Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Summary

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Abstract

Wykrywanie impedancji podłoża elektrycznego (ECIS) to system pomiaru impedancji in vitro do ilościowego określania zachowania komórek w przylegających warstwach komórkowych. W tym celu komórki są hodowane w specjalnych komorach hodowlanych na przeciwległych, okrągłych złotych elektrodach. Między elektrodami doprowadzany jest stały, mały prąd przemienny i mierzony jest potencjał w poprzek. Właściwości izolacyjne błony komórkowej tworzą opór wobec przepływu prądu elektrycznego, co powoduje zwiększenie potencjału elektrycznego między elektrodami. Pomiar impedancji komórkowej w ten sposób umożliwia zautomatyzowane badanie przyczepienia, wzrostu, morfologii, funkcji i ruchliwości komórek. Chociaż sam pomiar ECIS jest prosty i łatwy do nauczenia, podstawowa teoria jest złożona, a wybór odpowiednich ustawień oraz prawidłowa analiza i interpretacja danych nie są oczywiste. Nie jest jednak dostępny jasny protokół opisujący poszczególne etapy od projektu eksperymentu do przygotowania, realizacji i analizy eksperymentu. W artykule omówiono podstawową zasadę pomiaru, a także możliwe zastosowania, rozważania eksperymentalne, zalety i ograniczenia systemu ECIS. Podano przewodnik do badania przyczepiania się komórek, rozprzestrzeniania się i proliferacji; kwantyfikacja zachowania komórek w warstwie zlewającej się, z uwzględnieniem funkcji bariery, ruchliwości komórek, jakości adhezji komórka-komórka i komórka-substrat; oraz kwantyfikacja gojenia się ran i odpowiedzi komórkowych na bodźce wazoaktywne. Reprezentatywne wyniki omówiono w oparciu o ludzkie komórki mikronaczyniowe (MVEC) i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), ale mają zastosowanie do wszystkich przylegających komórek wzrostu.

Introduction

ΩΩHadzimy Wykrywanie Impedancji Ogniwa Elektrycznego (Electric Cell-substrate Impedance Sensing), znaną jako ECIS, specyficzną metodę pomiaru i analizy widma impedancji przylegających komórek w hodowli¹. Celem tego protokołu jest zaoferowanie ogólnie stosowanego przewodnika dotyczącego korzystania z tego konkretnego typu testów komórkowych opartych na impedancji oraz dostarczenie protokołów dla niektórych kluczowych funkcji ze stale rosnącej liczby aplikacji. Nacisk zostanie położony na badanie proliferacji komórek, funkcji bariery, połączeń komórkowych i ruchliwości komórek.

Ponieważ ECIS i związany z nim model przekształcania danych ze spektroskopii impedancyjnej w parametry biologicznie istotne zostały wprowadzone w obecnej formie do społeczności naukowej przez Giaevera i Keese'a w 1991 roku², często były one określane jako system do pomiaru TEER (trans-epithelial electrical resistance), który nie jest dokładny. Różnice na pierwszy rzut oka wydają się marginalne, ale są istotne dla interpretacji danych. W przypadku klasycznych pomiarów TEER komórki są hodowane na przepuszczalnych filtrach, aby scharakteryzować mechanizmy transportu parakomórkowego, które są zdominowane przez nabłonkowe połączenia ścisłe lub połączenia przylegające do śródbłonka³. Zwykle dwie elektrody umieszczone powyżej i poniżej filtra są używane do doprowadzania przepływu prądu stałego (DC) przez warstwę ogniwa, a dwie inne elektrody do pomiaru wynikowego spadku napięcia⁴. Rezystancję elektryczną oblicza się za pomocą prawa Ohma, które pozwala na numeryczny opis jakości bariery komórkowej.

ECIS przestrzega tej podstawowej zasady i ją rozszerza. W systemie ECIS komórki są hodowane na przeciwległych, okrągłych złotych elektrodach, które są osadzone na dnie specjalnych szalek do hodowli komórkowych. Liczba elektrod w studzience hodowlanej jest zmienna, w zależności od zastosowania, a elektrody mają standardową średnicę 250 μm; W niektórych przypadkach do uzupełnienia obwodu używana jest większa przeciwelektroda. ECIS wykorzystuje stały prąd przemienny (AC) o natężeniu 1 μA o określonej częstotliwości zamiast prądu stałego. Impedancję oblicza się na podstawie odpowiednich zmian napięcia (w mV) między elektrodami. ECIS oferuje możliwość pomiaru impedancji w zakresie częstotliwości w celu zbadania właściwości komórkowych zależnych od częstotliwości, co ma kilka zalet w porównaniu z TEER i zostanie szczegółowo wyjaśnione w tym artykule. Po pierwsze, pomiar impedancji złożonej pozwala na rozdzielenie całkowitej impedancji na rezystancję bariery komórkowej i pojemność ogniwa. Ponadto, biorąc dane z wielu częstotliwości i stosując model matematyczny, można rozróżnić impedancję połączeniową (szczelność kontaktów komórka-komórka) i impedancję spowodowaną interakcjami komórka-substrat (odległość błony komórkowej podstawy od macierzy poniżej), a także udział pojemności błony komórkowej. Po drugie, można ocenić proliferację i ruchliwość komórek, ponieważ komórki są w bezpośrednim kontakcie z elektrodami. Po trzecie, podłoże i elektrody są wystarczająco cienkie, aby umożliwić mikroskopię z kontrastem w jasnym polu i fazie.

