Artykuł metodologiczny

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

15.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51298

⸱

4 czerwca 2014

 , 
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center, 2Departments of Neurobiology and Cell Biology, Duke Institute for Brain Sciences, Duke University Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Streszczenie

Chociaż mitoza trwa krótko, jest złożonym i dynamicznym, wieloetapowym procesem, który ma fundamentalne znaczenie dla rozwoju organów, w tym mózgu. W rozwijającej się korze mózgowej nieprawidłowa mitoza neuronalnych komórek progenitorowych może powodować wady wielkości i funkcji mózgu. W związku z tym istnieje pilna potrzeba narzędzi do zrozumienia mechanizmów mitozy progenitorów neuronów. Rozwój kory mózgowej u gryzoni jest znakomitym modelem do badania tego procesu. Mitoza progenitorów nerwowych jest powszechnie badana w stałych odcinkach mózgu. Protokół ten szczegółowo oopisuje podejście do obrazowania mitozy na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu ex vivo. Opiszemy kluczowe etapy tej procedury, które obejmują: ekstrakcję mózgu, osadzanie mózgu, wibratome sekcjonowanie wycinków mózgu, barwienie i hodowlę wycinków oraz obrazowanie poklatkowe. Następnie pokażemy i szczegółowo opiszemy, jak przeprowadzić analizę mitozy po akwizycji. Dołączamy reprezentatywne wyniki tego testu przy użyciu ważnego barwnika Syto11, myszy transgenicznych (histon H2B-EGFP i centryna-EGFP) oraz elektroporacji in utero (mCherry-α-tubulina). Omówimy, w jaki sposób można najlepiej zoptymalizować tę procedurę i jak można ją zmodyfikować w celu badania genetycznej regulacji mitozy. Obrazowanie na żywo mitozy w wycinkach mózgu jest elastycznym podejściem do oceny wpływu wieku, anatomii i zaburzeń genetycznych w kontrolowanym środowisku oraz do generowania dużej ilości danych o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej. W związku z tym protokół ten uzupełni istniejące narzędzia do analizy mitozy progenitorowej neuronów.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykonywania na żywo obrazowania mitozy progenitorowej neuronów w embrionalnych wycinkach mózgu. Wykorzystując obrazowanie na żywo wycinków mózgu w hodowli, protokół ten zapewnia prostą metodę oznaczania wielu aspektów mitozy u progenitorów nerwowych w środowisku bardzo podobnym do warunków in vivo. Może być stosowany do mózgów zmutowanych zwierząt i/lub mózgów, które zostały zmanipulowane za pomocą elektroporacji in utero)1-5. Technika ta jest również idealna do testowania wpływu środków farmakologicznych na mitozę prekursorów nerwowych, po prostu dodając środek do pożywki hodowlanej. Podsumowując, ten artykuł sprawi, że technicznie trudny protokół będzie dostępny dla osób badających neurogenezę.

Podczas neurogenezy, odrębne populacje progenitorów nerwowych przechodzą precyzyjne podziały, aby wytworzyć neurony, które ostatecznie przyczyniają się do powstania sześciu warstw korowych dorosłej kory nowej6-8. Na wczesnym etapie rozwoju kory mózgowej pula prekursorów nerwowych rozszerza się, gdy komórki neuroepitelialne (NE) dzielą się symetrycznie, aby się odnowić. Komórki NE następnie przekształcają się w promieniste komórki glejowe (RGC). Początkowo RGC dzielą się symetrycznie, aby wytworzyć dwa nowe RGC, jednak podczas większości neurogenezy główny sposób podziału RGC jest asymetryczny. W podziale asymetrycznym 1 RGC powoduje powstanie nowego RGC i albo neuronu postmitotycznego, albo bardziej wyspecjalizowanego progenitora (albo krótkiego prekursora nerwowego (SNP), zewnętrznego promieniowego gleju (ORG), albo pośredniego progenitora (INP)2,3,7,9. INPs, SNP i ORG mogą następnie generować neurony odpowiednio w subkomorowych, komorowych i podstawnych obszarach kory mózgowej. W związku z tym podział komórek progenitorowych jest podstawowym procesem generowania neuronów kory nowej.

