Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Podsumowanie

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Streszczenie

Inżynieria białek rekombinowanych wykorzystuje systemy ekspresji Escherichia coli (E. coli) od prawie 4 dekad, a dziś E. coli jest nadal najczęściej używanym organizmem gospodarza. Elastyczność systemu pozwala na dodawanie ugrupowań, takich jak znacznik biotyny (do interakcji streptawidyny) i większych białek funkcjonalnych, takich jak białko zielonej fluorescencji lub białko wiśniowe. Ponadto integracja nienaturalnych aminokwasów, takich jak chelatory jonów metali, unikalnie reaktywne grupy funkcyjne, sondy spektroskopowe i cząsteczki nadające modyfikacje potranslacyjne, umożliwiła lepszą manipulację właściwościami i funkcjonalnościami białek. W rezultacie technika ta tworzy konfigurowalne białka fuzyjne, które oferują znaczącą użyteczność w różnych dziedzinach badań. Mówiąc dokładniej, biotynolowana sekwencja białkowa została włączona do wielu białek docelowych ze względu na wysokie powinowactwo interakcji między biotyną a awidyną i streptawidyną. Dodatek ten przyczynił się do poprawy wykrywania i oczyszczania znakowanych białek, a także otworzył drogę do zastosowań wtórnych, takich jak sortowanie komórek. W związku z tym cząsteczki znakowane biotyną wykazują coraz większy i powszechny wpływ w dziedzinach bioprzemysłu i biomedycyny. Na potrzeby naszych badań zaprojektowaliśmy rekombinowane biotynylowane białka fuzyjne zawierające regiony funkcjonalne czynnika wzrostu nerwów (NGF) i semaforyny3A (Sema3A). Informowaliśmy wcześniej, w jaki sposób te biotynylowane białka fuzyjne, wraz z innymi aktywnymi sekwencjami białkowymi, mogą być powiązane z biomateriałami w celu inżynierii tkankowej i celów regeneracyjnych. Protokół ten przedstawia podstawy inżynierii białek biotynolacyjnych w skali miligramowej, wykorzystując wektor indukowany przez T7 lac i gospodarzy ekspresji E. coli, począwszy od transformacji do skalowania i oczyszczania.

Wprowadzenie

Białka obejmują szeroki zakres biomolekuł, które są odpowiedzialne za wiele funkcji biologicznych, ostatecznie prowadząc do prawidłowego tworzenia i organizacji tkanek. Cząsteczki te inicjują tysiące szlaków sygnałowych, które kontrolują regulację w górę i/lub w dół genów i innych białek, utrzymując równowagę w ludzkim ciele. Zakłócenie działania pojedynczego białka wpływa na całą tę sieć sygnałów, co może prowadzić do wystąpienia wyniszczających zaburzeń lub chorób. Inżynieria pojedynczych białek w laboratorium oferuje jedno z rozwiązań do zwalczania tych niekorzystnych skutków i stanowi alternatywę dla leków małocząsteczkowych. W 1977 roku gen kodujący sekwencję 14-aminokwasowej somatostatyny był jednym z pierwszych zmodyfikowanych polipeptydów stworzonych przy użyciu E. coli¹. Wkrótce potem, w 1979 roku, insulina została sklonowana w plazmidzie pBR322, przekształcona, poddana ekspresji i oczyszczona². Od tego czasu rekombinowane białka rozszerzyły swój wpływ na wiele dziedzin badań, takich jak biomateriały, dostarczanie leków, inżynieria tkankowa, biofarmaceutyki, rolnictwo, enzymy przemysłowe, biopaliwa itp. Wynika to w dużej mierze z wszechstronności, jaką oferuje ta technika, poprzez dodawanie specyficznych dla aplikacji ugrupowań chemicznych lub sekwencji białkowych do celów obejmujących między innymi identyfikację, stabilizację i oczyszczanie białka docelowego.

Dzięki technologii rekombinacji DNA, rekombinowane białka mogą być wyrażane w różnych systemach gospodarzy eukariotycznych i prokariotycznych, w tym u ssaków, roślin, owadów, drożdży, grzybów lub bakterii. Każdy host oferuje inne zalety i zazwyczaj najlepszy system jest określany na podstawie funkcji białka, wydajności, stabilności, całkowitego kosztu i skalowalności. Komórkom bakteryjnym często brakuje mechanizmów modyfikacji potranslacyjnej, które zapewniają gospodarze eukariotyczni (tj. glikozylacji, mostkowania dwusiarczków itp.)⁵. W rezultacie systemy ssaków i owadów zwykle skutkują lepszą kompatybilnością i ekspresją białek eukariotycznych; Jednak te hosty są zazwyczaj droższe i bardziej czasochłonne⁹. Dlatego E. coli jest preferowanym gospodarzem dla naszego systemu ekspresji, ponieważ komórki szybko się rozwijają w niedrogich warunkach wzrostu, a mechanizmy ekspresji genetycznej są dobrze poznane^5,9. Ponadto system ten można łatwo skalować do celów produkcyjnych i skutkuje funkcjonalnymi białkami pomimo braku modyfikacji potranslacyjnych¹⁰. Szczep E. coli K12 został wybrany w tym protokole do klonowania, ponieważ szczep ten oferuje doskonałą wydajność plazmidu w oparciu o wysoką wydajność transformacji. Dodatkowo do ekspresji wykorzystuje się szczep E. coli BL21, ponieważ ten szczep gospodarza zawiera gen polimerazy RNA T7, który zapewnia kontrolowaną ekspresję i stabilność białka¹¹.

