Tutaj opisujemy proces szybkiej analizy i eksploracji zbiorów obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą PhenoRipper, niedawno opracowanej platformy do analizy obrazów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybka analiza i eksploracja obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pomimo szybkiego postępu w mikroskopii wysokoprzepustowej, ilościowe testy oparte na obrazach nadal stanowią poważne wyzwanie. Chociaż dostępnych jest wiele specjalistycznych narzędzi do analizy obrazu, większość tradycyjnych procesów pracy opartych na analizie obrazów ma strome krzywe uczenia się (w celu precyzyjnego dostrojenia parametrów analizy) i skutkuje długimi czasami realizacji między obrazowaniem a analizą. W szczególności segmentacja komórek, czyli proces identyfikacji pojedynczych komórek na obrazie, jest głównym wąskim gardłem w tym zakresie.
Tutaj prezentujemy alternatywny, wolny od segmentacji komórek przepływ pracy oparty na PhenoRipper, platformie oprogramowania open source przeznaczonej do szybkiej analizy i eksploracji obrazów mikroskopowych. Przedstawiony tutaj potok jest zoptymalizowany pod kątem obrazów mikroskopii immunofluorescencyjnej kultur komórkowych i wymaga minimalnej interwencji użytkownika. W ciągu pół godziny PhenoRipper może przeanalizować dane z typowego eksperymentu z 96 odwiertami i wygenerować profile obrazu. Użytkownicy mogą następnie wizualnie eksplorować swoje dane, przeprowadzać kontrolę jakości eksperymentu, zapewniać reakcję na perturbacje i sprawdzać odtwarzalność powtórzeń. Ułatwia to szybki cykl sprzężenia zwrotnego między analizą a eksperymentem, co ma kluczowe znaczenie podczas optymalizacji testu. Protokół ten jest przydatny nie tylko jako analiza pierwszego przejścia do kontroli jakości, ale może być również stosowany jako kompleksowe rozwiązanie, zwłaszcza do badań przesiewowych. Opisany tutaj przepływ pracy skaluje się do dużych zestawów danych, takich jak te generowane przez badania przesiewowe o wysokiej przepustowości, i wykazano, że dokładnie grupuje warunki eksperymentalne według fenotypu w szerokim zakresie systemów biologicznych. Interfejs PhenoBrowser zapewnia intuicyjną platformę do eksploracji przestrzeni fenotypowej i powiązania właściwości obrazu z adnotacjami biologicznymi. Podsumowując, opisany tutaj protokół obniży bariery w stosowaniu analizy ilościowej ekranów opartych na obrazie.
Wprowadzenie
W ciągu ostatniej dekady, szybki postęp w technologii obrazowania dał wielu laboratoriom możliwość wykonywania mikroskopii o wysokiej przepustowości. Obecnie wyzwanie przeniosło się z obrazowania na wyzwanie związane z analizą. W jaki sposób możemy scharakteryzować, porównać i zbadać potok złożonych, ale subtelnych fenotypów generowanych przez typowy ekran obrazowania o wysokiej przepustowości?
Wiele platform do analizy obrazów i informatyki dało użytkownikom zaawansowane zestawy narzędzi1-3 do wydobywania informacji biologicznych z dużych zbiorów obrazów. Nadal jednak istnieje wiele istotnych przeszkód w analizie danych z wysokoprzepustowych ekranów opartych na obrazie. Trudności związane z doborem odpowiednich charakterystyk obrazów i dostrojeniem parametrów algorytmicznych (do interesującego nas systemu) często skutkują długim czasem konfiguracji, szczególnie dla użytkowników bez doświadczenia w analizie obrazu. W szczególności segmentacja komórek, czyli proces identyfikacji pojedynczych komórek na obrazie, jest głównym wąskim gardłem w tym zakresie. Segmentacja może być bardzo wrażliwa na parametry eksperymentalne, takie jak typ komórki, gęstość komórek i biomarkery, i często wymaga wielokrotnych korekt dla dużego zestawu danych. Z tych powodów analiza obrazu jest często niezależnym, końcowym etapem wykonywanym przez specjalistów, a nie integralną częścią eksperymentalnego przepływu pracy. Wyklucza to szybki cykl sprzężenia zwrotnego między analizą a eksperymentem, który jest kluczową częścią opracowywania testu.