Liczne badania wskazują na korelację między specyficznymi cechami mitotycznymi RGC a losem komórek potomnych. Haydar i in. oraz Takahashi i wsp. wykazali, że czas trwania mitozy RGC i długość cyklu komórkowego zwiększają się wraz z postępem neurogenezy, co znalazło odzwierciedlenie w badaniach uzupełniających10-13. Wiele badań sugeruje, że orientacja wrzeciona mitotycznego względem komory wpływa na aspekty neurogenezy i kortykogenezy, w tym typy generowanych neuronów i lokalizację potomstwa w mózgu, odpowiednio3,10,14-16. To, czy orientacja płaszczyzny rozszczepienia bezpośrednio wpływa na los komórki, jest kontrowersyjne, ale wniosek pozostaje, że ten parametr mitotyczny wpływa na neurogenezę. Kolejnym podkreśleniem znaczenia mitozy jest obserwacja, że wiele genów zaangażowanych w mechanikę mitozy ma kluczowe znaczenie dla neurogenezy i prawidłowego rozwoju mózgu17-20.

Mitoza jest procesem dynamicznym, jednak do tej pory większość badań szczegółowo opisujących mitozę progenitorów nerwowych wykorzystuje analizę stałych odcinków tkanek lub obrazowanie progenitorów nerwowych za pomocą hodowli komórek in vitro. Tak więc główne metody oceny mitozy zapewniają jedynie migawkę tego procesu i nie odkrywają, jak zachowują się komórki w tkance. Obrazowanie na żywo mitozy progenitorowej neuronów staje się coraz bardziej krytycznym narzędziem do zrozumienia funkcji progenitorów neuronalnych. Przykłady można znaleźć w tych odnośnikach4,8,10,21-25. Opublikowano kilka znakomitych protokołów przygotowania i obrazowania wycinków mózgu26,27. Jednak do tej pory kompleksowy protokół obrazowania i analizy mitozy nie został opisany ani zademonstrowany na wideo.

Ta technika oferuje kilka istotnych zalet w porównaniu z ustaloną analizą sekcji mózgu. Analiza poklatkowa wycinków mózgu umożliwia generowanie znacznie większej liczby punktów danych, które można analizować w elastyczny sposób. Po pierwsze, dane są zbierane w poszczególnych punktach czasowych w ciągu kilku minut lub kilku godzin. Można analizować poszczególne punkty czasowe (aby stworzyć statyczny montaż) lub łączyć różne punkty czasowe w filmy. Po drugie, obrazowanie konfokalne wycinków umożliwia generowanie danych w różnych sekcjach Z w wycinkach mózgu. Dzięki temu można analizować poszczególne sekcje. Alternatywnie, stosy poszczególnych sekcji można łączyć w projekcję o maksymalnej intensywności. Po trzecie, analiza jest wykonywana w kontekście tkanki, ujawniając, w jaki sposób komórki dzielą się względem sąsiednich komórek i struktur. Po czwarte, idealnie nadaje się do analizy mutantów, które wykazują pewne dowody na defekty mitotyczne. Łącznie protokół ten pomoże wyjaśnić kluczowe kroki, aby pomóc badaczom, którzy chcą przeprowadzić obrazowanie na żywo mitozy progenitorowej neuronów we własnych laboratoriach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie podłoża (Rysunek 1, Krok 1)