Po wyborze gospodarza, należy zachować ostrożność przy wyborze idealnego wektora ekspresji, aby ułatwić wyselekcjonowaną i kontrolowaną ekspresję białka. Synteza rekombinowanych białek rozpoczyna się od docelowej sekwencji DNA, która jest klonowana pod kierunkiem sygnałów transkrypcji i translacji T7 bakteriofaga, a ekspresja jest indukowana w komórkach gospodarza zawierających chromosomalne kopie genu polimerazy T7 RNA¹². Wektory te, pochodzące z wektora plazmidowego pBR322 (w celu zapoznania się z odniesieniem¹³), są ściśle kontrolowane przez promotor T7 początkowo opracowany przez Studiera i współpracowników¹⁴ i zapewniają dodatkową kontrolę poprzez włączenie operatora lac i represora lac (lac1)^15,16. W przypadku inżynierii białek rekombinowanych ten system ekspresji oferuje możliwość dostosowania określonej sekwencji aminokwasowej pożądanego białka poprzez wstawienie różnych docelowych sekwencji DNA lub tworzenie białek fuzyjnych składających się z połączonych domen z pojedynczych białek. Ponadto niektóre serie wektorów zawierają modyfikacje znaczników peptydowych, które należy umieścić na końcu N lub C. Dla naszych celów projektowych znacznik histydyny (His) został dodany do docelowej sekwencji DNA w celu oczyszczenia, a sekwencja 15 aminokwasów biotynylowanych została dołączona do biotynylacji^17,18. W tym protokole wybrano plazmid zawierający gen oporności na ampicylinę, który przenosi nasze biotynylowane sekwencje białek fuzyjnych. Ekspresja w tym wektorze jest kontrolowana przez promotor lak T7 i jest łatwo indukowana za pomocą izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).

Wyrażenia testowe (hodowle na małą skalę) są używane do określenia obecności i rozpuszczalności docelowego białka, które może być wyrażone zarówno w formie rozpuszczalnej, jak i nierozpuszczalnej, w celu sformułowania procedur oczyszczania. Rozpuszczalne białko ulegające ekspresji w komórce bakteryjnej ulegnie spontanicznemu fałdowaniu, aby zachować swoją natywną strukturę¹⁹. Zazwyczaj struktura natywna jest korzystna termodynamicznie. W wielu przypadkach aktywność metaboliczna gospodarza nie sprzyja białku docelowemu, co powoduje stres w systemie, co prowadzi do produkcji nierozpuszczalnych białek i tworzenia ciał inkluzyjnych złożonych z nierozpuszczalnych agregatów białkowych. W ten sposób docelowe białko ulega denaturacji, co czyni je na ogół biologicznie nieaktywnymi²⁰. Oba wyrażenia testowe są skalowane w górę, a procedury izolacji są określane na podstawie rozpuszczalności białka docelowego. W przypadku białek nierozpuszczalnych wymagany jest dodatkowy etap renaturacji lub ponownego fałdowania. Otrzymane rekombinowane białka można dalej oczyszczać za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Produkcja białek rekombinowanych w domu oferuje przewagę kosztową nad produktami komercyjnymi, ponieważ na litr głównej hodowli można wyizolować miligramy białka docelowego. Większość wymaganego sprzętu jest dostępna w typowym laboratorium biologicznym lub chemicznym. Inżynieria białkowa pozwala na tworzenie niestandardowych białek fuzyjnych z dodatkowymi funkcjami, które nie zawsze są dostępne na rynku. Rysunek 1 przedstawia główne procedury związane z inżynierią białek rekombinowanych. Dzięki temu systemowi ekspresji stworzyliśmy wiele białek biotynylowanych, takich jak interferon-gamma, płytkowy czynnik wzrostu i białko morfogenetyczne kości^21-23, ale skupimy się na dwóch białkach, które zaprojektowaliśmy do prowadzenia aksonów, NGF (29 kDa) i Sema3A (91 kDa)¹⁰ (przegląd patrz odniesienie²⁴). Biotynylacja jest powszechną techniką identyfikacji, immobilizacji i izolacji znakowanych białek wykorzystującą dobrze znaną interakcję biotyna-streptawidyna^25-27. Sondy biofizyczne^28,29, biosensory³⁰ i kropki kwantowe³¹ to tylko niektóre przykłady systemów, które wykorzystują wysokie powinowactwo koniugacji biotyny-streptawidyny z K_d rzędu ^10-15 M ²⁷. Ligaza biotyny E. coli, BirA, pomaga w kowalencyjnym przyłączeniu biotyny do łańcucha bocznego lizyny znajdującego się w sekwencji oznaczonej biotyną^18,32. Wiązanie biotyny z materiałami i biomolekułami zapewniło trwałe dostarczanie czynników wzrostu do komórki w wielu zastosowaniach inżynierii tkankowej^21,33-35. Dlatego inżynieria tych specjalnie zaprojektowanych biotynolowanych białek jest potężnym narzędziem, które może wykraczać poza wiele zainteresowań badawczych.

