Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Podsumowanie

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Streszczenie

Badanie mechanizmów molekularnych związanych ze stanami neuropatologicznymi, takimi jak udar niedokrwienny, może być trudne przy użyciu całych układów zwierzęcych. W związku z tym powszechnie stosuje się pierwotne lub "neuronalne" systemy hodowli komórek. Chociaż systemy te są stosunkowo łatwe w obsłudze i są użytecznymi systemami modelowymi, w których różne wyniki funkcjonalne (takie jak śmierć komórki) można łatwo określić ilościowo, badane wyniki i szlaki w hodowanych niedojrzałych neuronach (takie jak szlaki śmierci komórki zależne od ekscytotoksyczności) niekoniecznie są takie same, jak te obserwowane w dojrzałym mózgu lub w nienaruszonej tkance. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania modeli, w których można by badać mechanizmy komórkowe w dojrzałej tkance nerwowej. Opracowaliśmy technikę in vitro, która może być wykorzystana do badania różnych szlaków molekularnych w nienaruszonej tkance nerwowej. Opisana tutaj technika wykorzystuje tkankę korową szczura, ale technikę tę można dostosować do wykorzystania tkanek różnych gatunków (takich jak mysz, królik, świnka morska i kurczak) lub regionów mózgu (na przykład hipokamp, prążkowie itp.). Dodatkowo można zastosować różne stymulacje/zabiegi (na przykład ekscytotoksyczne, podawanie inhibitorów itp.). Podsumowując, opisany tutaj model wycinka mózgu może być wykorzystany do zbadania różnych mechanizmów molekularnych zaangażowanych w uszkodzenie mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności.

Wprowadzenie

Najczęstszą formą udaru jest udar niedokrwienny, który występuje, gdy mózgowe naczynie krwionośne zostaje zablokowane. Niedokrwienie tkanek, które wynika z ustania przepływu krwi, powoduje rozległą depolaryzację błon, uwalnianie neuroprzekaźników pobudzających i utrzymujący się wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia, co prowadzi do aktywacji szlaków śmierci komórki ¹. Proces ten został nazwany "ekscytotoksycznością" i jest powszechnym szlakiem zaangażowanym w śmierć neuronów wytwarzaną przez różne patologie, w tym udar ². Hamowanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w ekscytotoksyczność i inne kaskady śmierci komórek neuronalnych jest atrakcyjnym podejściem do ograniczania uszkodzeń neuronów po udarze.

Identyfikacja precyzyjnych mechanizmów molekularnych związanych z ekscytotoksycznością i udarem niedokrwiennym może być trudna przy użyciu całych układów zwierzęcych. W związku z tym często stosuje się pierwotne embrionalne i "neuronopodobne" (np. unieśmiertelnione linie nerwiaka zarodkowego i gruczolakoraka) systemy hodowli komórek. Głównymi zaletami tych modeli jest to, że są łatwe w obsłudze, stosunkowo opłacalne, a śmierć komórek można łatwo zmierzyć i określić ilościowo. Jednak szlaki sygnałowe mogą być zmieniane przez zastosowane warunki hodowli ^3,4, a niedojrzałe neurony i nieśmiertelne linie mogą wyrażać różne receptory i cząsteczki sygnałowe w porównaniu z dojrzałym mózgiem ^5-8. Co więcej, hodowane neurony pozwalają na badanie tylko jednego typu komórek (lub dwóch, jeśli stosuje się system kokultury), podczas gdy nienaruszona tkanka mózgowa jest niejednorodna, zawierająca różne typy komórek, które oddziałują ze sobą. Stosowane są również organotypowe systemy hodowli warstw (cienkie eksplantaty tkanki mózgowej), a modele te umożliwiają badanie heterogenicznych populacji komórek występujących in vivo. Jednak przy użyciu tej techniki można uzyskać tylko ograniczoną ilość tkanki z każdego zwierzęcia, plastry nie mogą być hodowane tak długo, jak unieśmiertelnione linie komórkowe, a hodowla średnio- i długoterminowa może powodować zmiany w szlakach sygnałowych i receptorach w plasterkach. Podczas gdy dojrzały mózg może być używany do generowania wycinków organotypowych, wycinki z niedojrzałego mózgu są bardziej podatne na hodowlę i są częściej wykorzystywane. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania modeli, które naśladują lub reprezentują nienaruszony dojrzały mózg, które są łatwe w użyciu, w których można badać neuronalne szlaki sygnałowe.

