Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Podsumowanie

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Streszczenie

Badanie mechanizmów molekularnych związanych ze stanami neuropatologicznymi, takimi jak udar niedokrwienny, może być trudne przy użyciu całych układów zwierzęcych. W związku z tym powszechnie stosuje się pierwotne lub "neuronalne" systemy hodowli komórek. Chociaż systemy te są stosunkowo łatwe w obsłudze i są użytecznymi systemami modelowymi, w których różne wyniki funkcjonalne (takie jak śmierć komórki) można łatwo określić ilościowo, badane wyniki i szlaki w hodowanych niedojrzałych neuronach (takie jak szlaki śmierci komórki zależne od ekscytotoksyczności) niekoniecznie są takie same, jak te obserwowane w dojrzałym mózgu lub w nienaruszonej tkance. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania modeli, w których można by badać mechanizmy komórkowe w dojrzałej tkance nerwowej. Opracowaliśmy technikę in vitro, która może być wykorzystana do badania różnych szlaków molekularnych w nienaruszonej tkance nerwowej. Opisana tutaj technika wykorzystuje tkankę korową szczura, ale technikę tę można dostosować do wykorzystania tkanek różnych gatunków (takich jak mysz, królik, świnka morska i kurczak) lub regionów mózgu (na przykład hipokamp, prążkowie itp.). Dodatkowo można zastosować różne stymulacje/zabiegi (na przykład ekscytotoksyczne, podawanie inhibitorów itp.). Podsumowując, opisany tutaj model wycinka mózgu może być wykorzystany do zbadania różnych mechanizmów molekularnych zaangażowanych w uszkodzenie mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności.

Wprowadzenie

Najczęstszą formą udaru jest udar niedokrwienny, który występuje, gdy mózgowe naczynie krwionośne zostaje zablokowane. Niedokrwienie tkanek, które wynika z ustania przepływu krwi, powoduje rozległą depolaryzację błon, uwalnianie neuroprzekaźników pobudzających i utrzymujący się wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia, co prowadzi do aktywacji szlaków śmierci komórki ¹. Proces ten został nazwany "ekscytotoksycznością" i jest powszechnym szlakiem zaangażowanym w śmierć neuronów wytwarzaną przez różne patologie, w tym udar ². Hamowanie szlaków sygnałowych zaangażowanych w ekscytotoksyczność i inne kaskady śmierci komórek neuronalnych jest atrakcyjnym pode....

Protokół

Wszystkie procedury są wykonywane za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu w Newcastle, a także zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami, w tym Ustawą o Badaniach na Zwierzętach w Nowej Południowej Walii, Ustawą o Badaniach na Zwierzętach w Nowej Południowej Walii oraz Australijskim Kodeksem Postępowania w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych.

1. Sekcja tkanki mózgowej

1. Składaj w ofierze dwunastotygodniowe samce szczurów przez ścięcie. Szczury mogą być albo uśmierzane przez ogłuszenie i ścięcie, albo mogą być najpierw znieczulone izofluranem (5% indukcji, 1,5-2% konserwacji)....

Wyniki

Mikroplastry otrzymane za pomocą tej procedury są żywotne, a do ich wytwarzania można wykorzystać różne gatunki (na przykład szczura, myszy i kurczaka). Wykorzystano trzy niezależne miary żywotności: tempo oddychania (Rysunek 1), stosunki nukleotydów adeninowych (Rysunek 2) oraz zawartość potasu w tkance (Rysunek 3). Przy użyciu tych miar wykazano, że mikroplastry pozostają żywotne przez co najmniej 2 hr po ich przygotowaniu.

Mikroplastry mózg.......

Dyskusja

W niniejszym artykule opisano technikę in vitro wytwarzania mikroplasterków, którą można wykorzystać do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z ekscytotoksycznością i śmiercią komórek za pośrednictwem niedokrwienia w nienaruszonej dojrzałej tkance mózgowej. Technika ta wytwarza żywotną tkankę (ryc. 1-3), która jest metabolicznie podobna do większych wycinków organotypowych¹⁵. Co więcej, ten model mikrowarstwowy ściśle odpowiada reakcji obserwowanej po urazach mózgu in vivo.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gilotyna			Służy do ścinania głów zwierząt
Sprzęt			Kleszcze, nożyczki, pęsety, etc., do usuwania i sekcji
mózgu Siekacz McIlwain Chopper	McIlwain są produkowane / dystrybuowane przez szereg firm, w tym Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments i Ted Pella.		Służy do generowania 100-400 µ m sekcje mózgu.
Rurki z tworzywa sztucznego z okrągłym dnem	Greiner
		wodna	Do utrzymywania tkanki w temperaturze 37 & stopni; C
		do nawilżania/napowietrzania	Służy do przechowywania mikroplasterków w wilgotnym, natlenionym środowisku
Rurki polistyrenowe z płaskim dnem Homogenizator
			Dounce

chirurgiczny Kąpiel Urządzenie Nunc