Protokół

1. Projektowanie docelowego białka

1. Korzystając ze strony internetowej National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), uzyskaj sekwencję aminową dla białka docelowego, biorąc pod uwagę interesujące nas gatunki i wszelkie warianty splicingu. Wybierz sekwencję aminokwasów, która odpowiada aktywnemu regionowi zainteresowania białka.
   Uwaga: Dla Sema3A wybrano aminokwasy 21-747. Białko fuzyjne zostało zaprojektowane z NGF, w którym sekwencja barstar, aminokwas 1-90, została dodana do aminokwasów NGF 122-241.
2. Do N-końca dodać następujące sekwencje: znacznik 6X-His do oczyszczania (HHHHHHH), miejsce przecięcia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) w celu usunięcia znacznika He (ENLYFQG), sekwencja znakowana biotyną do biotynylacji białka w K (GLNDIFEAQKIEWHE) i elastyczny zawias z przerwami, które pozwolą na prawidłowe ponowne fałdowanie białka (EFPKPSTPPGSSGGAP).
   Uwaga: Sekwencje te mogą się różnić w zależności od pożądanego białka fuzyjnego.
3. Wyślij kompletną sekwencję aminokwasów do firmy w celu zaprojektowania/optymalizacji genów dla pożądanego gatunku gospodarza i syntezy. Konwertuj do wybranego wektora za pomocą witryny BamHI-NotI, używając zestawu lub korzystając z usług komercyjnych.

2. Wykonywanie płytek agarowych

Uwaga: Bardzo ważne jest, aby wszystkie zapasy antybiotyków, płytek, itp. były odpowiednio przechowywane (temperatura i czas trwania) i pozostawały wolne od proteaz (wysterylizowane).

1. Odważyć agar w stężeniu 1,5% wag. i bulion lizogeniczny (LB) w stężeniu 20 g/l i umieścić w szklanej butelce z podłożem. Butelka o pojemności 500 ml wystarcza na około 15 talerzy.
2. Wolumetrycznie dodaj ultraczystą wodę, dobrze wymieszaj i autoklaw.
3. Pozwól butelce ostygnąć w dotyku i dodaj odpowiednie antybiotyki. Unikaj przedwczesnego zestalania agaru; Jeśli jednak butelka zbyt mocno ostygnie i roztwór zacznie zastygać, podgrzej ponownie w kuchence mikrofalowej.
   Uwaga: Nasz plazmid zawiera gen oporności na ampicylinę. W związku z tym wszystkie etapy muszą zawierać ampicylinę w stężeniu 100 μg/ml. Szczep K12 do klonowania E. coli wymaga antybiotyku tetracyklinowego (12,5 μg/ml). Komórki bakterii BL21 nie wymagają dodatkowego antybiotyku.
4. Wlej 25-30 ml roztworu do szalek Petriego o średnicy 90 mm i pozostaw do wyschnięcia.
5. Oznaczyć naczynie odpowiednimi antybiotykami i przechowywać do góry nogami w temperaturze 4 °C, z Parafilm lub w zamykanej torebce.
   Uwaga: Talerze są dobre przez około miesiąc.

3. Klonowanie plazmidu oznaczonego biotyną

Uwaga: Warunki są wykonywane aseptycznie.