Tutaj opisujemy alternatywny przepływ pracy, który jest zoptymalizowany pod kątem wysokoprzepustowej mikroskopii fluorescencyjnej i pozwala uniknąć wielu z wyżej wymienionych trudności. W tym celu korzystamy z PhenoRipper4, platformy oprogramowania typu open source do szybkiej eksploracji i analizy obrazów mikroskopowych. Co istotne, PhenoRipper pozwala uniknąć wielu wyzwań związanych z segmentacją komórek, nie próbując identyfikować pojedynczych komórek. Zamiast tego PhenoRipper dzieli obrazy na bloki pikseli o rozmiarze subkomórkowym i charakteryzuje obrazy pod względem zawartych w nich bloków. W szczególności PhenoRipper profiluje bloki pod względem funkcji opartych na kolokalizacji markerów i automatycznie identyfikuje4 najbardziej reprezentatywne typy bloków na obrazach treningowych. Następnie PhenoRipper przypisuje każdemu blokowi najbardziej podobny reprezentatywny typ bloku, a na koniec charakteryzuje obrazy na podstawie typów bloków, które zawierają.
W porównaniu do bardziej tradycyjnych podejść opartych na pojedynczych komórkach, to podejście wymaga minimalnego dostrajania i specjalistycznej wiedzy. W związku z tym użytkownicy muszą ustawić tylko dwa parametry: rozmiar bloku i intensywność progową (aby odrzucić niekomórkowe części obrazu), z których oba są ustawiane za pomocą graficznej informacji zwrotnej. Co ważne, opisany tutaj przepływ pracy został pokazany4 w celu łatwego skalowania do znacznie większych zestawów danych, gdzie szybkość i minimalne dostrajanie zapewniają duży przyrost czasu i niezawodności. W praktyce okazuje się, że takie podejście skraca czas wymagany zarówno do konfiguracji, jak i uruchomienia o wiele rzędów wielkości4.
Podstawowym wyjściem PhenoRipper jest wizualna reprezentacja podobieństwa obrazu, która umożliwia użytkownikowi zidentyfikowanie grup warunków eksperymentalnych, które powodują, że komórki wykazują podobne fenotypy. Grupowania, które odkrywa PhenoRipper, zazwyczaj mają porównywalną "biologiczną interpretowalność" do tych generowanych przez bardziej czasochłonne metody oparte na komórkach4. W praktyce oznacza to, że często, w ciągu pół godziny od przeprowadzenia typowego eksperymentu z 96-dołkową mikroskopią fluorescencyjną, eksperymentator bez wcześniejszego doświadczenia w analizie obrazu może uzyskać wiarygodny odczyt wydajności swojego eksperymentu. Eksperymentator może następnie rozpocząć badanie relacji między różnymi warunkami eksperymentalnymi i powiązać te relacje z fenotypami obrazu.
Pokazujemy ten przebieg pracy, analizując wpływ leków w różnych klasach mechanistycznych na komórki HeLa barwione na DNA i markery cytoszkieletu. Obrazy komórek leczonych tą samą klasą leków zostały zgrupowane razem, a obrazy o niskiej jakości (artefakty barwienia, komórki poza ostrością i tak dalej) pojawiły się jako wartości odstające, co ułatwiało ich identyfikację i potencjalne odrzucenie.
Chociaż ten przepływ pracy jest przydatny dla dużej liczby testów opartych na obrazach, istnieje oczywiście wiele sytuacji, w których inne podejście mogłoby być potencjalnie bardziej pouczające. Na przykład wynik projektu PhenoRipper to przede wszystkim względne porównanie wzorców fluorescencji w różnych warunkach eksperymentalnych. Gdyby zamiast tego wymagana była bezwzględna charakterystyka określonej cechy pojedynczej komórki (na przykład liczby plamek w komórce), wymagana byłaby analiza oparta na pojedynczej komórce. Niemniej jednak, nawet w tego typu sytuacji, PhenoRipper prawdopodobnie wykryje zmiany w tych fenotypach jednokomórkowych, a tym samym będzie użytecznym narzędziem do optymalizacji testów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie próbek i obrazowanie
- Hodowla komórkowa
- Rutynowo dziel kultury i utrzymuj zbieżność na poziomie 20-70%. Na dzień przed eksperymentem hoduj komórki HeLa w DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, patrz Tabela Materiałów) i uzupełnione 10% FBS (Płodowa Surowica Bydlęca) i 1x penicylina/streptomycyna.