  1. Pożywka do kultur plastrowych
    1. 25 ml pożywki do hodowli plastrów wystarcza do przygotowania 5 naczyń ze szklanym dnem po 2 plastry na dołek.
    2. Do stożkowej probówki o pojemności 50 ml dodać 250 μl roztworu 100x N2 i 500 μl 50 ml roztworu 50x B27 bez witaminy A. Dodać DMEM/F12 do objętości 22,5 ml.
    3. Przefiltrować roztwór sterylizacyjny, a następnie dodać 1,25 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej i 1,25 ml płodowej surowicy bydlęcej.
    4. Inkubować roztwór w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez czas przygotowania plastrów.
    5. Dodać czynniki wzrostu (FGF i EGF, końcowe stężenie odpowiednio 10 ng/ml i 20 ng/ml) bezpośrednio przed rozpoczęciem hodowli. Skład tej pożywki został zoptymalizowany w celu promowania przetrwania komórek w hodowli i zwiększenia tempa proliferacji neuronalnych komórek progenitorowych. Zmaksymalizuje to w ten sposób prawdopodobieństwo zaobserwowania komórek mitotycznych w wycinku.
  2. Pełne rozwiązanie do preparowania HBSS
    1. Przygotować 500 ml pełnego HBSS, dodając 50 ml 10x HBSS, 1,25 ml 1 M Hepes (pH 7,4, FC 2,5 mM), 6 ml 2,5 M D-Glucose (FC 30 mM), 2,2 ml 0,9 MNaHCO3 (FC 4 mM) i autoklawowane diH2O do końcowej objętości 500 ml.
    2. Przefiltrować, wysterylizować roztwór i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu pobrania rogów macicy od ciężarnej myszy. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele tygodni.
    3. Utrzymuj HBSS na lodzie podczas całej procedury preparacji.
  3. Rozwiązanie do osadzania
    1. Do osadzenia 4 embrionalnych mózgów należy przygotować 30 ml 3% niskotopliwej agarozy w pełnym roztworze HBSS. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dodać 0,9 g niskotopliwej agarozy i pełnego HBSS do 30 ml.
    2. Wymieszaj roztwór z mikserem wirowym i rozpuść w kuchence mikrofalowej ze stojącą rurką i otwartą nakrętką.
    3. W kuchence mikrofalowej monitoruj roztwór, aby zapobiec przelaniu się z powodu nadmiernego wrzenia. Gdy rozpocznie się wrzenie, zatrzymaj kuchenkę mikrofalową i zmieszaj roztwór.
    4. Powtarzaj te kroki, aż cała agaroza się rozpuści.
    5. Przechowywać probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C.

2. Sekcja zarodków (Rysunek 1, Krok 2)

  1. Po starannej eutanazji ciężarnej myszy zbierz rogi macicy i przenieś je na 10 cm2 szalkę Petriego zawierającą zimny pełny 1x HBSS. Wiek zarodka może się różnić w zależności od badania. Protokół ten został z powodzeniem zastosowany do hodowli wycinków mózgu od dni embrionalnych E12.5 do E17.5. Ze względu na swój rozmiar młodsze mózgi są zwykle trudniejsze do pracy.
  2. Zebrać zarodki i wypreparować mózgi embrionalne, jak opisano wcześniej u szczurów i myszy26,27, aż do uzyskania pełnego mózgu embrionalnego, w tym tyłomózgowia i przodomózgowia z dwiema półkulami mózgowymi. Mogą one być przechowywane w RT do czasu, aż wszystkie mózgi zostaną wypreparowane.
  3. Zebrać zarodki i wypreparować mózgi embrionalne, jak opisano wcześniej u szczurów i myszy26,27, aż do uzyskania pełnego mózgu embrionalnego, w tym tyłomózgowia i przodomózgowia z dwiema półkulami mózgowymi. Mogą one być przechowywane w RT do czasu, aż wszystkie mózgi zostaną wypreparowane.

3. Osadzanie embrionalnych mózgów (Rysunek 1, Krok 3)

  1. W wiadrze zawierającym lód utwórz otwór w lodzie, do którego włożysz formy do zatapiania.
  2. Wlej 3% pożywkę agarozową do plastikowej foremki i umieść tę formę w otworze przygotowanym w lodzie.
  3. Mieszać pożywkę agarozową z końcówką termometru cyfrowego, aż temperatura osiągnie 35 °C.
  4. Natychmiast przenieś mózg do podłoża osadzającego.
  5. Krok krytyczny: Aby usunąć nadmiar HBSS na granicy między mózgiem a agarozą, ostrożnie i delikatnie obracaj kilkakrotnie mózg w roztworze do osadzania za pomocą kleszczy.
  6. Poduszka z zżelowanej agarozy utworzy się na dnie formy w kontakcie z lodem. Gdy poduszkę będzie można wyczuć czubkiem kleszczy, jednocześnie mieszając mózg, ustaw mózg grzbietową stroną do góry. Mózg nie powinien zapadać się na samo dno formy.