1. Odkręć wektor plazmidu o masie 6 000 x g przez 3 minuty w celu osadzenia i dodaj 10 μl wysterylizowanej ultraczystej wody.
2. Usunąć 50 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli o wysokiej wydajności przemiany z -80 °C i natychmiast umieścić na lodzie na 5-10 minut.
3. Dodać 1 μl roztworu wektora o stężeniu 0,5-1 ng/50 μl komórek do 50 μl komórek E. coli i umieścić pozostały plazmid w temperaturze -80 °C.
4. Umieść komórki bakteryjne zawierające wektor na lodzie na 5 minut.
5. Szok termiczny mieszaniny komórek i wektorów przez 30-45 sekund w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i umieszczenie komórek z powrotem na lodzie na 2 minuty.
6. Dodać 250 μl super optymalnego bulionu z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC) (2% w/v bakto-tryptonu, 0,5% w/v ekstraktu bakto-drożdżowego, 8,56 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM_MgSO4, 20 mM glukozy, ultraczysta woda; pH = 7,0) i wstrząsać z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C przez 30 min.
   Uwaga: SOC nie powinien być sterylizowany w autoklawie, ale sterylizowany filtrem przez filtr 0,22 μm.
7. Suszyć płytki 10-15 minut przed posiewem komórek.
8. Pobrać pipetą 25, 50 i 100 μl roztworu komórkowego na oddzielne płytki agarowe zawierające antybiotyki ampicylinę (100 μg/ml) i tetracyklinę (12,5 μg/ml). Użyj szklanych kulek, aby równomiernie rozprowadzić roztwór na płytkach agarowych.
9. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 37 °C przez 15-18 godzin.
10. Sprawdź, czy na płytkach nie ma małych, pojedynczych kolonii bakterii i przechowuj do góry nogami w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia (Rysunek 2A).
    1. Jeśli nie ma żadnych kolonii:
       1. Sprawdź świeżość i sterylność i materiałów eksploatacyjnych.
       2. Zwiększ ilość plazmidu dodawanego do szczepu E. coli K12.
    2. Jeśli obecne są duże kolonie lub występuje ich przerost (ryc. 2B i 2C), należy ponownie pokryć nową płytkę agarową za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej lub komórek płytki o mniejszej objętości.
11. Zaszczepić 5 ml LB zawierających ampicylinę (100 μg/ml) i antybiotyki tetracyklinowe (12,5 μg/ml) pojedynczą kolonią przekształconych komórek E. coli. Komórki hodowlane przez noc w temperaturze 37 °C przy 250-300 obr./min.
12. Następnego dnia należy użyć zestawu do izolacji plazmidu w celu wyizolowania wektora docelowego z nocnego wzrostu i przechowywać oczyszczony plazmid w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
    1. Opcjonalnie: Sprawdź czystość i stężenie plazmidu za pomocą odczytu absorbancji uzyskanego przy 260 i 280 nm.

4. Przemiana plazmidu w gospodarza ekspresji

Uwaga: Warunki są wykonywane aseptycznie.