- W dniu eksperymentu rozszczepione komórki rosnące w kulturze (około 50% zlewających się).
- Umyj komórki PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), wystawić na działanie około 2 ml trypsyny/EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego) przez kilka sekund. Odessać nadmiar trypsyny/EDTA i utrzymywać komórki skąpane w cienkiej warstwie trypsyny/EDTA w kapturze przy temperaturze pokojowej przez ~3 min.
- Dwukrotnie wstrząsnąć mechanicznie kolbami i odłączyć komórki za pomocą pożywki z dodatkiem surowicy. Policz komórki i rozcieńcz do 5 000 komórek/50 μl pożywki i natychmiast nałóż 50 μl/dołek na 384-dołkową szklaną płytkę dolną za pomocą automatycznego robota do obsługi cieczy (tutaj używa się tylko 30 dołków płytki).
- Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zminimalizować efekty krawędzi w studzienkach5. Po inkubacji RT umieścić na noc płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
- Każdy lek zostanie oceniony w dwóch egzemplarzach. Dodać 25 μl leku do odpowiednich studzienek na płytce już zawierającej pożywkę.
- Utrwalić płytkę z 4% roztworem paraformaldehydu w PBS po 24 godzinach od leczenia farmakologicznego.
- Barwienie
Specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie i inne barwniki fluorescencyjne, które zostały tutaj użyte, są wymienione w Tabeli materiałów.- Utrwalone komórki przepuszczać 0,2% roztworem Triton X-100 w TBS (sola fizjologiczna buforowana przez Tris) przez 3 minuty i przemywać TBST (sól fizjologiczna buforowana Tris + Tween 20) 3x. Dodać 5% roztwór BSA (albuminy surowicy bydlęcej) w TBST w celu zablokowania.
- Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie przemyć TBST 3x.
- Wykonać pierwszorzędowe rozcieńczenia przeciwciał w 5% BSA w TBST (patrz tabela materiałów) i dodać 10 μl/basenik. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie przemyć 3x TBST.
- Wykonać wtórne rozcieńczenie przeciwciał w 5% BSA w TBST (patrz tabela materiałów) i dodać 10 μl/basenik.
- Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie dwukrotnie przemyć TBST.
- Przygotować rozcieńczenia dla Hoechst i falloidyny (patrz Tabela Materiałów) w PBS i dodać 10 μl/basenik.
- Inkubować płytkę w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Po 2 praniach TBST przykryć płyty folią i przechowywać w temperaturze 4 °C O/N.
- Obrazowanie
Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy użyciu obiektywu 20X z binowaniem kamery 1x1. Uzyskaj szesnaście obrazów dla każdej studzienki, co daje w sumie 480 obrazów (x3 kanały).
2. Analizowanie obrazów
Pobierz i zainstaluj PhenoRipper z phenoripper.org, a następnie uruchom PhenoRipper, aby rozpocząć analizę obrazów. PhenoRipper obecnie obsługuje formaty TIFF, PNG i JPEG oraz wszystkie inne formaty obsługiwane przez MATLAB (oprogramowanie mikroskopowe zazwyczaj obsługuje eksport do TIFF).
2.1 Ładowanie danych
- Nie istnieje standardowa konwencja nazewnictwa/organizacji obrazów mikroskopowych, co może sprawić, że ładowanie obrazów i kojarzenie metadanych (tj. adnotacji eksperymentalnych, takich jak rodzaj zabiegu, numer studzienki itp.) będzie najtrudniejszą częścią przepływu pracy. Wybierz jedną z przedstawionych metod (opisaną poniżej).
