Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.
Pomimo szybkiego postępu w mikroskopii wysokoprzepustowej, ilościowe testy oparte na obrazach nadal stanowią poważne wyzwanie. Chociaż dostępnych jest wiele specjalistycznych narzędzi do analizy obrazu, większość tradycyjnych procesów pracy opartych na analizie obrazów ma strome krzywe uczenia się (w celu precyzyjnego dostrojenia parametrów analizy) i skutkuje długimi czasami realizacji między obrazowaniem a analizą. W szczególności segmentacja komórek, czyli proces identyfikacji pojedynczych komórek na obrazie, jest głównym wąskim gardłem w tym zakresie.
Tutaj prezentujemy alternatywny, wolny od segmentacji komórek przepływ pracy oparty na PhenoRipper, platformie oprogramowania open source przeznaczonej do szybkiej analizy i eksploracji obrazów mikroskopowych. Przedstawiony tutaj potok jest zoptymalizowany pod kątem obrazów mikroskopii immunofluorescencyjnej kultur komórkowych i wymaga minimalnej interwencji użytkownika. W ciągu pół godziny PhenoRipper może przeanalizować dane z typowego eksperymentu z 96 odwiertami i wygenerować profile obrazu. Użytkownicy mogą następnie wizualnie eksplorować swoje dane, przeprowadzać kontrolę jakości eksperymentu, zapewniać reakcję na perturbacje i sprawdzać odtwarzalność powtórzeń. Ułatwia to szybki cykl sprzężenia zwrotnego między analizą a eksperymentem, co ma kluczowe znaczenie podczas optymalizacji testu. Protokół ten jest przydatny nie tylko jako analiza pierwszego przejścia do kontroli jakości, ale może być również stosowany jako kompleksowe rozwiązanie, zwłaszcza do badań przesiewowych. Opisany tutaj przepływ pracy skaluje się do dużych zestawów danych, takich jak te generowane przez badania przesiewowe o wysokiej przepustowości, i wykazano, że dokładnie grupuje warunki eksperymentalne według fenotypu w szerokim zakresie systemów biologicznych. Interfejs PhenoBrowser zapewnia intuicyjną platformę do eksploracji przestrzeni fenotypowej i powiązania właściwości obrazu z adnotacjami biologicznymi. Podsumowując, opisany tutaj protokół obniży bariery w stosowaniu analizy ilościowej ekranów opartych na obrazie.
W ciągu ostatniej dekady, szybki postęp w technologii obrazowania dał wielu laboratoriom możliwość wykonywania mikroskopii o wysokiej przepustowości. Obecnie wyzwanie przeniosło się z obrazowania na wyzwanie związane z analizą. W jaki sposób możemy scharakteryzować, porównać i zbadać potok złożonych, ale subtelnych fenotypów generowanych przez typowy ekran obrazowania o wysokiej przepustowości?
Wiele platform do analizy obrazów i informatyki dało użytkownikom zaawansowane zestawy narzędzi1-3 do wydobywania informacji biologicznych z dużych zbiorów obrazów. Nadal jednak istnieje wiele istotnych przeszkód w analizie danych z wysokoprzepustowych ekranów opartych na obrazie. Trudności związane z doborem odpowiednich charakterystyk obrazów i dostrojeniem parametrów algorytmicznych (do interesującego nas systemu) często skutkują długim czasem konfiguracji, szczególnie dla użytkowników bez doświadczenia w analizie obrazu. W szczególności segmentacja komórek, czyli proces identyfikacji pojedynczych komórek na obrazie, jest głównym wąskim gardłem w tym zakresie. Segmentacja może być bardzo wrażliwa na parametry eksperymentalne, takie jak typ komórki, gęstość komórek i biomarkery, i często wymaga wielokrotnych korekt dla dużego zestawu danych. Z tych powodów analiza obrazu jest często niezależnym, końcowym etapem wykonywanym przez specjalistów, a nie integralną częścią eksperymentalnego przepływu pracy. Wyklucza to szybki cykl sprzężenia zwrotnego między analizą a eksperymentem, który jest kluczową częścią opracowywania testu.