4. Przygotowanie bloku agarozy (Rysunek 1, Krok 4)

  1. Pozwól agarozie stwardnieć w lodzie przez co najmniej 5 minut.
  2. Za pomocą żyletki pokrój rogi formy.
  3. Ostrożnie wytnij blok agarozy wokół mózgu za pomocą żyletki. Staraj się zminimalizować liczbę cięć, aby uniknąć zakłóceń w osadzonym mózgu.
  4. Upewnij się, że blok ma większą powierzchnię w okolicy ogonowej mózgu (w przeciwieństwie do obszaru rostralnego, patrz Rysunek 1, Krok 4), aby zwiększyć stabilność bloku na cokole do sekcji.
  5. Ostatnie cięcie powinno być tym po ogonowej stronie mózgu; to cięcie określi prawidłową płaszczyznę przekroju za pomocą wibratomu.
  6. Zrób to, ustawiając ostrze prostopadle do osi ostro-ogonowej mózgu i bloku agarozowego. Przesuń ostrze doogonowo wzdłuż osi ostro-ogonowej i wykonaj ostateczne cięcie około 5 mm od najbardziej ogonowego obszaru mózgu.
  7. Odłóż na bok blok agarozy/mózgu i powtórz osadzanie innych mózgów.

5. Przeniesienie osadzonych mózgów do tacy wibratomu (Rysunek 1, Krok 5)

  1. Dodaj kroplę kleju na dno tacki z wibratomem. Umieść klej tak, aby bloki agarozy znalazły się w zasięgu wibrującego ostrza.
  2. Umieść blok agarozy/mózgu stroną ogonową do dołu na krawędzi szpatułki, tak aby około 50% bloku przechyliło się poza krawędź szpatułki.
  3. Przyłóż powierzchnię ogonową bloku agarozy do kleju i zsuń szpatułkę, przytrzymując blok agarozy na dnie tacy ramieniem pęsety. Nie pozwól, aby szpatułka bezpośrednio stykała się z klejem.
  4. Pozostaw klej do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez 5 minut.

6. Podział osadzonych mózgów (Rysunek 1, Krok 6)

  1. Napełnij tackę wibratomu HBSS.
  2. Określ pozycję początkową i końcową ostrza wibratomu.
  3. Wygeneruj plastry o wielkości 200 - 250 μm. W przypadku wibratomu VT1000s użyj następujących parametrów: prędkość 2 - 4, częstotliwość 8.
  4. Ostrożnie usuń plastry z wibratomu podczas ich krojenia. Przenieś plastry szpatułką i tylny koniec pęsety do 12-dołkowych naczyń wypełnionych pełnym HBSS. Alternatywnie, niektórzy badacze używali pędzla zamiast pęsety. Kluczowy punkt: Podczas przenoszenia należy uważać, aby wycinki mózgu pozostały przyczepione do otaczającej je agarozy.

7. Syto11 Barwienie plastrów (Rysunek 1, Krok 7)

  1. Rozcieńczyć Syto11 do końcowego stężenia 0,5 - 1 μM w pożywce do hodowli warstw uzupełnionej czynnikami wzrostu.
  2. W studzience na płytce 12-dołkowej inkubować plastry z jednego mózgu w 2,5 ml roztworu barwiącego przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  3. Umyj plastry w 2,5 ml pożywki do kultur plastrów bez roztworu barwiącego przez 20 minut.

8. Montaż plastrów w naczyniu ze szklanym dnem (Rysunek 1, Kroki 8, 9)

  1. Przygotuj 15 μl roztworu kolagenu do zatapiania na plasterek. Przygotować roztwór kolagenu o stężeniu 1,5 mg/ml, mieszając 375 μl roztworu kolagenu typu I o stężeniu 3 mg/ml z 75 μl 10x DMEM, 9,4 μl 1 M NaOH i 290 μlH2O. Przechowywać na lodzie.
  2. Umieść 15 μl kropli roztworu kolagenu na dnie naczynia Microwell o średnicy 35 mm ze szklanym dnem. Rozprowadź go za pomocą końcówki pipety, aby dopasować go do wielkości plasterka.
  3. Przenieś plasterek do kropli kolagenu za pomocą szpatułki i pęsety. Kluczowy punkt: Montaż wielu plastrów w różnych naczyniach zwiększa prawdopodobieństwo uzyskania plasterków odpowiednich do obrazowania. Przesiewaj różne wycinki i wybierz te, które najlepiej spełniają kryteria opisane poniżej w sekcji "Reprezentatywne wyniki".
  4. Pozostawić plastry do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed przeniesieniem ich do inkubatora o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  5. Po 20 minutach dodaj 1,2 ml pożywki hodowlanej w plastrach do naczynia Microwell ze szklanym dnem. Jednorazowo dodawać po 600 μl podłoża i rozprowadzać końcówką do pipet.
  6. Uchwyć obraz wycinka mózgu w małym powiększeniu, aby zarejestrować poziom anatomiczny i integralność wycinka.