- PhenoLoader: Wybierz tę opcję, aby półautomatycznie wczytywać dane, gdy nazwa pliku i/lub struktura katalogów zawierają wystarczającą ilość informacji, aby pogrupować obrazy zgodnie z potrzebami (np. B16\HeLa_Drug5-DAPI.png może wskazywać, że obraz pochodzi ze studni B16, komórki są traktowane lekiem o ID wynosi 5, a obraz przechwytuje jądrową plamę DAPI - z tą konwencją nazewnictwa, wszystkie obrazy ze studni A1 lub leczone lekiem 5 można łatwo pogrupować). Kreator poprowadzi użytkownika krok po kroku, aby skojarzyć metadane z grupami obrazów i zdefiniować znaczniki w następujący sposób:
- Kliknij "Struktura plików", aby uzyskać dostęp do okna PhenoLoader.
- Kliknij "Zdefiniuj katalog główny", aby wybrać katalog zawierający zestaw danych obrazu. Następnie przefiltruj pliki, które nie są używane (Nieużywane pliki) do analizy (opcjonalnie, można pozostawić puste).
- Kliknij "Zdefiniuj markery", aby określić biomarkery użyte w eksperymencie i powiązać je z obrazami. W szczególności kliknij plik obrazu, a następnie wybierz część nazwy pliku, która jednoznacznie identyfikuje biomarkery. Na koniec wprowadź nazwę każdego biomarkera.
- Kliknij "Zdefiniuj metadane", aby powiązać informacje z każdym obrazem. W szczególności kliknij plik obrazu, a następnie wybierz część nazwy pliku identyfikującą informacje o obrazie (np. "B16" dla nazwy studni). Pojawi się okno z prośbą o nazwę grupy (np. "Cóż"), wprowadź nazwę. Członkowie grupy wyodrębnieni z nazwy pliku zostaną wyświetleni w tabeli grup (np. pełna lista nazw studni). Aby dodać dodatkowe informacje, których nie ma w nazwie pliku, kliknij przycisk "(opcjonalnie) Dalej". Kliknij "Dodaj grupę metadanych", wprowadź dodatkową nazwę grupy (np. "Lek") i dla każdej wartości predefiniowanej grupy (np. "Well") wprowadź jej wartość (np. "Taxol"). Nie ma ograniczeń co do liczby dodatkowych grup, które można dodać.
- Na koniec kliknij "Utwórz plik metadanych", aby wygenerować plik metadanych i kontynuować analizę. Jeśli plik metadanych został wcześniej wygenerowany, powyższych kroków można uniknąć, ładując plik bezpośrednio za pomocą opcji "Plik metadanych" (opisanej w punkcie 3 poniżej).
- Szablony oparte na wyrażeniach regularnych: Wyrażenia regularne są standardowym podejściem do dopasowywania wzorców w tekście. Wybierz tę opcję, jeśli nazwa pliku i/lub struktura katalogów zawierają wystarczającą ilość informacji do grupowania obrazów, a konwencja nazewnictwa jest zgodna z jednym z wcześniej istniejących szablonów. Szablony niestandardowe oparte na wyrażeniach regularnych mogą być również definiowane ręcznie i ponownie wykorzystywane. Ta opcja zaawansowana jest zalecana tylko dla użytkowników zaznajomionych z wyrażeniami regularnymi.
- Plik metadanych: Wybierz tę opcję, aby uzyskać maksymalne możliwości dostosowywania. Zdefiniuj i załaduj plik z wartościami rozdzielanymi przecinkami (CSV) zawierający nazwy plików i metadane skojarzone z każdym obrazem. Przykładowy format pliku jest dostępny w części do pobrania na stronie internetowej (phenoripper.org). Wystarczy załadować plik przez interfejs, aby wyświetlić zawarte w nim informacje.
- PhenoLoader: Wybierz tę opcję, aby półautomatycznie wczytywać dane, gdy nazwa pliku i/lub struktura katalogów zawierają wystarczającą ilość informacji, aby pogrupować obrazy zgodnie z potrzebami (np. B16\HeLa_Drug5-DAPI.png może wskazywać, że obraz pochodzi ze studni B16, komórki są traktowane lekiem o ID wynosi 5, a obraz przechwytuje jądrową plamę DAPI - z tą konwencją nazewnictwa, wszystkie obrazy ze studni A1 lub leczone lekiem 5 można łatwo pogrupować). Kreator poprowadzi użytkownika krok po kroku, aby skojarzyć metadane z grupami obrazów i zdefiniować znaczniki w następujący sposób:
- Wybierz pole metadanych, które definiuje repliki w eksperymencie, aby uniknąć nadmiarowego próbkowania. W przypadku zestawów danych, które zawierają powtórzenia (np. wszystkie obrazy w studni powinny być podobne), grupowanie ich razem (np. według studni) może poprawić wydajność. W większości przypadków rozsądne jest wybranie domyślnej opcji "Losowy (nie wiem)", która wybiera losowy podzbiór.
