Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej

Podsumowanie

Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.

Streszczenie

Pomimo szybkiego postępu w mikroskopii wysokoprzepustowej, ilościowe testy oparte na obrazach nadal stanowią poważne wyzwanie. Chociaż dostępnych jest wiele specjalistycznych narzędzi do analizy obrazu, większość tradycyjnych procesów pracy opartych na analizie obrazów ma strome krzywe uczenia się (w celu precyzyjnego dostrojenia parametrów analizy) i skutkuje długimi czasami realizacji między obrazowaniem a analizą. W szczególności segmentacja komórek, czyli proces identyfikacji pojedynczych komórek na obrazie, jest głównym wąskim gardłem w tym zakresie.

Tutaj prezentujemy alternatywny, wolny od segmentacji komórek przepływ pracy oparty na PhenoRipper, platformie oprogramowania open source przeznaczonej do szybkiej analizy i eksploracji obrazów mikroskopowych. Przedstawiony tutaj potok jest zoptymalizowany pod kątem obrazów mikroskopii immunofluorescencyjnej kultur komórkowych i wymaga minimalnej interwencji użytkownika. W ciągu pół godziny PhenoRipper może przeanalizować dane z typowego eksperymentu z 96 odwiertami i wygenerować profile obrazu. Użytkownicy mogą następnie wizualnie eksplorować swoje dane, przeprowadzać kontrolę jakości eksperymentu, zapewniać reakcję na perturbacje i sprawdzać odtwarzalność powtórzeń. Ułatwia to szybki cykl sprzężenia zwrotnego między analizą a eksperymentem, co ma kluczowe znaczenie podczas optymalizacji testu. Protokół ten jest przydatny nie tylko jako analiza pierwszego przejścia do kontroli jakości, ale może być również stosowany jako kompleksowe rozwiązanie, zwłaszcza do badań przesiewowych. Opisany tutaj przepływ pracy skaluje się do dużych zestawów danych, takich jak te generowane przez badania przesiewowe o wysokiej przepustowości, i wykazano, że dokładnie grupuje warunki eksperymentalne według fenotypu w szerokim zakresie systemów biologicznych. Interfejs PhenoBrowser zapewnia intuicyjną platformę do eksploracji przestrzeni fenotypowej i powiązania właściwości obrazu z adnotacjami biologicznymi. Podsumowując, opisany tutaj protokół obniży bariery w stosowaniu analizy ilościowej ekranów opartych na obrazie.

Wprowadzenie

W ciągu ostatniej dekady, szybki postęp w technologii obrazowania dał wielu laboratoriom możliwość wykonywania mikroskopii o wysokiej przepustowości. Obecnie wyzwanie przeniosło się z obrazowania na wyzwanie związane z analizą. W jaki sposób możemy scharakteryzować, porównać i zbadać potok złożonych, ale subtelnych fenotypów generowanych przez typowy ekran obrazowania o wysokiej przepustowości?

Wiele platform do analizy obrazów i informatyki dało użytkownikom zaawansowane zestawy narzędzi^1-3 do wydobywania informacji biologicznych z dużych zbiorów obrazów. Nadal jednak istnieje wiele istotnych przeszkód w analizie danych z wysoko....

Protokół

1. Przygotowanie próbek i obrazowanie

1. Hodowla komórkowa
   1. Rutynowo dziel kultury i utrzymuj zbieżność na poziomie 20-70%. Na dzień przed eksperymentem hoduj komórki HeLa w DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, patrz Tabela Materiałów) i uzupełnione 10% FBS (Płodowa Surowica Bydlęca) i 1x penicylina/streptomycyna.
   2. W dniu eksperymentu rozszczepione komórki rosnące w kulturze (około 50% zlewających się).
   3. Umyj komórki PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), wystawić na działanie około 2 ml trypsyny/EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) przez kilka sekund. Odessać nadmiar trypsyny/EDTA i utrzymywać komórki skąpane w ....

Wyniki

W niniejszym badaniu przetestowano zdolność tego przepływu pracy do grupowania leków na podstawie ich mechanizmu działania. Komórki HeLa wysiano do 30 studzienek płytki 384-dołkowej, a następnie zabarwiono na obecność DNA/aktyny/α-tubuliny. Specyficzne przeciwciała pierwotne, fluorescencyjnie znakowane przeciwciała wtórne oraz inne zastosowane barwniki fluorescencyjne wymieniono w Tabeli materiałów. Studzienki poddano działaniu 15 leków należących do trzech klas mechanistycznych (inhibitory deacetylazy histonowej, leki c.......

Dyskusja

Opisany tutaj przebieg pracy umożliwia szybką i łatwą charakteryzację i porównywanie obrazów mikroskopowych. Najpierw pokazaliśmy, w jaki sposób ten przepływ pracy może pomóc w optymalizacji eksperymentów, na przykład poprzez szybkie przeprowadzanie kontroli jakości obrazów mikroskopowych. Następnie wykazaliśmy jego potencjał w zakresie analizy danych z wysokoprzepustowych badań przesiewowych: byliśmy w stanie pogrupować leki na podstawie ich mechanizmu działania. Grupowanie leków było porównywalne do tego, które stwierd.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM, Wysoka zawartość glukozy	Invitrogen	11965	Wysoka glukoza, marker L-glutaminy
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	Barwienie DNA, rozcieńczenie 1:2,000 5 mg / ml zapasu
Marker falloidyna-Alexa Fluor 488	Invitrogen	A12379	Sprzężona fallotoksyna, rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało pierwotne &alfa;-tubulina	Sigma	T9026	Pierwotne Ab, mysz monoklonalne, rozcieńczenie 1:200
Wtórne Antivody anty-mysie TRITC	Jackson	115-025-166	Sprzężone wtórne Ab, 0,5 mg w 1 ml PBS + 1 ml glicerolu
aldosteronu			: 0,2 μ M
Zastosowane stężenie apicydyny			: 20 μ M
kolchicyny			: 0,16 μ M
kortyzolu			: 0,2 μ M
stężenie deksametazonu			: 0,2 μ M
docetakselu			: 0,2 μ Zastosowane stężenie M
M344			: 20 μ Zastosowane stężenie M
MS-275			: 5 μ M
Stężenie zastosowanego nokodazolu			: 0,3 μ M
prednizolonu			: 0,2 μ Zastosowane stężenie M
RU486			: 0,2 μ M
Użyte stężenie Scriptaid			: 70 μ M
Zastosowane stężenie taksolu			: 0,3 μ Stosowane stężenie
M trichostatyny A			: 0,2 μ M
winorelbiny			: 0,3 μ M

StężenieZastosowane stężenieZastosowane stężenieZastosowaneZastosowane stężenieZastosowane stężenieStężenie