Podstawa pomiarów impedancji: Impedancja złożona

Podstawą pomiaru impedancji elektrycznej obiektów biologicznych (np. komórek) jest prawo Ohma, podstawowa zasada elektrotechniczna, która opisuje zależność między rezystancją (R), prądem (I) i napięciem (U) w obwodzie elektrycznym w danym czasie (t).
Ma zastosowanie w obwodzie prądu stałego: R (t) = U (t) / I (t)

Podczas pracy w systemie AC, prąd i napięcie różnią się nie tylko amplitudą, ale także fazą (φ). Teraz opór nie wystarcza już do opisania tych relacji. Zamiast tego impedancja zespolona (Z) lub w większości przypadków wielkość impedancji (|Z|) zawierają opisaną wcześniej rezystancję omową plus reaktancję (X), która wynika z przepływu prądu przemiennego przez kondensatory i cewki indukcyjne napędzające przesunięcie fazowe między napięciem a prądem⁵,
Ma zastosowanie w obwodzie prądu przemiennego: |Z(f)| = √(R²+X(f)²)
φ = arctan(X/R)

Podczas wykonywania pomiarów impedancji na nienaruszonych komórkach, ze względu na charakterystykę ich błony, komórki działają jak równoległe połączenie rezystora i kondensatora. Tutaj rezystancja reprezentuje opozycję do przepływu prądu, podczas gdy pojemność (C) opisuje separację nośników elektrycznych na dwuwarstwie izolacyjnej błony komórkowej, która powoduje polaryzację komórki. Tym samym X jest zdominowany przez właściwości pojemnościowe błony komórkowej.
X(f) ≈ (_komórka 2*Pi*f*C)^-1

Ponieważ X jest zależne od częstotliwości, zmiana częstotliwości pomiaru umożliwia badanie różnych funkcjonalnych i strukturalnych właściwości komórki. Urządzenie ECIS mierzy zarówno R, jak i X, co pozwala na obliczenie |Z|, C i φ.

Kwantyfikacja całych warstw komórek za pomocą spektroskopii impedancyjnej: Elektryczny obwód równoważny.

Jak wcześniej wyjaśniono, gdy komórka zostaje poddana działaniu pola elektrycznego, wykazuje właściwości pasywnych komponentów elektronicznych. Jeśli teraz, zamiast pojedynczego ogniwa, bada się całą warstwę ogniwa wyhodowaną na elektrodach i uzupełnioną pożywką do hodowli komórek, prosty model rezystora i kondensatora musi zostać rozszerzony na całą sieć elektryczną. W tym tak zwanym obwodzie zastępczym należy wziąć pod uwagę rezystancję pożywki hodowlanej (R_Med), jak również pojemność (C_Electr) i rezystancję (R_Electr) charakteryzujące oddziaływanie elektroda/elektrolit^3,6.

Uproszczony, ogólny przykład takiego równoważnego obwodu dla przylegającej warstwy komórek rosnących można znaleźć na rysunku 1. Zaletą takiego matematycznego podejścia do opisu systemu biologicznego jest to, że obwody te mogą być udoskonalone ad libitum i dostosowane do konkretnych zagadnień eksperymentalnych, np. poprzez uwzględnienie impedancji powodowanej przez organelle wewnątrzkomórkowe lub rozróżnienie wpływu adhezji komórka-komórka (R_Junc) i komórka-substrat (R_Sub) na impedancję ogólną^7,8. Niemniej jednak celem modelowania powinno być zawsze wykorzystanie jak najmniejszej liczby elementów opisujących wszystkie cechy mierzonego widma impedancji, aby umożliwić miarodajne korelacje.

