Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie tkanki chrzęstnej ludzkiej przy użyciu technologii trójwymiarowego druku atramentowego

DOI:

10.3791/51294

⸱

10 czerwca 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute, 2Stemorgan Inc., 3Institute of Advanced Study, Technical University of Munich, 4Institute of Virology, School of Medicine, Wuhan University, 5Department of Molecular and Experimental Medicine, The Scripps Research Institute, 6Research Institute for Biomedical Sciences, Tokyo University of Science

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody opisane w tym artykule pokazują, jak przekształcić komercyjną drukarkę atramentową w biodrukarkę z jednoczesną polimeryzacją UV. Drukarka jest w stanie konstruować strukturę tkankową 3D z komórek i biomateriałów. Badanie, które wykazało, że tutaj skonstruowano chrząstkę nową 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioprinting, który opiera się na termicznym druku atramentowym, jest jedną z najbardziej atrakcyjnych technologii wspomagających w dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Dzięki cyfrowym komórkom kontrolnym, rusztowania i czynniki wzrostu mogą być precyzyjnie i szybko odkładane w żądanych dwuwymiarowych (2D) i trójwymiarowych (3D) lokalizacjach. Dlatego technologia ta jest idealnym podejściem do wytwarzania tkanek naśladujących ich rodzime struktury anatomiczne. Aby zaprojektować chrząstkę z natywną organizacją strefową, składem macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i właściwościami mechanicznymi, opracowaliśmy platformę biodruku przy użyciu komercyjnej drukarki atramentowej z jednoczesną fotopolimeryzacją, zdolną do inżynierii tkankowej chrząstki 3D. Ludzkie chondrocyty zawieszone w diakrylanie poli(glikolu etylenowego) (PEGDA) zostały wydrukowane do budowy 3D chrząstki nowej poprzez montaż warstwa po warstwie. Wydrukowane komórki utrwalono w ich pierwotnych pozycjach zdeponowanych, wspieranych przez otaczające rusztowanie w jednoczesnej fotopolimeryzacji. Właściwości mechaniczne wydrukowanej tkanki były zbliżone do chrząstki rodzimej. W porównaniu z konwencjonalnym wytwarzaniem tkanek, które wymaga dłuższej ekspozycji na promieniowanie UV, żywotność wydrukowanych komórek przy jednoczesnej fotopolimeryzacji była znacznie wyższa. Drukowana chrząstka nowa wykazywała doskonałą produkcję glikozaminoglikanu (GAG) i kolagenu typu II, co było zgodne z ekspresją genów. Dlatego platforma ta jest idealna do dokładnego rozmieszczenia i rozmieszczenia komórek w anatomicznej inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioprinting oparty na termicznym druku atramentowym jest jedną z najbardziej obiecujących technologii wspomagających w dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Dzięki cyfrowemu sterowaniu i wysokiej przepustowości głowice drukujące komórki, rusztowania i czynniki wzrostu mogą być precyzyjnie osadzane w żądanych pozycjach dwuwymiarowych (2D) i trójwymiarowych (3D). Technologia ta została z powodzeniem zastosowana w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej1-9. W artykule stworzono platformę biodruku ze zmodyfikowaną termiczną drukarką atramentową Hewlett-Packard (HP) Deskjet 500 i systemem jednoczesnej fotopolimeryzacji. Syntetyczne hydrożele sformułowane z poli(glikolu etylenowego) (PEG) wykazały zdolność do utrzymywania żywotności chondrocytów i promowania chondrogennej produkcji ECM10,11. Ponadto fotosieciowalny PEG jest wysoce rozpuszczalny w wodzie o niskiej lepkości, co czyni go idealnym do jednoczesnej polimeryzacji podczas biodruku 3D. W niniejszej pracy ludzkie chondrocyty zawieszone w dikrylanie poli(etylenu) glikolu (PEGDA; MW 3,400) zostały precyzyjnie wydrukowane, aby zbudować chrząstkę nową warstwa po warstwie w rozdzielczości 1400 dpi w rozdzielczości 3D. Zaobserwowano jednorodne rozmieszczenie zdeponowanych komórek w rusztowaniu 3D, co pozwoliło na wytworzenie tkanki chrzęstnej o doskonałych właściwościach mechanicznych i zwiększonej produkcji ECM. W przeciwieństwie do tego, w wytwarzaniu ręcznym, komórki gromadziły się na dnie żelu zamiast w ich początkowo zdeponowanych pozycjach z powodu wolniejszej polimeryzacji rusztowania, co prowadziło do niejednorodnego tworzenia się chrząstki po hodowli2,3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Założenie platformy biodruku

Modyfikacja drukarki była oparta na termicznej drukarce atramentowej HP Deskjet 500 i czarnym wkładzie atramentowym HP 51626a.