2.2 Ustawianie parametrów analizy
Kliknij na "Ustaw parametry", aby zdefiniować parametry wymagane do przetworzenia zestawu danych. Parametry do zdefiniowania znajdują się w lewym panelu. W prawym panelu zostanie wyświetlona scalona próbka zestawu danych. Kliknij strzałki w lewo/w prawo, aby przełączać się między różnymi obrazami.
- Intensywność progowa: Wybierz odpowiednią wartość progową, aby z grubsza zidentyfikować części komórkowe (a nie tło, obszary niekomórkowe) obrazów. Próg jest wstępnie obliczany przez PhenoRipper, ale można go dostosować, aby poprawić podświetlanie regionów komórkowych za pomocą paska przewijania dostępnego na górze obrazu. Jeśli wybrany próg nie działa na wszystkich obrazach, obniż próg, aby uwzględnić regiony niekomórkowe, a nie pominąć regiony komórkowe.
- Rozmiar bloku: Wybierz odpowiedni rozmiar bloku (w pikselach), aby utworzyć siatkę obrazu. Bloki o określonym rozmiarze zostaną nałożone na obraz. Dostosuj rozmiar bloku, aby uzyskać średnio 20-30 bloków/komórkę. Aby nałożyć siatkę na obraz, kliknij pole wyboru przed polem "Rozmiar bloku".
- Parametry opcjonalne: Jeśli automatycznie skalowane obrazy nie wyświetlają znaczników o pożądanej intensywności względnej (np. jeden kolor jest nasycony) lub jeśli znaczniki muszą zostać usunięte z analizy, użyj opcji "Dostosuj intensywność kanału". Aby zidentyfikować regiony komórkowe w podzbiorze znaczników, użyj opcji "Kanały używane dla progu". Domyślne wybory innych parametrów są zwykle wystarczające, ale w razie potrzeby dostosuj je za pomocą "Zaawansowanych opcji analizy".
- Uruchom analizę, naciskając "PhenoRip" na głównym panelu aplikacji. PhenoRipper automatycznie zidentyfikuje powtarzające się typy bloków na obrazach. Profile fenotypowe zostaną wygenerowane dla każdego obrazu na podstawie frakcji różnych typów bloków w nim zawartych.
3. Eksplorowanie wyników
- Zbadaj relacje między profilami fenotypowymi obrazów za pomocą przeglądarki PhenoBrowser (Rysunek 1). Interfejs PhenoBrowser składa się z czterech paneli: lewy górny panel jest graficzną reprezentacją (wykres punktowy) względnego podobieństwa między różnymi obrazami/warunkami, dwa panele po prawej stronie wyświetlają przykładowe obrazy wybranych warunków, a ostatni panel (wykres słupkowy) porównuje ich profile fenotypowe.
- "Odrzuć puste ramki" za pomocą menu "Przetwarzanie danych".
- Usuń obrazy o niskiej jakości: Po pierwsze, aby przestudiować pojedyncze obrazy, wyłącz grupowanie w menu "Przetwarzanie danych". Następnie klikaj punkty odstające na wykresie punktowym i odrzucaj obrazy o niskiej jakości (np. nieostre, plamiące artefakty).
- Eksplorowanie danych: Zdecyduj, które pole metadanych definiuje podstawową jednostkę porównania (np. aby porównać leki, obrazy o tej samej wartości pola metadanych "lek" muszą być zgrupowane razem). Zwiń wszystkie obrazy o tej samej wartości tego pola metadanych do jednego punktu danych za pomocą opcji "Grupuj według". Na przykład grupowanie według leku spowoduje uśrednienie obrazów w każdym leku, aby uzyskać jeden punkt dla każdego leku. Pobliskie (lub odległe) punkty na wykresie punktowym odzwierciedlają warunki, które wywołują podobne (lub różne) fenotypy komórkowe. Punkty koloru lub etykiety (menu wyświetlania danych) na podstawie dostępnych metadanych, aby ułatwić interpretację. Wykres 3D można obracać, klikając pole wyboru "obracany" oraz klikając lewy przycisk i przeciągając nad nim myszką.