9. Obrazowanie na żywo warstw (Rysunek 1, Kroki 10, 11)

  1. Pozostawić plastry do odzyskania w inkubatorze przez co najmniej 1 godzinę i 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przed obrazowaniem na żywo.
  2. Zobrazuj plastry za pomocą wybranego mikroskopu, pamiętając, że Syto11 jest bardzo podatny na fotowybielanie. W tym przypadku używany jest mikroskop konfokalny z odwróconym dyskiem wirującym (mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem Andor XD). Alternatywnie można użyć laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Poniższe parametry dotyczą konfiguracji mikroskopu z wirującym dyskiem.
  3. Podczas całej sesji obrazowania na żywo utrzymuj plastry w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnej komorze inkubacyjnej podłączonej do mikroskopu.
  4. Komórki obrazowe z obiektywem z olejem krzemowym 60X o odległości roboczej 300 μm i aperturze numerycznej 1,3 (przykłady patrz rysunki 3B, 3C, 3E, 3F, 4A, 4B). Można również użyć obiektywu olejowego 100X o odległości roboczej 130 μm i aperturze numerycznej 1,4 (na przykład patrz rysunek 4C). Rozdzielczość kamery wynosi 512 x 512.
  5. Wyobraź sobie komórki w stosie z o wielkości 30 μm, przy czym środek stosu z znajduje się około 40 μm poniżej powierzchni wycinka. Próba zobrazowania głębiej w tkance może spowodować, że obiektyw zwiększy mechaniczny nacisk na plasterek. Może to wpłynąć na integralność wycinka mózgu. Jeśli planujesz wykonanie rekonstrukcji 3D komórek, należy użyć interwału z nie większego niż 2 μm.
  6. Dostosuj moc lasera i czasy naświetlania, aby ograniczyć fotowybielanie. Używaj czasów naświetlania w zakresie od 30 do 200 ms, w zależności od intensywności sygnału Syto11.
  7. Dzięki zmotoryzowanemu stolikowi możesz obrazować wiele pozycji na wielu plasterkach zamontowanych w 1 naczyniu. Na przykład wyobraź sobie do 20 pozycji rozrzuconych po 4 różnych plasterkach w 1 pojedynczym naczyniu.
  8. W przypadku obrazowania na żywo należy użyć rozdzielczości czasowej krótszej niż 5 minut, aby umożliwić identyfikację różnych faz mitozy. Stosując Syto11 i/lub histon H2B-EGFP, 4 - 5 godzin obrazowania na żywo wystarcza do zaobserwowania znacznej liczby komórek mitotycznych. Jeśli jednak obrazowanie ma słabo znakowane komórki mitotyczne (takie jak te uzyskane przez elektroporację in utero), wówczas dłuższy parametr obrazowania (przez noc) jest odpowiedni i działa dobrze.
    Uwaga: Korzystając z tego protokołu, zazwyczaj obserwujemy średnio 10 komórek mitotycznych na pozycję. Jak wspomniano powyżej, obrazowanie wielu zamontowanych warstw zwiększa prawdopodobieństwo udanego eksperymentu. Dzięki takiemu podejściu zazwyczaj identyfikujemy komórki mitotyczne w praktycznie wszystkich eksperymentach przeprowadzonych z Syto11 lub histonem H2B-EGFP.

10. Analiza mitozy po przejęciu (Rysunek 2)

Wszystkie procedury w tej sekcji zostały zoptymalizowane w Fidżi (ImageJ), co jest korzystne, ponieważ jest to darmowe oprogramowanie open source. Dostępne są inne rozwiązania programowe do wykonywania tych samych zadań, takie jak Metamorph, Imaris i Amira.