Tutaj opisujemy alternatywny przepływ pracy, który jest zoptymalizowany pod kątem wysokoprzepustowej mikroskopii fluorescencyjnej i pozwala uniknąć wielu z wyżej wymienionych trudności. W tym celu korzystamy z PhenoRipper4, platformy oprogramowania typu open source do szybkiej eksploracji i analizy obrazów mikroskopowych. Co istotne, PhenoRipper pozwala uniknąć wielu wyzwań związanych z segmentacją komórek, nie próbując identyfikować pojedynczych komórek. Zamiast tego PhenoRipper dzieli obrazy na bloki pikseli o rozmiarze subkomórkowym i charakteryzuje obrazy pod względem zawartych w nich bloków. W szczególności PhenoRipper profiluje bloki pod względem funkcji opartych na kolokalizacji markerów i automatycznie identyfikuje4 najbardziej reprezentatywne typy bloków na obrazach treningowych. Następnie PhenoRipper przypisuje każdemu blokowi najbardziej podobny reprezentatywny typ bloku, a na koniec charakteryzuje obrazy na podstawie typów bloków, które zawierają.
W porównaniu do bardziej tradycyjnych podejść opartych na pojedynczych komórkach, to podejście wymaga minimalnego dostrajania i specjalistycznej wiedzy. W związku z tym użytkownicy muszą ustawić tylko dwa parametry: rozmiar bloku i intensywność progową (aby odrzucić niekomórkowe części obrazu), z których oba są ustawiane za pomocą graficznej informacji zwrotnej. Co ważne, opisany tutaj przepływ pracy został pokazany4 w celu łatwego skalowania do znacznie większych zestawów danych, gdzie szybkość i minimalne dostrajanie zapewniają duży przyrost czasu i niezawodności. W praktyce okazuje się, że takie podejście skraca czas wymagany zarówno do konfiguracji, jak i uruchomienia o wiele rzędów wielkości4.
Podstawowym wyjściem PhenoRipper jest wizualna reprezentacja podobieństwa obrazu, która umożliwia użytkownikowi zidentyfikowanie grup warunków eksperymentalnych, które powodują, że komórki wykazują podobne fenotypy. Grupowania, które odkrywa PhenoRipper, zazwyczaj mają porównywalną "biologiczną interpretowalność" do tych generowanych przez bardziej czasochłonne metody oparte na komórkach4. W praktyce oznacza to, że często, w ciągu pół godziny od przeprowadzenia typowego eksperymentu z 96-dołkową mikroskopią fluorescencyjną, eksperymentator bez wcześniejszego doświadczenia w analizie obrazu może uzyskać wiarygodny odczyt wydajności swojego eksperymentu. Eksperymentator może następnie rozpocząć badanie relacji między różnymi warunkami eksperymentalnymi i powiązać te relacje z fenotypami obrazu.
Pokazujemy ten przebieg pracy, analizując wpływ leków w różnych klasach mechanistycznych na komórki HeLa barwione na DNA i markery cytoszkieletu. Obrazy komórek leczonych tą samą klasą leków zostały zgrupowane razem, a obrazy o niskiej jakości (artefakty barwienia, komórki poza ostrością i tak dalej) pojawiły się jako wartości odstające, co ułatwiało ich identyfikację i potencjalne odrzucenie.
Chociaż ten przepływ pracy jest przydatny dla dużej liczby testów opartych na obrazach, istnieje oczywiście wiele sytuacji, w których inne podejście mogłoby być potencjalnie bardziej pouczające. Na przykład wynik projektu PhenoRipper to przede wszystkim względne porównanie wzorców fluorescencji w różnych warunkach eksperymentalnych. Gdyby zamiast tego wymagana była bezwzględna charakterystyka określonej cechy pojedynczej komórki (na przykład liczby plamek w komórce), wymagana byłaby analiza oparta na pojedynczej komórce. Niemniej jednak, nawet w tego typu sytuacji, PhenoRipper prawdopodobnie wykryje zmiany w tych fenotypach jednokomórkowych, a tym samym będzie użytecznym narzędziem do optymalizacji testów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
1. Przygotowanie próbek i obrazowanie
2. Analizowanie obrazów
Pobierz i zainstaluj PhenoRipper z phenoripper.org, a następnie uruchom PhenoRipper, aby rozpocząć analizę obrazów. PhenoRipper obecnie obsługuje formaty TIFF, PNG i JPEG oraz wszystkie inne formaty obsługiwane przez MATLAB (oprogramowanie mikroskopowe zazwyczaj obsługuje eksport do TIFF).