- Wybierz dwa różne punkty, aby porównać je bezpośrednio. Panele obrazów będą wyświetlać przykładowe obrazy dla każdego punktu, a panel wykresu słupkowego będzie pokazywał typy bloków, których częstość występowania jest najbardziej różna między tymi dwoma punktami.
- Uruchom clustergram z menu "Clustergram", aby zapewnić bardziej globalny widok relacji między typami bloków a warunkami eksperymentalnymi. Grupując zarówno typy bloków, jak i warunki, reprezentacja ta podkreśla fenotypy komórkowe, które najlepiej odróżniają grupy schorzeń (ryc. 5).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym badaniu przetestowano zdolność tego przepływu pracy do grupowania leków na podstawie ich mechanizmu działania. Komórki HeLa wysiano do 30 studzienek płytki 384-dołkowej, a następnie zabarwiono na obecność DNA/aktyny/α-tubuliny. Specyficzne przeciwciała pierwotne, fluorescencyjnie znakowane przeciwciała wtórne oraz inne zastosowane barwniki fluorescencyjne wymieniono w Tabeli materiałów. Studzienki poddano działaniu 15 leków należących do trzech klas mechanistycznych (inhibitory deacetylazy histonowej, leki c...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj przebieg pracy umożliwia szybką i łatwą charakteryzację i porównywanie obrazów mikroskopowych. Najpierw pokazaliśmy, w jaki sposób ten przepływ pracy może pomóc w optymalizacji eksperymentów, na przykład poprzez szybkie przeprowadzanie kontroli jakości obrazów mikroskopowych. Następnie wykazaliśmy jego potencjał w zakresie analizy danych z wysokoprzepustowych badań przesiewowych: byliśmy w stanie pogrupować leki na podstawie ich mechanizmu działania. Grupowanie leków było porównywalne do tego, które stwierd...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Adamowi Costerowi i wszystkim innym członkom laboratoriów Altschuler i Wu za pomocne opinie i dyskusje. Badania te były wspierane przez National Institute of Health granty R01 GM085442 i CA133253 (S.J.A.), R01 GM081549 (L.F.W.), CPRIT RP10900 (L.F.W) oraz Welch Foundation I-1619 (S.J.A.) i I-1644 (L.F.W.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DMEM, Wysoka zawartość glukozy | Invitrogen | 11965 | Wysoka glukoza, marker L-glutaminy |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Barwienie DNA, rozcieńczenie 1:2,000 5 mg / ml zapasu |
| Marker falloidyna-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Sprzężona fallotoksyna, rozcieńczenie 1:200 |
| Przeciwciało pierwotne &alfa;-tubulina | Sigma | T9026 | Pierwotne Ab, mysz monoklonalne, rozcieńczenie 1:200 |
| Wtórne Antivody anty-mysie TRITC | Jackson | 115-025-166 | Sprzężone wtórne Ab, 0,5 mg w 1 ml PBS + 1 ml glicerolu |
| aldosteronu | : 0,2 μ M | ||
| Zastosowane stężenie apicydyny | : 20 μ M | ||
| kolchicyny | : 0,16 μ M | ||
| kortyzolu | : 0,2 μ M | ||
| stężenie deksametazonu | : 0,2 μ M | ||
| docetakselu | : 0,2 μ Zastosowane stężenie M | ||
| M344 | : 20 μ Zastosowane stężenie M | ||
| MS-275 | : 5 μ M | ||
| Stężenie zastosowanego nokodazolu | : 0,3 μ M | ||
| prednizolonu | : 0,2 μ Zastosowane stężenie M | ||
| RU486 | : 0,2 μ M | ||
| Użyte stężenie Scriptaid | : 70 μ M | ||
| Zastosowane stężenie taksolu | : 0,3 μ Stosowane stężenie | ||
| M trichostatyny A | : 0,2 μ M | ||
| winorelbiny | : 0,3 μ M |
Bibliografia
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm - an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13(2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94(2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. IEEE Int. Symp. Biomed. Imag. Macro Nano, 2004 Apr 15-18, 2, 1139-1142 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