  1. Identyfikacja figur mitotycznych na Fidżi
    1. Po otwarciu zestawu danych dla jednej pozycji jako "hiperstosu", wybierz jedną płaszczyznę z (patrz rysunek 2A, aby zapoznać się z lokalizacją paska przewijania), w której tkanka i komórki wyglądają zdrowo (patrz kryteria w sekcji dyskusji). Przewiń wymiar czasowy, aby zidentyfikować komórki przechodzące przez anafazę, ponieważ jest to najłatwiejsza do zidentyfikowania faza mitotyczna.
    2. Przewiń w czasie, aby zidentyfikować punkt czasowy, w którym komórka wchodzi w mitozę (kondensację DNA). Komórka może poruszać się w płaszczyznach z, ale rozdzielczość czasowa i parametry stosu z opisane wcześniej zostały zoptymalizowane, aby umożliwić ten proces.
    3. W arkuszu kalkulacyjnym zapisz współrzędne 4D komórki w hiperstosie (X, Y, Z i czas, patrz rysunek 2A, aby wyświetlić lokalizację tych figur w interfejsie Fidżi), gdy wchodzi ona w mitozę. Znajomość tych współrzędnych zapobiegnie wielokrotnemu liczeniu tej samej komórki.
    4. Przewiń do przodu w czasie i zarejestruj czas, w którym komórka przechodzi z jednej fazy do drugiej. Udokumentuj czas trwania każdej fazy mitotycznej dla jednej danej komórki.
    5. Kontynuuj pracę z innymi komórkami w pełnym zestawie danych (wiele komórek w obrębie i między pozycjami).
  2. Rekonstrukcja 3D komórek i kwantyfikacja rotacji podczas metafazy (na podstawie Haydar i wsp., 2003) (ryc. 2B).
    1. Po zidentyfikowaniu wielu komórek mitotycznych użyj współrzędnych komórki i przewiń do przodu w czasie, aż do początku metafazy.
    2. Obróć cały "hyperstack" tak, aby granica komory była płaska (za pomocą polecenia "Image/Transform/Rotate..."). Użyj narzędzia "kąt", aby określić kąt, który ma zostać zastosowany do tego obrotu.
    3. Zidentyfikuj płaszczyznę z, w której komórka zainteresowania jest najbardziej widoczna. Na tej płaszczyźnie użyj narzędzia "zaznaczenie prostokąta", aby narysować zaznaczenie obejmujące całą komórkę.
    4. Zidentyfikuj płaszczyzny z, które zawierają komórkę zainteresowania. Użyj polecenia "Obraz/Duplikat", aby utworzyć "pod-stos". W oknie dialogowym pozostaw zaznaczoną opcję "Duplikuj hiperstos". Parametr "Plasterki (z)" odpowiada płaszczyznom z obejmującym całą komórkę, a parametr "Klatki (t)" odpowiada bieżącemu punktowi czasowemu.
    5. Jeśli rozdzielczość jest słaba, zwiększ rozmiar "stosu podrzędnego" za pomocą polecenia "Obraz/Dostosuj/Rozmiar...".
    6. Wygeneruj rekonstrukcję 3D komórki w bieżącym punkcie czasowym za pomocą polecenia "Obraz/Stosy/Projekt 3D...". Parametry tego polecenia są wyświetlane na rysunku 2B. "Odstępy między warstwami" odpowiadają odstępowi między każdym z obrazów w płaszczyźnie z (μm). Ważne: upewnij się, że wymiar fizyczny (μm) stosu podrzędnego został zachowany. W przeciwnym razie interpolacja pikseli w wymiarze z będzie nieprawidłowa, a rekonstrukcja 3D będzie niedokładna.
    7. Za pomocą paska przewijania obróć powstałą rekonstrukcję 3D tak, aby krawędź płytki metafazowej była widoczna. Numer ramy odpowiada kątowi beta opisanemu na rysunku 3B, zapisz tę liczbę. Za pomocą narzędzia "kąt" i polecenia "Analizuj/Mierz..." zmierz kąt między poziomem a linią przecinającą prostopadle płytkę metafazową (Rysunek 2B). To jest kąt alfa.
    8. Zapisz te kąty dla wszystkich punktów czasowych metafazy komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Kąt obrotu pomiędzy punktami czasowymi (t) i (t-1) jest równy wartości bezwzględnej różnicy między kątem w (t) a tym kątem w (t-1).
  3. Pomiar orientacji płaszczyzny łupliwości
    1. 3D zrekonstruuj interesującą komórkę w jednym punkcie czasowym podczas anafazy, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi dla rekonstrukcji 3D płytek metafazowych.
    2. Obracaj rekonstrukcję, aż widoczne będą krawędzie dwóch płytek utworzonych przez segregujące chromosomy.
    3. Użyj narzędzia kąta, aby zmierzyć kąt między poziomem (krawędzią komory) a linią równoległą do dwóch płytek utworzonych przez segregujące chromosomy. Jest to kąt płaszczyzny łupliwości (rysunek 2C).
  4. Generowanie filmów
    1. Ponieważ komórki często poruszają się w różnych płaszczyznach z, zidentyfikuj płaszczyzny z zajmowane przez komórkę podczas sesji obrazowania na żywo. Wygeneruj "Projekcję maksymalnej intensywności" tych płaszczyzn z za pomocą polecenia "Obraz/Stosy/Projekcja Z...". Zapisz wynikowy stos jako plik ". TIF".
    2. Otwórz ten plik w wersji 1.45 ImageJ, ponieważ Fidżi nie zawiera stabilnej wtyczki do generowania plików ".mov" lub ".avi".
    3. Użyj polecenia "File/Save as/..." programu ImageJ, aby wygenerować film w formacie zgodnym z Twoimi aplikacjami podrzędnymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powodzenie tego testu oraz obserwacja wielu komórek mitotycznych podczas jednej sesji obrazowania na żywo zależą w dużej mierze zarówno od integralności, jak i poziomu anatomicznego skrawka, w którym wykonywane są pomiary. Jak omówiono poniżej, poziom anatomiczny skrawka jest istotnym czynnikiem. Rycina 3A przedstawia lokalizacje w osiach przód-tył oraz przyśrodkowo-bocznej, w których osiągnięto największy sukces. Dodatkową dyskusję na ten temat można znaleźć w pracy Noctora26. Integralność sk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Główną zaletą opisanego przez nas protokołu jest to, że zapewnia on dynamiczną czasową rozdzielczość mitozy neuronalnych komórek progenitorowych. Zazwyczaj testy w celu wizualizacji mitozy w rozwijającym się mózgu są wykonywane przy użyciu immunofluorescencji utrwalonych odcinków tkanki. Ale to podejście zapewnia migawkę mitozy tylko w jednym punkcie czasowym.