  1. Zdejmij górną plastikową pokrywę drukarki i ostrożnie odłącz panel sterowania od pokrywy.
  2. Odłącz 3 połączenia kablowe między górną częścią drukarki a podstawą. Zdejmij górną część drukarki z podstawy.
  3. Z górnej części drukarki wyjmij małe plastikowe i gumowe akcesoria (system czyszczenia głowicy drukującej) po prawej stronie pod pojemnikiem z tuszem.
  4. Zdejmij podstawę podajnika papieru za pomocą sprężyn.
  5. Zdejmij metalową płytkę zakrywającą plastikowy pręt podajnika papieru.
  6. Odetnij plastikową listwę podającą papier w środkowej pozycji koła podającego za pomocą piły ręcznej lub innego narzędzia tnącego.
  7. Usuń 2 kółka podające papier odsłonięte po poprzednim kroku. Plastikowe koło jest bardzo twarde i pomocna będzie piła elektroniczna.
  8. Oczyść kurz i zanieczyszczenia za pomocą chusteczek z powietrzem w puszce i etanolu.
  9. Przymocuj górną część drukarki do podstawy.
  10. Przed użyciem sterylizuj zmodyfikowaną drukarkę UV przez co najmniej 2 godziny w okapie z przepływem laminarnym.
  11. Odetnij nakrętkę wkładu atramentowego HP 51626a za pomocą piły ręcznej lub innego narzędzia tnącego.
  12. Opróżnij tusz i wyjmij filtr, który zakrywa dolny zbiornik studni chrząstki.
  13. Dokładnie wypłucz wkład pod bieżącą wodą z kranu.
  14. Ultradźwiękowo zanurzyć wkład w wodzie dejonizowanej (DI) przez 10 minut, aby usunąć resztki atramentu.
  15. Sprawdź wkład, aby upewnić się, że cały atrament został usunięty. Dokładnie wypłucz lub spryskaj wkład 70% etanolem do sterylizacji, a następnie wysterylizowaną wodą DI.
  16. Ustaw lampę ultrafioletową o dużej długości fali nad platformą drukującą, aby zapewnić jednoczesną zdolność fotopolimeryzacji.
  17. Zmierz intensywność promieniowania UV na platformie drukującej za pomocą miernika światła UV. Dostosuj odległość między lampą UV a platformą drukarki tak, aby intensywność przy drukowanym obiekcie wynosiła od 4 do 8 mW/cm2 (około 25 cm od lampy do platformy drukarki).

2. Przygotowanie biotuszu

  1. Jednowarstwowa ekspansja chondrocytów
    1. Umieść 5 milionów ludzkich chondrocytów w każdej kolbie do hodowli tkankowej T175 w celu ekspansji komórek w pożywce Dulbeccos Modified Eagles (DMEM) uzupełnionej 10% surowicą cielęcą i 1x penicyliną-streptomycyną-glutaminą (PSG). Hodowla komórek w temperaturze 37 °C z nawilżonym powietrzem zawierającym 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 3 dni, aż kolba osiągnie 85% zbieżności. Użyj komórek z tego samego fragmentu.
  2. Rozpuścić PEGDA w PBS do końcowego stężenia 10% w/v. Dodać fotoinicjator I-2959 do końcowego stężenia 0,05% w/v. Filtrować wysterylizować roztwór.
  3. Zawiesić hodowane ludzkie chondrocyty w przygotowanym roztworze PEGDA w stężeniu 5 x 106 komórek/ml.

3. Drukowanie tkanki chrzęstnej

  1. Włącz drukarkę i laptopa.
  2. Utwórz wzór drukowania pełnego koła o średnicy 4 mm za pomocą programu Microsoft Word lub Adobe Photoshop.
    1. Dostosuj położenie wzoru i upewnij się, że zostanie on wydrukowany dokładnie w plastikowej formie.
    2. Oblicz liczbę wydruków potrzebnych do osiągnięcia pożądanej grubości rusztowania. W przypadku wysokości 4 mm potrzeba 220 wydruków, aby stworzyć pożądane rusztowanie.
  3. Załaduj biotusz do pojemnika z tuszem. Przykryj wkład folią aluminiową, aby chronić go przed bezpośrednim działaniem promieni UV podczas drukowania.
  4. Wyślij polecenie drukowania do drukarki. Pociągnij czujnik papieru, gdy drukarka rozpocznie drukowanie. Cały proces drukowania powinien zająć mniej niż 4 minuty w przypadku rusztowania o średnicy 4 mm i wysokości 4 mm.
  5. Przenieść wydrukowaną chrząstkę nowotworową na płytkę 24-dołkową i dodać 1,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka.