Tutaj opisana jest technika in vitro obejmująca nienaruszoną tkankę nerwową, która może być użyta do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych związanych ze śmiercią komórki po zniewadze ekscytotoksycznej lub niedokrwiennej. Technika ta zmniejsza liczbę zwierząt potrzebnych do przeprowadzenia eksperymentu, jest odtwarzalna i generuje żywotną tkankę, która zachowuje się metabolicznie podobnie do większych plasterków organotypowych. Ponadto obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedział postsynaptyczny pozostają częściowo nienaruszone. Zastosowany bufor fizjologiczny umożliwia "ponowne uszczelnienie" błon komórkowych i odzyskanie przez komórki ich pierwotnej odporności błonowej ⁹. Ten model wycinka mózgu jest w stanie wiernie naśladować reakcje obserwowane po urazach mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności ¹⁰ i może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z udarem.

Protokół

Wszystkie procedury są wykonywane za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle, a także zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami, w tym Ustawą o Badaniach na Zwierzętach w Nowej Południowej Walii, Ustawą o Badaniach na Zwierzętach w Nowej Południowej Walii oraz Australijskim Kodeksem Postępowania w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych.

1. Sekcja tkanki mózgowej

1. Składaj w ofierze dwunastotygodniowe samce szczurów przez ścięcie. Szczury mogą być albo uśmierzane przez ogłuszenie i ścięcie, albo mogą być najpierw znieczulone izofluranem (5% indukcji, 1,5-2% konserwacji) w 70% N₂ i 30% O₂, a następnie pozbawione głowy.
2. Usuń mózg z czaszki tak szybko, jak to możliwe (najlepiej zrobić to w czasie krótszym niż 2 minuty).
3. Usuń korę przez rozbiór z wolnej ręki. Sekcja powinna być wykonana w jak najkrótszym czasie, z jak najmniejszym uszkodzeniem mózgu, aby zachować integralność plastrów.
4. W celu usunięcia resztek skóry, sierści, krwi itp., należy zanurzyć mózg w niewielkiej ilości (3-5 ml) buforu Krebsa o temperaturze 37 °C (118 mM chlorku sodu, 4,7 mM chlorku potasu, 1,3 mM chlorku wapnia, 1,2 mM diwodorofosforanu potasu, 1,2 mM siarczanu magnezu, 25 mM wodorowęglanu sodu, 11,7 mM glukozy, 0,03 mM kwasu disodowego etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), zrównoważony 95% tlenu/5% dwutlenku węgla (karbogen), pH 7,4).

2. Przygotowanie mikroplastrów

1. Umieść mózg na stoliku rozdrabniacza McIlwain, na którym umieszczono dwie plastry bibuły filtracyjnej i zwilżono ciepłym buforem Krebsa. Utrzymuj mózg i bibułę filtracyjną zwilżoną ciepłym buforem Krebsa, ale nie na tyle mokrą, aby na powierzchni bibuły znajdował się wolny płyn, który może powodować ślizganie się mózgu.
2. Pokrój mózg na sekcje koronalne o grubości 250 μm. Ponieważ składniki odżywcze, tlen i materiały odpadowe, które normalnie są wymieniane z krwią, są wymieniane z płynem, który otacza tkankę w izolowanej tkance nerwowej, rozmiar plastrów nie powinien przekraczać 400 μm grubości, aby umożliwić odpowiednie natlenienie i wymianę składników odżywczych
.
3. Obróć stolik McIlwaina o 90°.
4. Pokrój mózgi na plastry strzałkowe o grubości 250 μm. W tym przypadku te skrawki mózgu (plastry 250 μm x 250 μm o różnej długości w zależności od grubości tkanki) są określane jako mikroplasterki.
5. Umieść mikroplastry w probówce z okrągłym dnem z 10-15 ml buforu Krebsa o temperaturze 37 °C (ilość użytego buforu Krebsa będzie zależeć od ilości tkanki).