Rysunek 1. Schemat systemu ECIS i reprezentatywnego obwodu zastępczego dla przylegającej warstwy komórek wzrostu. A) Dobrze przekrój kultury ECIS. Komórki rosną na czujniku i przeciwelektrodzie i są pokryte pożywką hodowlaną. Elektrody są podłączone do wzmacniacza typu lock-in, a sygnał AC jest podawany przez rezystor 1 MΩ w celu wytworzenia źródła prądu stałego. Bodźce można dodawać bezpośrednio do pożywki hodowlanej w dowolnym momencie. B) ECIS mierzy sumę wszystkich indywidualnych wkładów w impedancję. Rezystancja pożywki hodowlanej (R_Med) oraz impedancja wywołana przez granicę faz elektroda/elektrolit, która dla uproszczenia jest przedstawiona jako równoległe połączenie rezystora (R_Electr) i kondensatora (C_Electr), a także właściwości elektryczne błony komórkowej, opisane równoległym połączeniem rezystancji (_{R Cell}) i pojemności (C_Mem), Wszystkie muszą być brane pod uwagę. _Komórka R jest zmienna, ponieważ zależy od przepuszczalności ogniwa w stosunku do prądu. Równoważny obwód może być rozszerzany i udoskonalany ad libitum. Na przykład do obwodu dodano rezystancję złączeniową (R_Junc) oraz podśródbłonkową (R_Sub). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Parametry impedancji i ich znaczenie biologiczne

Dwa najbardziej bezpośrednie parametry wynikające z pomiarów impedancji to rezystancja i pojemność komórek. Rezystancja reprezentuje jakość i funkcję bariery komórkowej, a zatem uwzględnia opór wobec przepływu prądu para- i transkomórkowego. Pojemność zapewnia ogólną miarę pokrycia elektrodami. Charakterystyczną cechą ECIS jest to, że za pomocą równoważnych obwodów i modelowania tych globalnych parametrów można uzyskać wgląd w wiele innych właściwości komórkowych, w tym adhezje komórka-komórka i komórka-substrat, które zostaną omówione w dalszej części tego artykułu.

Przed rozpoczęciem: Rozważania eksperymentalne

Ustawienia pomiaru - Konfiguracja składa się z kilku oddzielnych komponentów: urządzenie ECIS z elektroniką pomiarową; Komputer do akwizycji danych; uchwyt matrycy do systemu 8- lub 96-dołkowego; ECIS i wybraną hodowlę komórkową. Uchwyt matrycy musi być umieszczony w inkubatorze i podłączony do urządzenia ECIS na zewnątrz inkubatora. Komputer musi być wyposażony w oprogramowanie ECIS (1.2.123.0 z 14 lutego 2013 r.) i podłączony do urządzenia ECIS.

Wybór tablic - Istnieje stale rosnąca różnorodność tablic ECIS, przeznaczonych do wielu zastosowań. Standardowe tablice to tablice 8W1E i 8W10E, które składają się z 8 studzienek hodowlanych (oznaczonych przez W) składających się odpowiednio z 1 lub 10 elektrod pomiarowych (oznaczonych przez E). Obwód uzupełnia duża przeciwelektroda, ale jej impedancja jest zasadniczo pomijalna w rzeczywistym pomiarze⁶. Standardowy uchwyt na 8-dołkową matrycę może pomieścić dwie matryce, co daje łączną liczbę 16 dołków hodowlanych. Złote elektrody mają grubość 50 nm, są otoczone folią izolacyjną i zamontowane na optycznie przezroczystym podłożu z poliwęglanu Lexan lub na płytce drukowanej (PCB). Macierze PCB są bardziej wytrzymałe i ekonomiczne. Przezroczyste szkiełka pozwalają na mikroskopię świetlną i immunofluorescencyjną. Należy wziąć pod uwagę, że matryca 1E zwiększa wahania sygnału oporu spowodowane ruchami komórek i jest potrzebna do badań nad gojeniem się ran. Ponadto pojedyncze elektrody umożliwiają korelację sygnałów elektrycznych i optycznych. W układach wieloelektrodowych sygnał jest uśredniany na kilku elektrodach, co ze względu na zwiększony obszar pomiarowy obejmuje więcej komórek w pomiarze, ogranicza odchylenie danych spowodowane nierównomierną inokulacją i wzrostem komórek oraz zmniejsza rozmycie sygnału spowodowane ruchami komórek. Dlatego matryce wieloelektrodowe są przydatne do badania proliferacji komórek i tworzenia bariery. Oprócz standardowych matryc dostępne są specjalne matryce do zastosowania naprężenia ścinającego⁹, do badania chemotaksji¹⁰, migracji komórek i proliferacji, a także płytki 96-dołkowe do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Podsumowując, macierz, która ma być użyta, jest silnie zależna od kwestii naukowej i typu ogniwa i powinna być starannie wybrana i przetestowana.

Częstotliwość pomiaru - Modelowanie Rb i alfa (patrz analiza danych) wymaga pomiarów wieloczęstotliwościowych (MFT). W przeciwnym razie impedancja może być mierzona w czasie przy jednej częstotliwości specyficznej dla typu ogniwa (SFT), z tą zaletą, że dane mogą być zbierane z wyższą rozdzielczością czasową. Najbardziej czułą częstotliwość pomiaru dla określonego typu ogniwa można znaleźć za pomocą skanów częstotliwości. Podczas wykreślania impedancji lub rezystancji w funkcji częstotliwości na wykresie logarytmicznym, częstotliwość, w której różnica między elektrodą bezkomórkową a elektrodą pokrytą ogniwem jest największa, to częstotliwość, w której ogniwa najskuteczniej blokują prąd. W przypadku komórek śródbłonka (EC) częstotliwość ta wynosi około 4 kHz.