1. Powtórz kroki 3.2-3.10 dla komórek E. coli BL21 z następującymi zmianami:
   Uwaga: Komórki BL21 nie wymagają żadnych dodatkowych antybiotyków, dlatego do płytek agarowych dodaje się tylko ampicylinę w celu transformacji.
   1. Dodaj 2-5 μl wyizolowanego plazmidu w komórkach o stężeniu 0,5-2 ng/50 μl z kroku 3.12 do 50 μl komórek gospodarza z ekspresją E. coli.
   2. Ogniwa szoku cieplnego przez 60-90 sek.
   3. Wstrząsać roztworem zawierającym pożywkę SOC z prędkością 250 obr./min przez 60 minut zamiast 30 min.
2. Pobrać pojedynczą kolonię przekształconych komórek bakteryjnych z szalki Petriego za pomocą sterylnego aplikatora w patyczku i umieścić w probówce zawierającej 5 ml bulionu LB o odpowiednim stężeniu ampicyliny (100 μg/ml).
3. Umieść probówki w wytrząsarce na noc w temperaturze 37 °C przy 250 obr./min.
4. Następnego ranka weź 200 μl całonocnego wzrostu i dodaj go do 5 ml LB zawierającego ampicylinę w stężeniu 100 μg/ml.
5. Zamrozić pozostałe komórki za pomocą 250 μl 50% glicerolu (sterylnego) do 750 μl kultury i przechowywać w temperaturze -80 °C.
   Uwaga: Nowe procedury ekspresji testowej i zwiększania skali można przeprowadzić przy użyciu sterylnego aplikatora w sztyfcie w celu uzyskania zeskrobania zamrożonych komórek i zaszczepienia LB odpowiednimi antybiotykami.
6. Umieścić probówkę w wytrząsarce z prędkością 250-300 obr./min w temperaturze 37 °C, aż do pomiaru gęstości optycznej (OD) w zakresie 0,7-0,8 przy absorbancji 600 nm.
7. Indukować komórki za pomocą IPTG w końcowym stężeniu 1 mM.
8. Wstrząsaj przez dodatkowe 4 godziny w temperaturze 37 °C przy 300 obr./min. Alternatywnie ogniwa można również wstrząsać przez noc w temperaturze 18 °C przy 250-300 obr./min. Może to spowodować wyższą wydajność plazmidu w zależności od białka docelowego.
9. Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) Analiza wyrażenia testu
   1. Weź 500 μl kultury i umieść w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować z prędkością 13-15 x g przez 5 minut. Odlej ciecz sklarowaną nad osadem i oznacz jako "Rozpuszczalny". Zawiesić osad z wirowaniem w 200 μl barwnika ładującego (50 μl 2-merkaptoetanolu, 950 μl buforu do próbek Laemmli).
      Uwaga: Granulki bakterii rozpuszczalnych zostaną użyte do określenia, czy rekombinowane białko znajduje się w regionach cytoplazmatycznych komórek bakteryjnych. Granulki można przechowywać w temperaturze -80 °C bez ładowania barwnika, dopóki nie będą potrzebne. Kultura bakterii kontrolnych, która nie została przekształcona lub indukowana, może być również traktowana jako rozpuszczalna dla porównania.
   2. Weź 1 000 μl kultury i umieść w probówce o pojemności 1,5 ml. Wirować z prędkością 13-15 x g przez 5 minut. Odlej ciecz sklarowaną nad osadem i oznacz jako "Nierozpuszczalny".
      Uwaga: Nierozpuszczalne granulki zostaną poddane poniższym procedurom denaturacji w celu uwolnienia białek znajdujących się w ciałach inkluzyjnych komórek bakteryjnych. Granulki można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ich potrzebowania. Kultura bakterii kontrolnych, która nie została przekształcona lub indukowana, może być również traktowana jako nierozpuszczalna dla porównania.
      1. Zawiesić nierozpuszczalny osad w 200 μl Bugbuster i pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 minut.
      2. Ponownie odwirować próbkę o masie 13-15 x g przez 5 minut, pobrać 50 μl supernatantu i dodać go do nowej "nierozpuszczalnej" probówki o pojemności 1,5 ml.
      3. Następnie dodaj 50 μl barwnika ładującego do tej nowej próbki.
   3. Gotować zarówno rozpuszczalne, jak i nierozpuszczalne próbki przez 5 minut, aby denaturować białka do analizy SDS-PAGE.
   4. Załaduj każdą próbkę do żelu do elektroforezy za pomocą standardowej drabinki.
   5. W celu wizualizacji próbek białek należy użyć odczynnika barwiącego i postępować zgodnie z protokołem firmy.
   6. Określić, czy białko ulega ekspresji we frakcjach rozpuszczalnych i/lub nierozpuszczalnych, porównując te dwa pasy, jak również porównując pasy z rozpuszczalnymi i nierozpuszczalnymi pasami kontrolnymi (patrz uwaga 4.9.1 i 4.9.2) na żelu SDS-PAGE (rysunek 2). Wokół masy cząsteczkowej białka w rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych pasach powinien pojawić się ciemny pas. To określi, którą procedurę izolacji należy zastosować w Protokole 6.
      Uwaga: Jeśli w obu tych regionach występuje prążek, można przeprowadzić izolację zastosowaną w Protokole 6 poniżej lub wyizolować białko w obie strony w celu określenia, która metoda izolacji daje wyższą wydajność białka rekombinowanego (Rysunek 3).
   7. Jeśli przeprowadzono indukcję trwającą 4 godziny i noc, określ, która metoda indukcji ma najwyższą produkcję białka w procesie zwiększania skali (ryc. 2).

5. Procedura zwiększania skali i główna kultura

1. Przygotuj pożywkę wzrostową z 85,7 g Terrific Bulth i 28,8 ml 50% glicerolu w 1,8 l ultraczystej wody i autoklaw w cyklu płynnym przez 1 godzinę.
2. Rozpocznij hodowlę przez noc z zamrożonych komórek utworzonych w kroku 4.5.
   Uwaga: Warunki są wykonywane aseptycznie.
   1. Zmieszać 20 ml LB i z końcowym stężeniem ampicyliny w stężeniu 100 μg/ml w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 ml.
   2. Za pomocą sterylnego aplikatora w sztyfcie należy pobrać przekształcone komórki E. coli i wrzucić aplikator do kolby. Wyjmij patyczek z aplikatorem i kolbę z korkiem piankowym lub bawełnianym i przykryj folią aluminiową, aby zachować sterylność.
   3. Wstrząsać przez noc przy 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
3. Główna kultura
   Uwaga: Warunki są wykonywane aseptycznie.
   1. Wlać posiew przez noc do 1,8 l sterylnej pożywki wzrostowej i dodać ampicylinę w stężeniu 100 μg/ml i 6 do 8 kropli sterylnego środka przeciwpieniącego 204 za pomocą pipety Pasteura.
   2. Umieść kultury w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C z przefiltrowanym sprężonym powietrzem o średnicy 0,2 mm, które wlewa się do kultur przez kamienie napowietrzające.
   3. Gdy OD_{600 nm} osiągnie 0,7-0,8, indukuj za pomocą IPTG (1 mM) i pozwól na indukcję przez 4 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 18 °C, w zależności od rozpuszczalnych/nierozpuszczalnych wyników z SDS-PAGE w kroku 4.9.
4. Zbieranie komórek E. coli
   1. Odwirować hodowlę komórkową w 1 litrowych butelkach wirówkowych (2 butelki na kulturę) przez 15 minut w temperaturze 14 000 x g w temperaturze 4 °C.
   2. Odlej supernatant i za pomocą cienkiej szpatułki zgarnij granulkę bakterii do dwóch probówek o pojemności 50 ml. Komórki można ponownie granulować przez odwirowanie przez kilka minut.
      Uwaga: Każda kultura o pojemności 1,8 l da dwa granulki bakterii, po jednym w każdej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
   3. Przechowywać granulki w temperaturze -80 C do czasu izolacji białka.

