol. 6 (3), 179-192 (2008).
  39. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  40. Stephan, D., et al. TWEAK/Fn14 pathway modulates properties of a human microvascular endothelial cell model of blood brain barrier. J Neuroinflammation. 10 (9), (2013).
  41. Descamps, L., Cecchelli, R., Torpier, G. Effects of tumor necrosis factor on receptor-mediated endocytosis and barrier functions of bovine brain capillary endothelial cell monolayers. J Neuroimmunol. 74 (1-2), 173-184 (1997).
  42. Miller, F., et al. The MAP kinase pathway mediates transcytosis induced by TNF-alpha in an in vitro blood-brain barrier model. Eur J Neurosci. 22 (4), 835-844 (2005).
  43. Fillebeen, C., Dehouck, B., Benaïssa, M., Dhennin-Duthille, I., Cecchelli, R., Pierce, A. Tumor necrosis factor-alpha increases lactoferrin transcytosis through the blood-brain barrier. J Neurochem. 73 (6), 2491-2500 (1999).
  44. Zhang, Y., Schuetz, J. D., Elmquist, W. F., Miller, D. W. Plasma membrane localization of multidrug resistance-associated protein homologs in brain capillary endothelial cells. J Pharmacol Exp Ther. 311 (2), 449-455 (2004).
  45. Kane, R. L., Martínez-López, I., DeJoseph, M. R., Viña, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. A mechanism for glutamate removal. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  46. Kannan, R., Mittur, A., Bao, Y., Tsuruo, T., Kaplowitz, N. GSH transport in immortalized mouse brain endothelial cells: evidence for apical localization of a sodium-dependent GSH transporter. J Neurochem. 73 (1), 390-399 (1999).
  47. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (1), 23-37 (1992).
  48. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J. Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  49. Tsou, R., Isik, F. F. Integrin activation is required for VEGF and FGF receptor protein presence on human microvascular endothelial cells. Mol Cell Biochem. 224 (1-2), 81-89 (2001).
  50. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. AAPS J. 12 (4), 759-770 (2010).
  51. Rubin, L. L., Sanes, J. R. Neuronal and glial cell biology. Curr Opin Neurobiol. 6 (5), 573-575 (1996).
  52. Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  53. Deracinois, B., et al. Glial-cell-mediated re-induction of the blood-brain barrier phenotype in brain capillary endothelial cells: a differential gel electrophoresis study. Proteomics. 13 (7), 1185-1199 (2013).
  54. Haseloff, R. F., Blasig, I. E., Bauer, H. C., Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 25-39 (2005).
  55. Mi, H., Haeberle, H., Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J Neurosci. 21 (5), 1538-1547 (2001).
  56. Abbott, N. J. Astrocyte endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J. Anat. 200 (6), 629-638 (2002).
  57. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. J Neurochem. 97 (4), 922-933 (2006).
  58. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. J. Physiol. 565 (Pt 2), 475 (2005).
  59. Förster, C., Waschke, J., Burek, M., Leers, J., Drenckhahn, D. Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific. J. Physiol. 573 (Pt 2), 413 (2006).
  60. Ge, S., Pachter, J. S. Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine spinal cord. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 209-214 (2006).
  61. Berezowski, V., Landry, C., Dehouck, M. P., Cecchelli, R., Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood-brain barrier. Brain Res. 1018 (1), 1-9 (2004).
  62. Duan, S., Anderson, C. M., Stein, B. A., Swanson, R. A. Glutamate induces rapid upregulation of astrocyte glutamate transport and cell-surface expression of GLAST. J Neurosci. 19 (23), 10193-10200 (1999).
  63. Gegelashvili, G., Dehnes, Y., Danbolt, N. C., Schousboe, A. The high-affinity glutamate transporters GLT1, GLAST, and EAAT4 are regulated via different signalling mechanisms. Neurochem Int. 37 (2-3), 163-170 (2000).