Gęstość zasiewu - Jak w każdym regularnym eksperymencie opartym na komórkach, gęstość zasiewu zależy od problemu naukowego. Badając adhezję i rozprzestrzenianie się lub tworzenie bariery, komórki śródbłonka należy wysiać o dużej gęstości 40 000-60 000 komórek/cm², aby zagwarantować zlewającą się, stabilną barierę po 48 godzinach. Jeśli eksperyment koncentruje się na proliferacji, komórki śródbłonka powinny być zasiane o niskiej gęstości około 2 000-10 000 komórek/^cm2.

Protocol

1. Przygotowanie systemu pomiarowego

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy rozgrzać uchwyt matrycy w inkubatorze do temperatury 37 °C, aby zapobiec kondensacji.
2. Napełnij trumnę z wodą inkubatora wodą destylowaną, aby uniknąć wysuszenia studni.
3. Wykonuj wszystkie manipulacje na komórkach i macierzach w komorze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

2. Przygotowanie tablic i inokulacja komórek

UWAGA: Tablice ECIS muszą zostać oczyszczone i ustabilizowane przed eksperymentem, aby zapobiec dryfowaniu elektrod, poprawić odtwarzalność sygnału do szumu i stosunek sygnału do szumu. Dlatego dostępne są dwie opcje: A) wstępna obróbka elektrod L-cysteiną i B) funkcja stabilizacji ECIS.

Opcja A: L-cysteina jest zalecana jako najbardziej konsekwentna obróbka wstępna, ale w niektórych szczególnych przypadkach może wchodzić w interakcje z powłokami białkowymi na elektrodach. Prezentowane objętości są używane dla standardowych macierzy 8-dołkowych.

1. Dodać 200 μl/basenik 10 mM L-cysteiny. Cysteina czyści i modyfikuje powierzchnię elektrody, zapewniając wysoką i powtarzalną pojemność elektrody.
2. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Przemyć dwukrotnie 500 μl/studnię ultraczystą wodą (typ 1). Nie należy stosować fosforanowych, które mogą zakłócać adsorpcję niektórych białek. Unikaj również roztworów zawierających surowicę przed powlekaniem, ponieważ złota powierzchnia będzie adsorbować pierwsze makrocząsteczki, które wejdą w kontakt.
4. Posmarować 200 μl/dobrze ogrzaną 1% żelatyną.
5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
6. Usuń żelatynę, ale nie pozwól, aby powierzchnia wyschła. Może to spowodować uszkodzenie elektrod.
7. Umyj raz ultraczystą wodą (typ 1).
8. Dodać 400 μl/dobrze kompletną pożywkę do hodowli komórkowych (zawierającą surowicę, antybiotyki i wszystkie czynniki wzrostu).
9. Wsuń matrycę do uchwytu macierzy i upewnij się, że tablica jest ustawiona w taki sposób, że dziewięć złotych kwadratowych padów jest prawidłowo stykanych przez sprężynowe kołki pogo i dokręć regulacyjną ręcznie. Uważaj na przezroczyste tablice, warstwa złota może zostać łatwo uszkodzona.
10. Otwórz oprogramowanie pomiarowe i naciśnij Setup, a następnie Check w sekcji "Zbierz dane", aby wykonać szybki pomiar impedancji każdego dołka. Uzyskane wartości są linią bazową pomiaru i zostaną automatycznie zapisane w "Komentarzach".
11. Kontrola odwiertu automatycznie określi rodzaj użytych tablic ECIS. Sprawdź wybrane tablice w sekcji "Konfiguracja studni".
12. Schemat tablicy świeci na zielono dla prawidłowo podłączonych studni i na czerwono dla pustych lub nieprawidłowo podłączonych studni. Mimo to zawsze upewnij się, że tablice zostały prawidłowo umieszczone w uchwycie.
    UWAGA: Jeśli czyszczenie i powlekanie się powiodło, matryce 8W1E ECIS mają pojemność około 5 nF, a matryce 8W10E 50 nF, co daje rezystancję bazową odpowiednio około 2 000 i 200 Ω.
13. Usuń tablicę z uchwytu.
14. Komórki nasienne w postaci zawiesiny jednokomórkowej w 400 μl/studzienkę kompletnej pożywki do hodowli komórkowych.

Opcja B: Funkcja stabilizacji ECIS może być użyta jako alternatywa lub w połączeniu z leczeniem L-cysteiną i w przypadku wystąpienia problemów z dryftem elektrody lub dużych różnic w rezystancji i pojemności well-to-well.