2.1 Ładowanie danych
2.2 Ustawianie parametrów analizy
Kliknij na "Ustaw parametry", aby zdefiniować parametry wymagane do przetworzenia zestawu danych. Parametry do zdefiniowania znajdują się w lewym panelu. W prawym panelu zostanie wyświetlona scalona próbka zestawu danych. Kliknij strzałki w lewo/w prawo, aby przełączać się między różnymi obrazami.
3. Eksplorowanie wyników
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
W niniejszym badaniu przetestowano zdolność tego przepływu pracy do grupowania leków na podstawie ich mechanizmu działania. Komórki HeLa wysiano do 30 studzienek płytki 384-dołkowej, a następnie zabarwiono na obecność DNA/aktyny/α-tubuliny. Specyficzne przeciwciała pierwotne, fluorescencyjnie znakowane przeciwciała wtórne oraz inne zastosowane barwniki fluorescencyjne wymieniono w Tabeli materiałów. Studzienki poddano działaniu 15 leków należących do trzech klas mechanistycznych (inhibitory deacetylazy histonowej, leki c...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Opisany tutaj przebieg pracy umożliwia szybką i łatwą charakteryzację i porównywanie obrazów mikroskopowych. Najpierw pokazaliśmy, w jaki sposób ten przepływ pracy może pomóc w optymalizacji eksperymentów, na przykład poprzez szybkie przeprowadzanie kontroli jakości obrazów mikroskopowych. Następnie wykazaliśmy jego potencjał w zakresie analizy danych z wysokoprzepustowych badań przesiewowych: byliśmy w stanie pogrupować leki na podstawie ich mechanizmu działania. Grupowanie leków było porównywalne do tego, które stwierd...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Dziękujemy Adamowi Costerowi i wszystkim innym członkom laboratoriów Altschuler i Wu za pomocne opinie i dyskusje. Badania te były wspierane przez National Institute of Health granty R01 GM085442 i CA133253 (S.J.A.), R01 GM081549 (L.F.W.), CPRIT RP10900 (L.F.W) oraz Welch Foundation I-1619 (S.J.A.) i I-1644 (L.F.W.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM, Wysoka zawartość glukozy | Invitrogen | 11965 | Wysoka glukoza, marker L-glutaminy |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Barwienie DNA, rozcieńczenie 1:2,000 5 mg / ml zapasu |
| Marker falloidyna-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Sprzężona fallotoksyna, rozcieńczenie 1:200 |
| Przeciwciało pierwotne &alfa;-tubulina | Sigma | T9026 | Pierwotne Ab, mysz monoklonalne, rozcieńczenie 1:200 |
| Wtórne Antivody anty-mysie TRITC | Jackson | 115-025-166 | Sprzężone wtórne Ab, 0,5 mg w 1 ml PBS + 1 ml glicerolu |
| aldosteronu | : 0,2 μ M | ||
| Zastosowane stężenie apicydyny | : 20 μ M | ||
| kolchicyny | : 0,16 μ M | ||
| kortyzolu | : 0,2 μ M | ||
| stężenie deksametazonu | : 0,2 μ M | ||
| docetakselu | : 0,2 μ Zastosowane stężenie M | ||
| M344 | : 20 μ Zastosowane stężenie M | ||
| MS-275 | : 5 μ M | ||
| Stężenie zastosowanego nokodazolu | : 0,3 μ M | ||
| prednizolonu | : 0,2 μ Zastosowane stężenie M | ||
| RU486 | : 0,2 μ M | ||
| Użyte stężenie Scriptaid | : 70 μ M | ||
| Zastosowane stężenie taksolu | : 0,3 μ Stosowane stężenie | ||
| M trichostatyny A | : 0,2 μ M | ||
| winorelbiny | : 0,3 μ M |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.