Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51293

⸱

26 marca 2014

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University, State University of New York

W tym artykule

Podsumowanie

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Streszczenie

Szlak ubikwityny-proteasomu do degradacji białek okazał się jednym z najważniejszych mechanizmów regulacji szerokiego spektrum funkcji komórkowych w praktycznie wszystkich organizmach eukariotycznych. W szczególności u roślin system ubikwityny/proteasomu 26S (UPS) reguluje degradację białek i znacząco przyczynia się do rozwoju szerokiego zakresu procesów, w tym odpowiedzi immunologicznej, rozwoju i programowanej śmierci komórki. Co więcej, coraz więcej dowodów sugeruje, że liczne patogeny roślinne, takie jak Agrobacterium, wykorzystują UPS gospodarza do skutecznej infekcji, co podkreśla znaczenie UPS w interakcjach między roślinami a patogenami.

Specyficzność substratu UPS jest osiągana przez ligazę ubikwityny E3, która działa w porozumieniu z ligazami E1 i E2, rozpoznając i oznaczając specyficzne cząsteczki białka przeznaczone do degradacji poprzez dołączenie do nich łańcuchów cząsteczek ubikwityny. Jedną z klas ligaz E3 jest kompleks SCF (białko Skp1/Cullin/F-box), który specyficznie rozpoznaje substraty UPS i kieruje je do ubikwitynacji poprzez składnik białkowy F-box. Aby zbadać potencjalną rolę UPS w interesującym procesie biologicznym, ważne jest opracowanie prostego i wiarygodnego testu do degradacji białek za pośrednictwem UPS. W tym miejscu opisujemy jeden z takich testów wykorzystujących system bezkomórkowy roślinny. Test ten można zaadaptować do badań nad rolą regulowanej degradacji białek w różnych procesach komórkowych, ze szczególnym uwzględnieniem interakcji białko-substrat F-box.

Wprowadzenie

Szlak ubikwityny/proteasomu 26S staje się szeroko rozpowszechnionym mechanizmem kontroli różnych reakcji biologicznych, w tym regulacji transkrypcji, progresji cyklu komórkowego i transdukcji sygnału, regulacji receptora w dół lub endocytozy, między innymi procesów1-4. W tym szlaku białko docelowe jest znakowane resztami ubikwityny, które są najpierw przyłączane wiązaniem tiolestrowym do enzymu aktywującego ubikwitynę E1, a następnie przemieszczane do reszty aminokwasowej cysteiny enzymu koniugacji ubikwityny E2; wreszcie E2 oddziałuje z ligazą ubikwityny E3, powodując poliubikwitynację substratu białkowego. Ostatecznie poliubikwitynowane białka są rozpoznawane i degradowane przez proteasom 26S. W tym mechanizmie enzym E3 określa substrat i działa jako kluczowy składnik regulatorowy układu proteasomu ubikwityny/26S (UPS). Ligazy E3 mogą działać niezależnie, takie jak ligazy domeny RING, lub jako część wielopodjednostkowego kompleksu SCF (białko Skp1 / Cullin / F-box), takiego jak ligazy domeny F-box. Szlaki degradacji proteasomalnej, w których pośredniczy SCF, biorą udział w regulacji transkrypcji, cyklu komórkowego, transdukcji sygnału5-10 i wielu innych głównych funkcjach komórkowych.

Oprócz tych krytycznych ról w regulacji procesów komórkowych, UPS zajmuje centralne miejsce w wielu interakcjach roślina-patogen. Na przykład coraz więcej dowodów sugeruje, że kilka patogenów roślin, w tym Agrobacterium tumefaciens, polega na UPS gospodarza w celu ułatwienia procesu infekcji11. Agrobacterium wywołuje nowotwór na roślinach, które reprezentują jego naturalnych gospodarzy, a także może przekształcać szeroką gamę innych eukariontów, od grzybów1,2 po komórki ludzkie12,13. Podczas infekcji Agrobacterium eksportuje element DNA (T-DNA) i kilka białek wirulencji (Vir) do komórki gospodarza12-13. Jednym z tych białek jest VirF, pierwsze białko F-box, które zostało zakodowane przez genom prokariotyczny14. Jako część kompleksu ligazy ubikwityny SCF, VirF i jego funkcjonalny homolog gospodarza VBF15 ułatwiają infekcję Agrobacterium poprzez degradację białek za pośrednictwem UPS, co prawdopodobnie ułatwia odwarstwienie inwazyjnego bakteryjnego T-DNA od towarzyszących mu białek bakteryjnych i gospodarza, odpowiednio VirE2 i VIP116,17. Co ciekawe, wiele białek F-box, w tym VirF, jest wewnętrznie niestabilnych ze względu na własną proteolizę, w której pośredniczy aktywność autoubikwitynacji18,19 lub inne ligazy E3, dla których białka F-box mogą służyć jako substraty20-23.