1. Wykonaj leczenie cysteiną (opcjonalnie) i wstępnie pokryj elektrody białkiem (opcjonalnie).
2. Dodać 200 μl/studzienkę kompletnego podłoża do każdej studzienki i umieścić tablicę w uchwycie matrycy.
3. Otwórz oprogramowanie pomiarowe i naciśnij Setup, a następnie Sprawdź, aby upewnić się, że matryca jest prawidłowo podłączona i zmierzyć początkowe Z, R i C.
4. Ustabilizuj elektrody, naciskając Stabilizuj w sekcji "Zbierz dane". ECIS zastosuje impuls o wysokim natężeniu prądu (ok. 3 mA) i wysokiej częstotliwości (64 kHz) w celu oczyszczenia elektrod.
5. Sprawdź ponownie elektrody. Pojemność powinna być zwiększona, a wartości rezystancji powinny mieścić się w porównywalnym zakresie.
6. Jeśli wartości pojemności i rezystancji nadal nie są zadowalające, powtórz stabilizację.
7. Wyjmij tablicę z uchwytu i zaszczep komórki.

3. Konfiguracja oprogramowania pomiarowego i akwizycji danych

1. Umieść tablicę w uchwycie tablicy, jak opisano wcześniej.
2. Otwórz oprogramowanie pomiarowe i naciśnij przycisk Setup w sekcji "Zbieranie danych", aby połączyć oprogramowanie ECIS z instrumentem ECIS i uruchomić kolejną kontrolę odwiertu.
3. Sprawdź wybrane tablice w sekcji "Konfiguracja studni".
4. Wybierz studnie do pomiaru w sekcji "Konfiguracja studni".
5. Wybierz tryb pomiaru z opcji "Zbieraj dane":
   1. W przypadku szeregów czasowych o stałej częstotliwości wybierz opcję Pojedyncza częstotliwość / czas (SFT) i wybierz częstotliwość pomiaru z menu rozwijanego.
   2. Aby zmierzyć pokrycie elektrodą i modelować Rb i Alfa, wybierz opcję Multiple Freq. / Time (MFT). Urządzenie ECIS będzie dokonywać pomiarów automatycznie na wszystkich dostępnych częstotliwościach.
   3. W przypadku mikroruchu (patrz analiza danych) wybierz Rapid Time Collect (RTC) i dostosuj częstotliwość pomiaru oraz częstotliwość próbkowania. W tym przypadku standardowa rozdzielczość czasowa to jedna próbka na sekundę (1 Hz), ale częstotliwość próbkowania można również zwiększyć, aby śledzić szybkie zmiany impedancji do 25 Hz (dla Z-Theta). Ważna uwaga: w trybie RTC mierzony jest tylko jeden studzienek.
      UWAGA: Jeśli konieczne jest zmierzenie mikroruchu w kilku dołkach później, przejdź do Pomocy > Pokaż ekspercki pasek narzędzi/elementy menu > Zdobądź > Multi-Well RTC. Określ limit czasu (godz.) w sekcji Zbieranie danych; ECIS będzie teraz mierzył wybrane odwierty w kolejności numerycznej. Po rozpoczęciu pomiaru oprogramowanie poprosi o określenie liczby cykli. Wprowadź wartość określającą, jak często pomiar musi być powtarzany.
6. W przypadku SFT i MFT wybierz przedział czasu (s) między pomiarami lub jeśli dane muszą być pozyskiwane tak szybko, jak to możliwe, pozostaw tę opcję niezaznaczoną.
   UWAGA: Aby uzyskać dane, urządzenie ECIS wykorzystuje multiplekser do przełączania się z jednego dołka na drugi z minimalną szybkością akwizycji SFT wynoszącą 0,25 sekundy i 7,5 sekundy dla MFT. Oznacza to, że interwał jest zależny od liczby wybranych dołków i częstotliwości. W przypadku pomiarów na wolno proliferujących komórkach lub prostego zapisu rezystancji w funkcji czasu należy stosować interwały 600 sekund lub więcej.
7. Naciśnij Start, nazwij plik i wybierz lokalizację, w której chcesz przechowywać dane.
   UWAGA: Rozmiar pliku nie powinien stanowić problemu, ponieważ dane ECIS są zapisywane w formie zwykłego tekstu o nazwie *.abp, który nigdy nie przekracza kilkuset MB, nawet przy wybranych wszystkich częstotliwościach pomiarów i liczbie studzienek.
8. Zatrzymaj bieg, naciskając przycisk Zakończ.

4. Zmiana medium i manipulacja komórkami

1. Naciśnij pauzę, spowoduje to zatrzymanie pobierania danych, ale będzie kontynuowane uruchamianie zegara eksperymentalnego.
2. Wyjmij matrycę z uchwytu i manipuluj nią pod stołem z przepływem laminarnym (tj. zmień medium).
3. Umieść tablicę z powrotem w uchwycie i kliknij przycisk Sprawdź połączenie lub Wznów eksperyment, aby kontynuować pobieranie danych. Oprogramowanie pomiarowe umieści znacznik czasu w zestawie danych.