Istnieje kilka kroków, które są najbardziej krytyczne dla obrazowania mitozy w wycinkach mózgu: 1) Plasterki mózgu powinny pozostać prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie z NINDS/NIH, R00-NS064197 i NINDS/NIH, R01NS083897 (oba dla D.L.S.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Technologie 100X N2Life17502048do pożywki
hodowlanej 50X B27 bez witaminy ATechnologie życia12587010do pożywki hodowlanej
DMEM/F12Technologie życia11320033dla pożywki
hodowlanej Inaktywowana termicznie surowica końskaSigma AldrichH1138-500mldo podłoża hodowlanego
Inaktywowana termicznie surowica cielęcaSigma AldrichF4135-500MLdo podłoża hodowlanego
FGFR& D Sytems3139-FB-025do pożywki hodowlanej
EGFdo pożywki
hodowlanej 10X HBSSLife technologies14065-056do sekcji zarodków
Hepes Free AcidSigma AldrichH4034rozcieńczony do 1 M (pH 7,4)
2,5 M D-GlucoseSigma AldrichG8769do rozwarstwienia zarodków
0,9 M NaHCO3Life technologies25080-094do preparacji zarodków
Agaroza niskotopliwaFisherBP165-25do generowania plastrów
Syto11Life technologiesS7573Make 5µ l podwielokrotności
3 mg/ml kolagen typu ITechnologie życiaA1048301do hodowli plastrów
Naczynie ze szklanym dnemMatTekP35G-1.5-14-Cdo hodowli plastrów Szalki
Petriegodo preparacji zarodków Termometr
do pomiaru temperatury agarozy
Szpatułkado Pędzel do przenoszenia mózgów
Alternatywadla transferu mózgów
VibratomeLeicaVT1000sdo generowania plasterków Mikroskop
preparacyjnyWycinanie zarodków
do obrazowaniaWymagany jest mikroskop konfokalny, który musi być wyposażony w komorę inkubacyjną
cyfrowy Mikroskop