Podczas badania aktywności biochemicznej białek F-box, innych ligaz ubikwityny i/lub ich substratów, bardzo przydatne byłoby zastosowanie prostego i wiarygodnego testu degradacji proteasomalnej. Tutaj opisujemy jeden z takich protokołów do analizy stabilności białek w systemie bezkomórkowym. W tym teście stabilność substratu UPS jest analizowana w obecności lub braku jednego z podstawowych składników szlaku degradacji proteasomalnej, takiego jak białko F-box, w systemie bezkomórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, dokonujemy ekspresji badanych białek w tkankach roślinnych, przygotowujemy bezkomórkowe ekstrakty z tych tkanek i monitorujemy ilość białka (białek) będących przedmiotem zainteresowania za pomocą western blot. Zależny od UPS mechanizm degradacji białek jest wykazywany przez włączenie specyficznych inhibitorów proteasomalnych i/lub wykorzystanie koekspresji dominująco-ujemnej formy składnika SCF, Culliny. Podczas gdy ilustrujemy ten test za pomocą proteasomalnej degradacji białka Arabidopsis VIP117 przez białko F-box VBF15, można go wykorzystać do zbadania stabilności dowolnych innych substratów proteasomalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja białka

  1. Wybór systemu odciągu
    Należy wybrać system, tj. wektory i metodę dostarczania wektorów, najlepiej nadające się do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania w konkretnym organizmie/komórce modelowej. Należy pamiętać, że nasz test wymaga ekspresji badanych białek w łatwo wykrywalnych ilościach, co najlepiej osiąga się poprzez przejściową transformację dużej liczby komórek. Na przykład w roślinach najlepiej osiągnąć to za pomocą plazmidów binarnych jako wektorów ekspresji i Agrobacterium jako systemu dostarczania.
  2. Budowa binarnych wektorów wyrażeń
    Sklonuj sekwencję kodującą (sekwencje) białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania do wektora ekspresyjnego samodzielnie lub w fuzji translacyjnej do znacznika epitopu. Użyj wektorów odpowiednich dla wybranego systemu ekspresji i standardowych procedur biologii molekularnej do klonowania genów. W przypadku dostarczania genów za pośrednictwem Agrobacterium należy zastosować wektory binarne i wprowadzić je, również przy użyciu standardowych protokołów, do szczepu Agrobacterium, takiego jak EHA105, w celu późniejszego zaszczepienia tkanek roślinnych.
  3. Wybór gatunków roślin
    Należy wybrać gatunek rośliny, w którym białko (białka) będące przedmiotem zainteresowania będzie wyrażane. Należy pamiętać, że chociaż można użyć dowolnego gatunku roślin podatnego na transformację genetyczną za pośrednictwem Agrobacterium, naszym ulubionym gatunkiem rośliny jest Nicotiana benthamiana, która jest łatwa w uprawie, bardzo podatna na Agrobacterium i ma duże liście, które łatwo się zaszczepiają.
  4. Wzrost roślin
    Hoduj jedną roślinę przez 4 do 6 tygodni w doniczce z Pro-Mix BX w doniczce (20 cm x 20 cm x 20 cm) w kontrolowanych warunkach środowiskowych (np. komora wzrostu) długiego dnia (tj. 16 godzin światła 130-150 μE m-2 s-1 w temperaturze 23°C i 8 godzin ciemności w temperaturze 20°C) i wilgotności względnej 40-65%.
    1.5.2 Nawozić od czasu do czasu dostępnymi na rynku produktami zgodnie z instrukcjami producenta. Gdy roślina jest już wyrosła, wybierz liście o wymiarach 50 mm x 70 mm lub większych (te pomiary długości nie obejmują ogonka liściowego) do inokulacji Agrobacterium.
  5. Inokulacja preparatem Agrobacterium
    Wyhodować szczep Agrobacterium zawierający konstrukt binarny eksprymujący badane białka z kroku 1.3 przez noc w temperaturze 28°C w pożywce YEP (1% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego i 0,5% NaCl) uzupełnionej odpowiednimi antybiotykami (np. 100 mg/L streptomycyny i 10 mg/L ryfampicyny dla wektorów opartych na pPZP-RSC224-25).
    1.6.2 Odwirować komórki, zawiesić je do OD600 = 0,5 w buforze infiltracyjnym [10 mM MgCl2, 10 mM Mes (pH 5,6), 100 μM acetosyringonu] i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Naciekać kulturę do axialnej strony liścia za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej; Zauważ, że liście są zaszczepiane in situ, podczas gdy jest przyczepiony do rośliny.
    1.6.3 Po infiltracji roślinę uprawiać przez 72 godziny w warunkach świetlnych 16 h 130-150 μE m-2 s-1 light w temperaturze 23°C/8 h ciemności w temperaturze 20°C przed zbiorem.
  6. Stosowanie inhibitorów proteasomalnych
    Aby potwierdzić tezę, że badane białka są degradowane przez szlak proteasomalny, należy zastosować specyficzne inhibitory proteasomalne MG132 i laktacystynę28-29, które powinny zmniejszyć lub nawet zablokować degradację. Na cztery godziny przed zbiorem (patrz krok 2.1) naciekać obszary liści zaszczepionych przez Agrobacterium 10 μM MG132 (EMD Millipore) lub 10 μM laktacystyny (Sigma-Aldrich) lub pozorować działanie liści odpowiednimi rozpuszczalnikami, tj. 0,1% DMSO lub wodą destylowaną.