5. Ostra stymulacja podczas pozyskiwania danych

UWAGA: Drugą opcją jest manipulowanie komórkami podczas zbierania danych w celu śledzenia natychmiastowych zmian. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy próbki nie muszą być sterylne w dalszym przebiegu eksperymentu.

1. Dodaj bodziec bezpośrednio do studzienki i upewnij się, że mieszasz ostrożnie z pipetą o pojemności 200 μl.
2. Zaznacz punkt czasu ręcznie, naciskając Zaznacz i dodaj komentarz.

6. Zranienie elektryczne

UWAGA: Znalezienie odpowiednich ustawień dla używanego typu ogniwa ma kluczowe znaczenie dla uzwojenia elektrycznego. Jeśli uwijanie jest zbyt krótkie, może to spowodować niewystarczające usunięcie komórek, natomiast jeśli uzrażanie jest zbyt długie i/lub szorstkie, może to spowodować uszkodzenie elektrod (szczególnie na przezroczystych matrycach). Dlatego zaleca się kilka krótkich impulsów nawijania. W przypadku hodowli HUVEC za optymalne uznano dwa 10-20 sekundowe impulsy nawijania o napięciu 5 V przy 60 kHz każdy przy użyciu ECIS 1600R. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się stosowanie wysokich częstotliwości >20 kHz w celu utrzymania jednolitych wysokich pól w ogniwach i uniknięcia uszkodzenia elektrod.

1. Wykonać zranienie podczas aktywnego pomiaru ECIS.
2. Włącz konfigurację nawijania / elektroporacji, a następnie kliknij Nawijanie i wprowadź czas (s), napięcie uzwojenia (V dla 1,600 R) lub prąd (μA dla Z i Z-Theta) i częstotliwość (Hz). Wyświetlane wartości domyślne są oparte na typie macierzy i urządzenia ECIS.
3. Wybierz studnie do nawijania w sekcji "Konfiguracja studni". Tylko sprawdzone studnie zostaną zranione.
4. Włącz opcję Opóźnienie do godziny i wypełnij czas opóźnienia, aby aktywować funkcję opóźnienia nawijania. Funkcję tę można zatrzymać w dowolnym momencie, naciskając przycisk Stop lub ręcznie nakładając ranę. W danym momencie może być aktywne tylko jedno polecenie opóźnienia.
5. Naciśnij Aktywuj i kliknij OK w wyskakującym okienku, aby rozpocząć ranienie.
6. Upewnij się, że sygnał rezystancji spada do impedancji przesunięcia po uzwojeniu, w przeciwnym razie powtórz uzwojenie.

7. Analiza danych

1. Reprezentacja i eksport danych.
   1. Zakończ pomiar lub załaduj zestaw danych za pomocą Plik -> Otwórz.
   2. Wybierz studnie do wyświetlenia w oknie "Konfiguracja studni". Grupuj poszczególne studnie, aby przedstawić średnią.
   3. Wybierz parametr, który ma być wyświetlany z górnego paska narzędzi (Z, R lub C).
   4. Wybierz typ wykresu z górnego paska narzędzi (T = czas, F = częstotliwość, 3D = plama wodospadu).
   5. Zdefiniuj przesunięcie i zakres wykresu za pomocą suwaków poniżej okna wykresu lub wypełnij dokładne wartości w sąsiednich kontrolkach.
   6. Wybierz jedną z podstawowych opcji "Opcje szeregów czasowych" w sekcji "Analizuj", aby wykonać odchylenie standardowe, średnią bieżącą lub normalizację danych.
   7. Aktywuj pasek narzędzi Ekspert w menu Pomoc, aby uzyskać bardziej zaawansowane operacje, takie jak wykres Nyuista i transformacja Fouriera.
   8. Użyj opcji "Opcje wyświetlania" w sekcji "Analizuj", aby zdefiniować zakres osi x i y oraz wyeksportować wykres.
   9. Eksportuj wybrane dane do pliku Excel za pomocą opcji Plik -> Eksportuj dane -> Do Excela (wybrane) i użyj wybranego oprogramowania innej firmy do dogłębnej analizy, statystyk i reprezentacji w razie potrzeby.
2. Modelowanie Rb i Alpha.
   UWAGA: Do modelowania zaleca się użycie bezkomórkowego, wypełnionego medium dobrze jako odniesienia.
   1. Zakończ pomiar MFT lub załaduj zestaw danych MFT.
   2. Jeśli dostępna jest studnia referencyjna bez komórek, naciśnij przycisk Znajdź, aby automatycznie wybrać wartość odniesienia, lub Ustaw, aby ręcznie wybrać punkt czasu wolnego od komórek z opcji "Freq. Scan Modeling" w sekcji "Analizowanie".
   3. Jeśli nie ma odwołania bez komórek, zaimportuj wartość odwołania z innego zestawu danych. Otwórz zestaw danych referencyjnych (upewnij się, że użyto tej samej tablicy i nośnika) i użyj polecenia Znajdź lub Ustaw, aby wybrać wartość odwołania. Następnie przejdź do zmierzonych danych i naciśnij Pobierz.
   4. Jeśli nie ma dostępnego zestawu danych referencyjnych bez komórek, należy użyć domyślnych ustawień fabrycznych.
   5. Naciśnij przycisk Model, aby rozpocząć obliczenia. Modelowanie może potrwać kilka minut w zależności od rozmiaru zestawu danych.
3. Obliczanie mikroruchu.
   UWAGA: Obliczenia te nie są częścią oprogramowania pomiarowego, ale można je wykonać za pomocą dowolnego oprogramowania do przetwarzania sygnałów.
   1. Zakończ pomiar RTC lub załaduj zestaw danych RTC.
   2. Normalizuj zestaw danych według uśrednionego oporu z całego okresu.
   3. Podziel zestaw danych na segmenty o długości 256 punktów danych i wyczyść każdy segment za pomocą okna Hanninga.
   4. Uruchom 256-punktową transformację Fouriera i uśrednij wynikowe widma częstotliwości do jednostronnego 129-punktowego widma mocy, aby zminimalizować losowy szum i wzmocnić sygnał biologiczny.
   5. Wykreślić częstotliwość w funkcji amplitudy na wykresie logarytmicznym i zastosować dopasowanie liniowe metodą najmniejszych kwadratów.
   6. Nachylenie dopasowania liniowego jest miarą ogólnego szumu w sygnale, a tym samym mikroruchu komórek.