4. Ocena żywotności komórek w rusztowaniu 3D

  1. Inkubować wydrukowaną chrząstkę w roztworze roboczym ŻYWY/MARTWYM Żywotność/Cytotoksyczność w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.
  2. Przetnij hydrożel obciążony komórkami na pół i wykonaj fluorescencyjne zdjęcia obszaru cięcia.
  3. Policz żywe (zielone) i martwe (czerwone) komórki przez zaślepionego obserwatora na pięciu losowo wykonanych obrazach. Oblicz żywotność komórek, dzieląc liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę żywych i martwych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmodyfikowana termiczna drukarka atramentowa była zdolna do osadzania komórek i rusztowań przy wysokiej przepustowości i doskonałej żywotności komórek. W połączeniu z jednoczesną fotopolimeryzacją i światłoczułymi biomateriałami, technologia ta jest w stanie utrwalić komórki i inne drukowane substancje w początkowo osadzonych miejscach. Zgodnie z właściwościami zmodyfikowanej termicznej drukarki atramentowej, rozdzielczość druku 2D wynosiła 300 dpi przy objętości pojedynczej kropli atramentu 130 pl. W każdej głowicy druk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten system biodruku 3D z jednoczesną zdolnością fotopolimeryzacji zapewnia znacznie większą rozdzielczość drukowania niż najlepsza wcześniej opisana metoda drukowania in situ ubytków kostno-chrzęstnych przy użyciu strzykawki wytłaczanej przez komórkowy hydrożelalginianowy 16. Wyższa rozdzielczość drukowania jest szczególnie istotna dla inżynierii tkanki chrzęstnej w celu przywrócenia anatomicznej organizacji strefowej chrząstki. Jednoczesna fotopolimeryzacja podczas montażu warstwa po warstwie ma kluc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnego interesu finansowego w tym badaniu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony New York Capital Region Research Alliance Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Termiczna drukarka atramentowa HP Deskjet 500Hewlett-PackardC2106azostała wycofana z produkcji. Zakupiony odnowiony od sprzedawcy internetowego.
wkład atramentowy HPHewlett-Packard51626a Lampa
ultrafioletowaUVPB-100AP
Światłomierz UV NarzędziaogólneUV513AB
Laserowy mikroskop skaningowy Zeiss LSM 510Carl ZeissLSM 510
Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM)Mediatech10-013
Penicylina-streptomycyna-glutamina (PSG)Invitrogen10378-016
Odczynnik do dysocjacji komórekAccutazy InvitrogenA11105-01
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Invitrogen10010-023
Żywa/martwa żywotność/cytotoksyczność ZestawInvitrogenL-3224
Diakrylan poli(glikolu etylenowego) (PEGDA)Glikoza BiosystemsGS700
Irgacure 2959Ciba Specjalistyczne chemikaliaI-2959
Ludzkie chondrocyty stawoweLonzaCC-2550

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cui, X., Boland, T. Human microvasculature fabrication using thermal inkjet printing technology. Biomaterials. 30, 6221-6227 (2009).
  2. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., D'Lima, D. D. Direct human cartilage repair using three-dimensional bioprinting technology. Tissue Eng Part A. 18, 1304-1312 (2012).
  3. Cui, X., Breitenkamp, K., Lotz, M., D'Lima, D. Synergistic action of fibroblast growth factor-2 and transforming growth factor-beta1 enhances bioprinted human neocartilage formation. Biotechnol. Bioeng. 109, 2357-2368 (2012).
  4. Cui, X., Breitenkamp, K., Finn, M. G., Lotz, M., Colwell, C. W. Direct human cartilage repair using thermal inkjet printing technology. Osteoarthritis and Cartilage. 19, (2011).
  5. Cui, X., Boland, T. Simultaneous deposition of human microvascular endothelial cells and biomaterials for human microvasculature fabrication using inkjet printing. NIP24/digital Fabrication 2008: 24th International Conference on Digital Printing Technologies, Technical Program and Proceedings. 24, 480-483 (2008).
  6. Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells. Biotechnol. Bioeng. 106, 963-969 (2010).
  7. Cui, X., Hasegawa, A., Lotz, M., D'Lima, D. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with meniscus cells promotes meniscal phenotype without hypertrophy. Biotechnol. Bioeng. 109, 2369-2380 (2012).
  8. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol. Lett. 35, 315-321 (2013).
  9. Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
  10. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Hydrogel properties influence ECM production by chondrocytes photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 59, 63-72 (2002).
  11. Elisseeff, J., et al. Photoencapsulation of chondrocytes in poly(ethylene oxide)-based semi-interpenetrating networks. Journal of Biomedical Materials Research. 51, 164-171 (2000).
  12. Buskirk, W. A., et al. Development of A High-Resolution Thermal Inkjet Printhead. Hewlett-Packard Journal. 39, 55-61 (1988).
  13. Harmon, J. P., Widder, J. A. Integrating the Printhead Into the HP Deskjet Printer. Hewlett-Packard Journal. 39, 62-66 (1988).
  14. Kim, T. K., et al. Experimental model for cartilage tissue engineering to regenerate the zonal organization of articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 11, 653-664 (2003).
  15. Sharma, B., et al. Designing zonal organization into tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 13, 405-414 (2007).
  16. Cohen, D. L., Lipton, J. I., Bonassar, L. J., Lipson, H. Additive manufacturing for in situ repair of osteochondral defects. Biofabrication. 2, (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drukowanie tkanek 3Dtermiczna drukarka atramentowajednoczesna fotopolimeryzacjaludzkie chondrocytyrusztowanie z PEGDAmonta warstwa po warstwiemikroskopia konfokalnabarwienie histologicznetest ywotno ci kom rekprodukcja glikozaminoglikan w

Powiązane artykuły