  64. Candela, P., et al. Physiological pathway for low-density lipoproteins across the blood-brain barrier: transcytosis through brain capillary endothelial cells in vitro. Endothelium. 15 (5-6), 254-264 (2008).
  65. Dehouck, B., Dehouck, M. P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Upregulation of the low density lipoprotein receptor at the blood-brain barrier: intercommunications between brain capillary endothelial cells and astrocytes. J Cell Biol. 126 (2), 465-473 (1994).
  66. Dehouck, B., Fenart, L., Dehouck, M. P., Pierce, A., Torpier, G., Cecchelli, R. A new function for the LDL receptor: transcytosis of LDL across the blood-brain barrier. J Cell Biol. 138 (4), 877-889 (1997).
  67. Mahad, D. J., Ransohoff, R. M. The role of MCP-1 (CCL2) and CCR2 in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Semin Immunol. 15 (1), 23-32 (2003).
  68. Glabinski, A. R., Ransohoff, R. M. Chemokines and chemokine receptors in CNS pathology. J Neurovirol. 5 (1), 3-12 (1999).
  69. Stamatovic, S. M., et al. Monocyte chemoattractant protein-1 regulation of blood-brain barrier permeability. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (5), 593-606 (2005).
  70. Semple, B. D., Kossmann, T., Morganti-Kossmann, M. C. Role of chemokines in CNS health and pathology: a focus on the CCL2/CCR2 and CXCL8/CXCR2 networks. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (3), 459-473 (2010).
  71. Veszelka, S., Nakagawa, S., Niwa, M., Deli, M. A. Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery. Recent Pat CNS Drug Discov. 6 (2), 107-118 (2011).
  72. Patabendige, A. The value of in vitro models of the blood-brain barrier and their uses. Altern Lab Anim. 40 (6), 335-338 (2012).
  73. Ogunshola, O. O. In vitro modeling of the blood-brain barrier: simplicity versus complexity. Curr Pharm Des. 17 (26), 2755-2761 (2011).
  74. Vandenhaute, E., et al. Modelling the neurovascular unit and the blood-brain barrier with the unique function of pericytes. Curr Neurovasc Res. 8 (4), 258-269 (2011).
  75. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Curr Drug Metab. 14 (1), 120-136 (2013).
  76. Vernon, H., Clark, K., Bressler, J. P. In vitro models to study the blood brain barrier. Methods Mol Biol. 758, 153-168 (2011).
  77. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (1), 135-148 (2008).
  78. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Kamiie, J., Terasaki, T. Blood-brain barrier (BBB) pharmacoproteomics: reconstruction of in vivo brain distribution of 11 P-glycoprotein substrates based on the BBB transporter protein concentration, in vitro intrinsic transport activity, and unbound fraction in plasma and brain in mice. J Pharmacol Exp Ther. 339 (2), 579-588 (2011).
  79. Cucullo, L., Aumayr, B., Rapp, E., Janigro, D. Drug delivery and in vitro models of the blood-brain barrier. Curr Opin Drug Discov Devel. 8 (1), 89-99 (2005).
  80. Naik, P., Cucullo, L. In vitro blood-brain barrier models: current and perspective technologies. J Pharm Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  81. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood--brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  82. Santaguida, S., et al. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  83. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  84. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, M., Marchi, V., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12 (40), (2011).
  85. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. , (2013).
  86. Qutub, A. A., Hunt, C. A. Glucose transport to the brain: a systems model. Brain Res Brain Res Rev. 49 (3), 595-617 (2005).
  87. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Roux, F., Couraud, P. O. Rat brain endothelial cell lines for the study of blood-brain barrier permeability and transport functions. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 41-58 (2005).
  89. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  90. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Res. 990 (1-2), 995-112 (2003).
  91. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  92. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 312-328 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki r db onka m zgu szczurakokultura z astrocytamibia ka po cze cis ychtransendotelialna oporno elektrycznaprzepuszczalno dla Lucifer Yellowtransport P glikoproteinytranscytoza zale na od receptor wizolacja mikronaczy
Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.