3. Równowaga mikroplasterków

1. Delikatnie mieszaj, aż poszczególne mikroplasterki zostaną zawieszone, a następnie pozwól im osiąść pod wpływem grawitacji.
2. Ostrożnie usunąć sklarowany nad osadem, który będzie mętny z powodu zawieszonych resztek komórek, i dodać do probówki 10 ml świeżego buforu Krebsa o temperaturze 37 °C.
3. Powtórz tę procedurę prania cztery razy, co spowoduje usunięcie większości zanieczyszczeń.
4. Następnie zrównoważyć mikroplastry w temperaturze 37 °C z delikatnym potrząsaniem/odwróceniem i zmieniać bufor Krebsa co 15 minut, łącznie przez 1 godzinę.
5. W tym czasie dodać 2 ml świeżego buforu Krebsa o temperaturze 37 °C i przenieść 15-20 mikrokropek (150 μl zawiesiny mikroplastków) do płaskodennych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml za pomocą końcówki do pipet o bardzo szerokim otworze i wygładzonymi krawędziach (którą można uzyskać, wycinając ~2 mm od końca końcówki P1000). Rozłóż mikroplasterki równomiernie na podstawie probówki w jednej warstwie, tak aby każdy mikroplasterek nie znajdował się dalej niż kilka milimetrów od natlenionej atmosfery.

4. Stymulacja ekscytotoksyczna

1. Inkubować mikroplastry w temperaturze 37 °C i w sposób ciągły przepuszczać karbogen po powierzchni zawiesiny mikroplastrów o objętości 150 μl, używając przewodu gazowego, który jest umieszczony tuż nad powierzchnią zawiesiny mikroplastrów (w celu uniknięcia zakłóceń mechanicznych).
2. Mikroplastry należy traktować 150 μl 5 mM glutaminianu + 100 μM glicyny w buforze Krebsa (bodziec ekscytotoksyczny: końcowe stężenie 2,5 mM glutaminianu + 50 μM glicyny) lub 150 μl samego buforu Krebsa (kontrola niestymulowana). Na tym etapie można zastosować różne bodźce (w tym między innymi AMPA, NMDA + glicyna, depolaryzacja KCl i deprywacja tlenu/glukozy).
3. Usunąć roztwór inkubacyjny w różnych momentach po stymulacji (0, 30, 60, 90, 120 i 300 sekund) i zastąpić go 300 μl lodowatego buforu homogenizacyjnego (30 mM Tris, pH 7,4, 1 mM glikolu etylenowego kwasu tetraoctowego, 4 mM EDTA, 100 μM molibdenianu amonu, 5 mM pirofosforanu sodu, 25 mM fluorku sodu, 1 mM ortowanadanu sodu, 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu, kompletny koktajl inhibitorów proteazy).
4. Homogenizuj mikroplastry na lodzie za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego (20 uderzeń; 700 obr./min).
5. Przechowuj homogenaty w temperaturze -80 °C, a różne cząsteczki sygnałowe, cząsteczki śmierci itp. mogą być mierzone za pomocą western blot.

Wyniki

Mikroplasterki wygenerowane za pomocą tej procedury są żywotne, a do produkcji mikroplasterków można użyć różnych gatunków (na przykład szczura, myszy i kurczaka). Wykorzystano trzy niezależne miary żywotności: szybkość oddychania (ryc. 1), proporcje nukleotydów adeninowych (ryc. 2) i zawartość potasu w tkankach (ryc. 3). Za pomocą tych pomiarów wykazano, że mikroplasterki zachowują żywotność przez co najmniej 2 godziny po pogeneracji.

Mikrowy...

Dyskusja

W niniejszym artykule opisano technikę in vitro wytwarzania mikroplasterków, którą można wykorzystać do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z ekscytotoksycznością i śmiercią komórek za pośrednictwem niedokrwienia w nienaruszonej dojrzałej tkance mózgowej. Technika ta wytwarza żywotną tkankę (ryc. 1-3), która jest metabolicznie podobna do większych wycinków organotypowych¹⁵. Co więcej, ten model mikrowarstwowy ściśle odpowiada reakcji obserwowanej po urazach mózgu in vivo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gilotyna			Służy do ścinania głów zwierząt
Sprzęt			Kleszcze, nożyczki, pęsety, etc., do usuwania i sekcji
mózgu Siekacz McIlwain Chopper	McIlwain są produkowane / dystrybuowane przez szereg firm, w tym Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments i Ted Pella.		Służy do generowania 100-400 µ m sekcje mózgu.
Rurki z tworzywa sztucznego z okrągłym dnem	Greiner
		wodna	Do utrzymywania tkanki w temperaturze 37 & stopni; C
		do nawilżania/napowietrzania	Służy do przechowywania mikroplasterków w wilgotnym, natlenionym środowisku
Rurki polistyrenowe z płaskim dnem Homogenizator
			Dounce