6. Izolacja i oczyszczanie białka rekombinowanego

Uwaga: Jeśli białko znajduje się w regionie rozpuszczalnym na podstawie analizy SDS-PAGE z kroku 4.9, zostanie użyta "Izolacja natywna", ale dla białek nierozpuszczalnych zostaną przeprowadzone procedury "Izolacji nienatywnej".

1. Liza komórek
   1. Nienatywny
      1. Usunąć przekształcone osady E. coli z zamrażarki o temperaturze -80 °C i dodać 20 ml buforu do lizy/przemywania (Tabela 1) do każdej probówki wirówkowej.
      2. Wiruj i potrząsaj zamrożonym granulem, aż rozmrozi się i rozpuszczy w roztworze buforowym bez dużych kawałków. Inkubować na nutatorze przez noc. Następnego ranka osad powinien być teraz lepką zawiesiną z powodu denaturacji białka z bufora.
      3. Odwirować gnojowicę o sile 20 500 x g w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki w celu izolacji i wyrzucić osad.
   2. ojczysty
      1. Uzyskać przetworzone granulki E. coli z zamrażarki o temperaturze -80 °C.
      2. Dodać bufor do lizy (Tabela 1) do probówki wirówkowej, aby osiągnąć końcową objętość 30 ml i usunąć zamrożone osady poprzez rygorystyczne wirowanie i wstrząsanie. Umieść pellet na lodzie.
      3. Myć sondę sonikatora 70% etanolem o amplitudzie 100% przez 1-2 minuty. Następnie powtórz z ultraczystą wodą.
      4. Sonizować osady bakteryjne na lodzie przez 5 minut (łączny czas, który upłynął 10 minut).
         1. Ustaw sonikator na amplitudę 30% z impulsem 30 sekund wł./30 sekund wyłączonym.
         2. Bob wiruje probówkę w górę iw dół podczas przerwy sonikacji, aby całkowicie rozbić osad komórkowy. Pod koniec całkowitego czasu, który upłynął, nie powinno być widocznych osadów bakteryjnych pozostawiających żylastą, lepką zawiesinę.
         3. Wyczyść sondę sonikatora między różnymi izolacjami białek, jak również do przechowywania, używając 70% etanolu i ultraczystej wody, jak opisano w kroku 6.1.2.3.
      5. Odwirować zawiesinę w temperaturze 20 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki w celu odizolowania i wyrzucić osad.
2. Chromatografia powinowactwa Ni-NTA
   1. Nienatywny
      1. Dodać 1 ml roztworu żywicy Ni²⁺-NTA do każdej probówki wirówkowej (łącznie 2 ml żywicy na 1,8 l kultury) i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę na nutatorze.
      2. Wlać gnojowicę do kolumny powinowactwa i pozwolić, aby roztwór całkowicie spłynął przez zawór odcinający do zlewki na odpady.
      3. Wykonaj 10 płukań z 10 ml buforu do lizy/płukania na każde pranie.
         1. W przypadku pierwszych dwóch płukań dodaj 10 ml do probówki wirówkowej, aby usunąć dodatkową żywicę, a następnie wlej do kolumny. Dodatkowe płukania można dodać bezpośrednio do kolumny.
         2. Po każdym umyciu wymieszaj żywicę szklanym prętem do mieszania. Gdy płyn do płukania spłynie do zlewki na odpady, można dodać kolejne 10 ml.
      4. Po całkowitym przepłukaniu zamknij zawór odcinający, wyjmij zlewkę na odpady i zastąp probówką wirówkową o pojemności 50 ml do zbierania białka.
      5. Dodać 15 ml buforu elucyjnego (Tabela 1) i wymieszać żywicę, pozostawiając roztwór na 5 minut. Otworzyć zawór odcinający i zebrać elucję. Powtórz ponownie z dodatkowymi 15 ml.
   2. ojczysty
      1. Postępuj zgodnie z chromatografią powinowactwa nienatywnego powyżej (kroki 6.2.1.1-6.2.1.4), z wyjątkiem dostosowania następujących parametrów:
         1. Inkubować roztwór żywicy Ni²⁺-NTA w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę na nutatorze.
         2. Użyj odpowiedniego bufora do płukania (Tabela 1).
      2. Dodać 5 ml buforu elucyjnego (tabela 1) i inkubować z żywicą przez 5 minut.
         1. Otwórz zawór odcinający i zbieraj elucję, aż większość roztworu przeniknie.
         2. Dodać 90 μl/dołek odczynnika Bradford do przezroczystej płytki 96-dołkowej. Po każdej elucji pozostawić 10 μl roztworu z kolumny do studzienki zawierającej 90 μl odczynnika Bradforda.
         3. Kontynuuj dodawanie 5 ml buforu elucyjnego na raz, aż test Bradforda przestanie wykrywać białko (kolor zmienia się z ciemnoniebieskiego na jasnoniebieski do przezroczystego). Zwykle zajmuje to 4-5 objętości elucji.
3. Dializy/Renaturation
   1. Sporządzić nierodzime (renaturyzacja) i natywne do dializy (Tabela 1) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: pH dializacyjnych określa się na podstawie punktu izoelektrycznego (pI) białka docelowego. Z reguły białka powinny być buforowane co najmniej o jeden pełny punkt powyżej lub poniżej ich wartości pI.
   2. Przenieś natywne i nienatywne eluty do rurki dializacyjnej z odpowiednim odcięciem masy cząsteczkowej (25 000 MWCO dla NGF i 50 000 MWCO dla Sema3A). Umieścić każdą próbkę białka w odpowiednim buforze dializacyjnym 1 na 4 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie zastąpić odpowiednim buforem 2 na noc w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Białko musi być dializowane w każdym buforze przez co najmniej 4 godziny, aby nastąpiło prawidłowe ponowne fałdowanie i wymiana buforu.
   3. Zagęścić dializowane elucjacje białek do objętości mniejszej niż 5 ml za pomocą wirówek wirowych.
      Uwaga: Białka można dodatkowo oczyścić za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) i ponownie zagęścić.
4. Oznaczyć stężenie białka (mg/ml) przez liofilizację próbki o objętości 10-50 ml w wstępnie zważonej probówce do mikrowirówki.
   1. Opcjonalnie: określić współczynnik ekstynkcji ε, tak aby stężenie białka można było określić w przyszłych izolacjach, mierząc absorbancję próbki przy 280 nm przy użyciu prawa Beera-Lamberta: c=A_{280 nm}/εl, gdzie l jest długością drogi.