Results

Przygotowanie eksperymentu jest dość proste, a sam pomiar jest w pełni automatyczny, ale jak to często bywa, kluczowa jest prawidłowa analiza i interpretacja danych. W sekcji dotyczącej danych reprezentatywnych znajduje się przewodnik dotyczący interpretacji najważniejszych parametrów dostarczanych przez spektroskopię impedancyjną z ECIS. Będzie to pomocne w podjęciu decyzji, w odniesieniu do jakiego rodzaju problemu naukowego pomiar ECIS może być przydatny i jakie parametry powinny być rejestrowane.

Typowy eksperymentalny odczyt można ogólnie podzielić na fazę wzrostu po inokulacji komórek i fazę plateau, gdy komórki osiągają konfluencję. Każda z tych faz dostarcza informacji o różnych właściwościach komórkowych. Reprezentatywny pomiar pokazano na rysunku 2 i podzielono na cztery podfazy w celu analizy A) adhezji, rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek; B) tworzenie bariery EC dla dojrzewania; C) migracja komórek po wytworzeniu rany elektrycznej; oraz D) odpowiedź komórkowa na stymulację czynnikiem wazoaktywnym trombiną. Obrazy kontrastu fazowego i immunofluorescencji uzyskano bezpośrednio z elektrody pomiarowej podczas różnych podfaz, aby zilustrować związek między pokryciem elektrody, stanem ogniwa i zarejestrowanym sygnałem impedancji.

Przyczepność, rozprzestrzenianie się i proliferacja

Każdy typ komórki ma swoją charakterystyczną krzywą adhezji i wzrostu, którą można manipulować poprzez zmianę gęstości wysiewu, pokrycie białkami macierzy zewnątrzkomórkowej lub inne bodźce. Jedną z głównych trudności w badaniu tych procesów jest rozróżnienie między adhezją, rozprzestrzenianiem się i proliferacją. Wegener i wsp.¹¹ podano szczegółowy opis zastosowania kombinacji rezystancji i pojemności w celu rozróżnienia tych parametrów, a na rysunku 3 staje się oczywiste, w jaki sposób rezystancja i pojemność mogą się wzajemnie uzupełniać. Dla badania adhezji i rozprzestrzeniania się ważne jest zrozumienie wpływu częstotliwości pomiaru, ponieważ tutaj pole elektryczne powoduje polaryzację błony komórkowej komórek w zawieszeniu⁸, co wymusza przepływ prądu wyłącznie wokół komórek. Kiedy ogniwa się łączą, zaczynają ograniczać przepływ prądu, rozchodząc się po elektrodzie, a pojemność zmniejsza się w sposób liniowy wraz z procentem otwartej powierzchni na elektrodzie (obszar ułamkowy). W związku z tym adhezję, rozprzestrzenianie się i proliferację można najlepiej określić ilościowo przy rejestrowaniu pojemności przy częstotliwości wyższej niż 40 kHz (rysunek 3B), gdzie spadek pojemności jest wprost proporcjonalny do pokrycia elektrody. Alternatywnie, rezystancja przy najbardziej czułej częstotliwości pomiarowej jest bezpośrednią miarą różnicowania i dojrzewania komórek w zlewającą się barierę (ryc. 3A). Oprócz obszaru ułamkowego, Wegener i in. wprowadzili dwa inne parametry do ilościowego określenia adhezji i pokrycia elektrod: t_1/2 (połowa maksymalnej pojemności), czyli czas do momentu, gdy 50% elektrody zostanie pokryte ogniwami (rysunek 3B, insercja) oraz nachylenie krzywej pojemności (s, nie pokazane) jako szybkość rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek.