2. Przygotowanie ekstraktów bezkomórkowych

  1. Zbiór liści
    Zbierz zaszczepione obszary liści, zwykle ok. 200-400 mg świeżej masy, i zmiel je na drobny proszek w ciekłym azocie. Alternatywnie, ubijaj tkanki za pomocą dowolnego ubijaka do kulek (np. Biospec) lub amalgamatora dentystycznego (np. TPC Advanced Technologies) bezpośrednio w buforze degradacji (patrz krok 2.2).
  2. Ekstrakcja białka
    Przygotować ekstrakt białkowy całkowity, umieszczając zmieloną tkankę w 500 μl buforu degradacyjnego [50mM Tris-HCL (pH 7,5), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 5 mM adenozyno-5'-trifosforan i 1x koktajl inhibitorów proteazy (Sigma-Aldrich)]. Należy pamiętać, że koktajl inhibitorów proteazy wpływa głównie na serynę, cysteinę, asparadawkę i metaloproteazy i nie zakłóca proteazy 26S. Klarować ekstrakt przez dwa sekwencyjne wirowania przy 12 000 x g przez 5 minut.
  3. Reakcja degradacji białek
    Przenieś równe objętości ekstraktów, zwykle 20 μl, do probówek do mikrofuge i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez coraz dłuższy czas. Zazwyczaj próbkowany czas zero i 5, 10, 15, 20 i 30 minut punktów czasowych. Zatrzymaj reakcje, gotując je w żelowym buforze do próbek SDS i przeanalizuj je za pomocą western blot.