7. Biotynylacja oczyszczonego białka

1. Dializuj białka w 10 000 kaset dializacyjnych MWCO w stosunku do 10 mM Tris (pH = 8,0), zmieniając bufor co 4 godziny, co daje w sumie 6 zmian.
2. Przenieść rekombinowane białka (teraz w 10 mM buforze Tris) do probówek mikrowirówek o pojemności 2 ml w celu biotynylacji.
3. Biotynylowanie białek za pomocą zestawu ligazy białka biotyny.
4. Dializuj białka w stosunku do PBS (pH = 7,4) za pomocą 10 000 kaset dializacyjnych MWCO z 3 wymianami bufora dziennie przez 2 dni.
5. Określ procentową biotynylację białek za pomocą zestawu do oznaczania ilościowego.
6. Ponownie oznaczyć stężenie, jak opisano w ppkt 6.4 i przechowywać w temperaturze 4 °C lub podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.

Wyniki

Klonowanie i testowanie wyrażenia

Gdy posiewanie jest wykonywane prawidłowo, powinny powstawać pojedyncze izolowane kolonie, aby zwiększyć szanse na wyrwanie komórek bakterii przekształconych klonalnie (Rysunek 2A). Jeśli jednak plateruje się zbyt wiele komórek, płytki są inkubowane zbyt długo w temperaturze 37 °C lub transformacja jest wątpliwa, kolonie mogą pokrywać płytkę agarową lub tworzyć większe agregaty komórek (ryc. 2B i 2C