Bibliografia

  1. Gal, J. S., et al. Molecular and morphological heterogeneity of neural precursors in the mouse neocortical proliferative zones. J Neurosci. 26, 1045-1056 (2006).
  2. Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. Journal of Neuroscience. 30, 7028-7036 (2010).
  3. Konno, D., et al. Neuroepithelial progenitors undergo LGN-dependent planar divisions to maintain self-renewability during mammalian neurogenesis. Nat Cell Biol. 10, 93-101 (2008).
  4. LoTurco, J. J., Manent, J. -B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19 Suppl 1, (2009).
  5. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Dev Growth Differ. 50, 499-506 (2008).
  6. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146, 18-36 (2011).
  7. Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. Journal of Neuroscience. 25, 247-251 (2005).
  8. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409, 714-720 (2001).
  9. Wang, X., Tsai, J. -W., Lamonica, B., Kriegstein, A. R. A new subtype of progenitor cell in the mouse embryonic neocortex. Nat Neurosci. 14, 555-561 (2011).
  10. Haydar, T. F., Ang, E., Rakic, P. Mitotic spindle rotation and mode of cell division in the developing telencephalon. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2890-2895 (2003).
  11. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  12. Pilaz, L. -J., et al. Forced G1-phase reduction alters mode of division, neuron number, and laminar phenotype in the cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 21924-21929 (2009).
  13. Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
  14. LaMonica, B. E., Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Mitotic spindle orientation predicts outer radial glial cell generation in human neocortex. Nature Communications. 4, 1665 (2013).
  15. Postiglione, M. P., et al. Mouse Inscuteable Induces Apical-Basal Spindle Orientation to Facilitate Intermediate Progenitor Generation in the Developing Neocortex. Neuron. 72, 269-284 (2011).
  16. Silver, D. L., et al. The exon junction complex component Magoh controls brain size by regulating neural stem cell division. Nat Neurosci. 13, 551-558 (2010).
  17. Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci USA. , 107-16595 (2010).
  18. Feng, Y., Walsh, C. A. Mitotic spindle regulation by Nde1 controls cerebral cortical size. Neuron. 44, 279-293 (2004).
  19. Megraw, T. L., Sharkey, J. T., Nowakowski, R. S. Cdk5rap2 exposes the centrosomal root of microcephaly syndromes. Trends Cell Biol. 21, 1-11 (2011).
  20. Bond, J., et al. A centrosomal mechanism involving CDK5RAP2 and CENPJ controls brain size. Nat Genet. 37, 353-355 (2005).
  21. Shu, T., et al. Doublecortin-like kinase controls neurogenesis by regulating mitotic spindles and M phase progression. Neuron. 49, 25-39 (2006).
  22. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic Interactions between Intermediate Neurogenic Progenitors and Radial Glia in Embryonic Mouse Neocortex: Potential Role in Dll1-Notch Signaling. Journal of Neuroscience. 33, 9122-9139 (2013).
  23. Hu, D. J. -K., et al. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, 1300-1313 (2013).
  24. Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Publishing Group. 7, 136-144 (2004).
  25. Tyler, W. A., Haydar, T. F. Multiplex Genetic Fate Mapping Reveals a Novel Route of Neocortical Neurogenesis, Which Is Altered in the Ts65Dn Mouse Model of Down Syndrome. Journal of Neuroscience. 33, 5106-5119 (2013).
  26. Noctor, S. C. Time-Lapse Imaging of Fluorescently Labeled Live Cells in the Embryonic Mammalian Forebrain. CSH Protoc. , (2011).
  27. Elias, L., Kriegstein, A. R. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  28. Shitamukai, A., Konno, D., Matsuzaki, F. Oblique radial glial divisions in the developing mouse neocortex induce self-renewing progenitors outside the germinal zone that resemble primate outer subventricular zone progenitors. Journal of Neuroscience. 31, 3683-3695 (2011).
  29. Hadjantonakis, A. -K., Papaioannou, V. E. Dynamic in vivo imaging and cell tracking using a histone fluorescent protein fusion in mice. BMC Biotechnol. 4, 33 (2004).
  30. Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells. Transgenic Res. 13, 155-164 (2004).
  31. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. R. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2007).
  32. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
  33. Yang, Y. -T., Wang, C. -L., Van Aelst, L. DOCK7 interacts with TACC3 to regulate interkinetic nuclear migration and cortical neurogenesis. Nat Neurosci. 15, (2012).
  34. Siegenthaler, J. A., et al. Retinoic Acid from the meninges regulates cortical neuron generation. Cell. 139, 597-609 (2009).
  35. Schenk, J., Wilsch-Bräuninger, M., Calegari, F., Huttner, W. B. Myosin II is required for interkinetic nuclear migration of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 16487-16492 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza mitozyprzygotowanie skrawk w m zgusekcjonowanie w wibrotomiemikroskopia poklatkowabarwienie Syto11Histone H2B EGFPCentrin EGFPelektroporacja in utero

Powiązane artykuły