3. Wykrywanie degradacji białek przez immunoblotting

  1. Elektroforeza żelowa
    3.1.1 Roztwory białek należy rozpuścić za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS i elektrotransferować rozwiązane białka do membrany nitrocelulozowej zgodnie ze standardowym protokołem30.
    3.1.2 Oznaczyć stężenie białka metodą Bradforda (Bio-Rad) i załadować 50-80 μg białka całkowitego na pas. Upewnij się, że wszystkie próbki są załadowane jednakowo. W przypadku kontroli obciążenia należy porównać intensywności wszechobecnych gatunków białek, takich jak przypuszczalne duże łańcuchy RuBisCo, które migrują jako główne pasmo o względnej ruchliwości elektroforetycznej około 50 kDa; można je wykryć na niebiesko barwionych żelach Coomassie lub na membranach nitrocelulozowych barwionych metodą Ponceau S lub fluorescencyjnym SYPRO Ruby.
  2. Blokowanie
    Zablokuj membranę 5% odtłuszczonym mlekiem w TBST (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,4) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Przeciwciało pierwszorzędowe
    Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało antyepitopowe w 1% odtłuszczonym mleku w TBST do stężenia zalecanego przez producenta i inkubować z zablokowaną membraną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4ºC z delikatnym mieszaniem.
  4. Płukanie
    Przepłukać membranę, przepłukuje się w 20 ml TBST przez 15 minut raz i dwa razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  5. Przeciwciało drugorzędowe
    Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe (np. anty-królicze IgG) sprzężone z peroksydazą chrzanowego (HRP) w 1% mleku odtłuszczonym w TBST zgodnie z zaleceniami producenta i inkubować z membraną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  6. Wykrywanie
    Ponownie przepłukać membranę zgodnie z opisem w kroku 3.4. Po ostatnim płukaniu w TBST należy zobrazować interesujące białka za pomocą substratu chemiluminescencyjnego HRP, najczęściej przy użyciu zestawu ECL.  

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1, zaadaptowany z pracy Zaltsman et al.17, przedstawia reprezentatywne eksperymenty służące do wykrywania degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym. W szczególności demonstrujemy destabilizację białka VIP1 związanego z odpornością roślin przez białko F-box VBF via szlak SCFVBF w N. benthamiana. Białka VBF z Arabidopsis oraz białko VIP1 znakowane HA (HA-VIP1) były przejściowo koekspresowane, a zawartość białka HA-VIP1 w ekstraktach z ekspon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test ten opiera się na ekspresji badanych białek w tkankach roślinnych; Tak więc potencjalny proces degradacji proteasomalnej zachodzi oczywiście już w żywych tkankach. Destabilizację białek badamy jednak tylko w ekstraktach, przy czym początkowym punktem odniesienia jest próbka o czasie zero. Dlatego definiujemy go jako test bezkomórkowy.

Jednym z ważnych aspektów dla powodzenia tego testu jest prawidłowy wybór wektora ekspresji, z którego zostanie wyprodukowane badane białko (białka). O ile ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca, która doprowadziła do powstania tej publikacji, otrzymała dofinansowanie z programu Marie Curie COFUND "U-Mobility", współfinansowanego przez Uniwersytet w Maladze iSiódmy Program Ramowy Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) w ramach GA nr 246550. Prace w naszym laboratorium są wspierane przez granty z NIH, USDA/NIFA, NSF, BARD i BSF dla V.C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania białekBio-Rad500-0001
Koktajl inhibitorów proteinaz Sigma-AldrichS8820
System Mini-ProteanBio-Rad165-8000
Półsuchy system elektrotransferu SD do blottinguzachodniego Bio-Rad170-3940
Affinity Purified Rabbit Anti-HaICL LabRHGT-45A-Z
Koza anty-królicza peroksydaza IgG sprzężonaThermo Scientific31460
BioTrace, NT membrana transferowa nitrocelulozyPall Corporation27377-000
Immobilon zachodnie chemiluminescencyjne podłoże HRPEMD MilliporeWBKL S0 050
MG132EMD Millipore474790-1MG
LactacystinSigma-AldrichL6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL SubstratePierce35055