Dyskusja

Inżynieria białek rekombinowanych jest bardzo potężną techniką, która obejmuje wiele dyscyplin. Jest to opłacalna, dostrajalna i stosunkowo prosta procedura, pozwalająca na produkcję wysokiej wydajności specjalnie zaprojektowanych białek. Należy zauważyć, że projektowanie i ekspresja białek docelowych nie zawsze jest prosta. Podstawowa ekspresja i stabilność białka rekombinowanego zależą od konkretnych wyborów wektora, szczepów komórek E. coli , dodatków znaczników peptydowych i parametrów hodowli. Nasze specyfi...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,4-Dithio-DL-treitol, DTT, 99,5%	Chem-Impex International	127	100 g
2-hydroksyetylomerkaptan β-merkaptoetanol	Chem-Impex International	642	250 ml
Kwas octowy, lodowaty	EMD	AX0073-9	2,5 L
Agar	Bioshop	AGR001.500	500 g
Sól sodowa ampicyliny	Sigma-Aldrich	A9518	25 g
Przeciwpieniący 204	Sigma-Aldrich	A6426	500 g
Barstar-NGF pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 i mikro; g
BL21(DE3) Kompetentne komórki	Novagen	69450	1 ml; Expression Host
Bradford odczynnik	Sigma-Aldrich	B6916	500 ml
BugBuster	Novagen	70922-3	100 ml
Żel filtracyjny standard	Bio-Rad	151-1901	6 fiolek
Glycerol	Bioshop	GLY001.1	1 L
Chlorowodorek guanidyny amioformamidyny	Chem-Impex International	152	1 kg
Żywica His-Pur Ni-NTA	Thermo Scientific	88222	100 ml
Kwas solny	EMD	HX0603-3	2,5 L
Imidazol	Chem-Impex International	418	250 g
IPTG	Chem-Impex International	194	100 g
Laemmli bufor do próbek	Bio-Rad	161-0737	30 ml
Sól sodowa laurylosiarczanu, powierzchnia dodecylowa sodu	Chem-Impex International	270	500 g
LB Rosół	Sigma-Aldrich	L3022	1 kg
NovaBlue Kompetentne Komórki	Novagen	69825	1 ml; Klonowanie gospodarza
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma-Aldrich	P5368-10PAK	10 sztuk
Chlorek potasu	Chem-Impex International	01247	1 kg
Sema3A-pET-21a(+)	GenScript USA Inc.		4 i mikro; g
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060	1 L
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	1 kg
Wodorotlenek sodu	Fisher Scientific	S318-500	500 g
Fosforan sodu diabasic	Sigma-Aldrich	S5136-500G	500 g
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	S5011	500 g
Terrific Bulion	Bioshop	TER409.5	5 kg
Chlorowodorek tetracykliny	Chem-Impex International	667	25 g
Bufor Tris/Glycine/SDS, 10x	Bio-Rad	1610732	1 L
Trizma Base	Sigma-Aldrich	T1503	1 kg
Trypton, trzustka	EMD	1.07213.1000	1 kg
Ekstrakt drożdżowy, granulowany	EMD	1.03753.0500	500 g
Ä KTApurifier10	GE Healthcare	28-4062-64	Zawiera zestawy i akcesoria
Wytrząsarka orbitalna	Thermo Scientific	SHKE4000	MAXQ 4000
BirA500	Avidity	BirA500	Enzym jest dostarczany z reakcyjnymi i roztworem biotyny
Kaseta do dializy	Thermo Scientific	66380	Slide-A-Lyzer (Extra Strength)
Rurki	do dializySpectrum Laboratories	132127, 132129	MWCO: 25 000 i 50 000
Zawór przekierowania przepływu FV-923	GE Healthcare	11-0011-70
Zestaw do oznaczania ilościowego biotyny FluoReporter	Invitrogen	1094598
Stojaki na probówki Frac-950, stojak C	GE Healthcare	18-6083-13
Kolektor frakcji Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00	Zawiera zestawy i akcesoria
Cyrkulator grzewczy/chłodniczy	VWR	13271-102	Model 1156D
Piec grzewczy	Spoiwo		Model FD 115
HiLoad 16/60 Superdex 200 pg	GE Healthcare	17-1069-01	Wycofane - Produkt zamienny: Wirówka HiLoad 16/600 Superdex 200 pg
J-26 XPI Avanti	Redlica Beckman 393126
JLA 8.1 Rotor	Beckman Coulter	969329	Zawiera butelki z poliporpylenu 1 l
JS 5.3 Rotor	Beckman Coulter	368690
Okap z przepływem laminarnym	Themo Scientific	1849	Forma 1800 Series Clean Bench
Czytnik mikropłytek	TECAN		infinite M200
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	165-8004	4-żelowy pionowy system do elektroforezy
Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowane żele	Bio-Rad	456-9036	Dowolna kDa, 15-dołkowa kolumna grzebieniowa
Ni-NTA	Bio-Rad	737-2512	49 ml  objętość ECONO-Kolumna
Plasmid Miniprep	Kit Omega Bio-Tek	D6943-01
PowerPac HC Zasilacz	Bio-Rad	164-5052	250 V, 3 A, 300 W
Rurki z kopolimeru polipropylenowego okrągłego dna	VWR	3119-0050	50 ml  rury do wirnika JA 25.50
Koncentratory Spin-X UF	Corning	431488, 431483	20 i 6 ml; MWCO: 10 000 Da
usługa subklonowania	GenScript USA Inc.		Usługi białkowe
Procesor ultradźwiękowy	Cole-Parmer	18910445A	Model CV18
Vortex-Genie 2	Przemysł naukowy	SI-0236	Model G560