Bibliografia

  1. Patton, E. E., Willems, A. R., Tyers, M. Combinatorial control in ubiquitin-dependent proteolysis: don’t Skp the F-box hypothesis. Trends Genet. 14, 236-243 (1998).
  2. Deshaies, R. J. SCF and cullin/ring H2-based ubiquitin ligases. Annu. Rev. Cell Biol. 15, 435-467 (1999).
  3. Callis, J., Vierstra, R. D. Protein degradation in signaling. Curr. Opin. Plant Biol. 3, 381-386 (2000).
  4. Hellmann, H., Estelle, M. Plant development: regulation by protein degradation. Science. 297, 793-797 (2002).
  5. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu. Rev. Biochem. 67, 425-479 (1998).
  6. Dharmasiri, S., Estelle, M. The role of regulated protein degradation in auxin response. Plant Mol. Biol. 49, 401-409 (2002).
  7. Devoto, A., Muskett, P. R., Shirasu, K. Role of ubiquitination in the regulation of plant defence against pathogens. Curr. Opin. Plant Biol. 6, 307-311 (2003).
  8. Itoh, H., Matsuoka, M., Steber, C. M. A role for the ubiquitin-26S-proteasome pathway in gibberellin signaling. Trends Plant Sci. 8, 492-497 (2003).
  9. Wang, T. The 26S proteasome system in the signaling pathways of TGF-beta superfamily. Front. Biosci. 8, 1109-1127 (2003).
  10. Pagano, M. Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2- p27-Cdk1/2 axis. Mol. Cell. 14, 414-416 (2004).
  11. Magori, S., Citovsky, V. Hijacking of the host SCF ubiquitin ligase machinery by plant pathogens. Front. Plant Sci. 2, 87 (2011).
  12. Gelvin, S. B. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool. Microbiol. Mol Biol. Rev. 67, 16-37 (2003).
  13. Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. Int. J. Dev. Biol. 57, (2013).
  14. Schrammeijer, B., et al. Interaction of the virulence protein VirF of Agrobacterium tumefaciens with plant homologs of the yeast Skp1 protein. Curr. Biol. 11, 258-262 (2001).
  15. Zaltsman, A., Krichevsky, A., Loyter, A., Citovsky, V. Agrobacterium induces expression of a plant host F-box protein required for tumorigenicity. Cell Host Microbe. 7, 197-209 (2010).
  16. Tzfira, T., Vaidya, M., Citovsky, V. Involvement of targeted proteolysis in plant genetic transformation by Agrobacterium. Nature. 431, 87-92 (2004).
  17. Zaltsman, A., Lacroix, B., Gafni, Y., Citovsky, V. Disassembly of synthetic Agrobacterium T-DNA-protein complexes via the host SCFVBF ubiquitin-ligase complex pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 169-174 (2013).
  18. Zhou, P., Howley, P. M. Ubiquitination and degradation of the substrate recognition subunits of SCF ubiquitin-protein ligases. Mol. Cell. 2, 571-580 (1998).
  19. Galan, J. M., Peter, M. Ubiquitin-dependent degradation of multiple F-box proteins by an autocatalytic mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 9124-9129 (1999).
  20. Ayad, N. G., Rankin, S., Murakami, M., Jebanathirajah, J., Gygi, S., Kirschner, M. W. Tome-1, a trigger of mitotic entry, is degraded during G1 via the APC. Cell. 113, 101-113 (2003).
  21. Guardavaccaro, D., et al. Control of meiotic and mitotic progression by the F box protein b-Trcp1 in vivo. Dev. Cell. 4, 799-812 (2003).
  22. Magori, S., Citovsky, V. Agrobacterium counteracts host-induced degradation of its F-box protein effector. Sci. Signal. 4, (2011).
  23. Margottin-Goguet, F., Hsu, J. Y., Loktev, A., Hsieh, H. M., Reimann, J. D., Jackson, P. K. Prophase destruction of Emi1 by the SCFbTrCP/Slimb ubiquitin ligase activates the anaphase promoting complex to allow progression beyond prometaphase. Dev. Cell. 4, 813-826 (2003).
  24. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  25. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  26. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  27. Dafny-Yelin, M., Tzfira, T. Delivery of multiple transgenes to plant cells. Plant Physiol. 145, 1118-1128 (2007).
  28. Yang, P., et al. Purification of the Arabidopsis 26 S proteasome: biochemical and molecular analyses revealed the presence of multiple isoforms. J. Biol. Chem. 279, 6401-6413 (2004).
  29. Fenteany, G., et al. Inhibition of proteasome activities and subunit-specific amino-terminal threonine modification by lactacystin. Science. 268, 726-731 (1995).
  30. Current Protocols in Molecular Biology. Ausobel, F. M., et al. , Wiley-Interscience. New York. (1987).
  31. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: imagej.nih.gov/ij (1997).
  32. Kim, J. H., Kim, W. T. The Arabidopsis RING E3 ubiquitin ligase AtAIRP3/LOG2 participates in positive regulation of high salt and drought stress responses). Plant Physiol. 162, 1733-1749 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcja patogenu z roślinąsystem ubikwityna-proteasomsubstrat białka F-boxanaliza Western blotżel poliakrylamidowy SDSbadanie stabilności białekinokulacja Agrobacteriuminhibitor proteasomu MG132
Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.