Odporność jako miara jakości bariery

Rezystancja to część impedancji, która najlepiej opisuje jakość i funkcjonalność bariery, ponieważ pomija komponenty pojemnościowe z membrany, elektrody i medium. W tym miejscu używa się terminu jakość bariery, a nie przepuszczalność, ponieważ przepuszczalność jest z definicji zależna tylko od kontaktów komórka-komórka. Oporność jest jednak określana przez zdolność komórek i ich interakcji komórka-komórka i komórka-macierz do blokowania przepływu prądu. W związku z tym różne typy komórek (klony i pasaże) mają swoje specyficzne wartości oporności (ryc. 4A). Chociaż rezystancja daje znacznie jaśniejsze wyobrażenie o barierze komórkowej, zawsze należy brać pod uwagę sygnał impedancji.

Modelowanie Rb i Alpha

Oprogramowanie ECIS posiada szczególną cechę, możliwość modelowania dwóch parametrów, które rozróżniają zrosty komórka-komórka i komórka-matryca (Rysunki 4B i 4C). Rb (w cm² x om), to rezystywność styków komórka-komórka z przepływem prądu, a zatem odwrotna miara przepuszczalności klasycznej. Wysokie Rb oznacza niską przepuszczalność w stosunku do przepływu prądu. Alfa (w cm x omie^0,5) jest miarą wkładów impedancji wynikających ze złączy ogniwo-elektroda. Model do ilościowego określania kontaktów komórka-komórka i komórka-matryca został wprowadzony w 1991 roku przez Giaevera i Keese'a i opiera się na założeniu, że komórki są okrągłymi obiektami w kształcie dysku, które mają membranę izolacyjną, unoszą się nad elektrodą i są wypełnione przewodzącym elektrolitem². Właściwości izolacyjne błony komórkowej pozostawiają tylko trzy drogi dla prądu: a) między brzuszną powierzchnią komórek a elektrodą, b) między kontaktami komórka-komórka i c) przez komórki (prawdopodobne tylko wtedy, gdy używana jest wysoka częstotliwość pomiaru). Bardziej szczegółowe wyprowadzenie i wyjaśnienie można znaleźć w pracach Lo i wsp. ^3,12.

Mikroruch

Wykazano, że małe wahania sygnału rezystancji (Rysunek 4A) są spowodowane subtelnymi, przypadkowymi ruchami komórek w zlewających się warstwach komórek, jak również komórkami poruszającymi się na elektrodzie i poza nią w rzadkich hodowlach². Ten aspekt danych ECIS dotyczących przebiegu czasowego opisany przez Lo i Opp i wsp.^13,14 jest często pomijane i najlepiej widoczne podczas pomiarów za pomocą matryc 1E i przy najbardziej czułej częstotliwości, aby uwzględnić para- i subkomórkowe ścieżki prądowe. Obliczanie tego szumu wywołanego przez komórkę (mikroruch) nie jest częścią standardowego oprogramowania pomiarowego, chociaż w najnowszej wersji zintegrowana jest szybka transformacja Fouriera (FFT). Zapis danych RTC z częstotliwością próbkowania 1 Hz przez 1 godzinę przy 4 kHz zapewnia wystarczającą rozdzielczość do obliczenia mikroruchu EC. To obliczenie zapewnia jedną wartość i może być bezpośrednio wykorzystane do analizy statystycznej. Obszerną dyskusję na temat wykorzystania analizy częstotliwości w mikroruchach można znaleźć w innym miejscu¹⁵. Alternatywnie do FFT można zastosować inne strategie analizy, takie jak wariancja przyrostów. Wariancja jest bardziej wrażliwa na małe zmiany w mikroruchu, ale z powodu tej wrażliwości porównanie poszczególnych eksperymentów staje się trudne. Nachylenia widma mocy są bardziej wiarygodnym pomiarem mikroruchów (rysunek 4D). Tutaj obszar pod krzywą można zobaczyć jako ilość mikroruchu lub szumu wytwarzanego przez komórki. W związku z tym im bardziej strome nachylenie widma mocy, tym mniejszy obszar pod krzywą i mniejszy mikroruch.

Elektryczny test gojenia ran

Aby badać migrację komórek, zazwyczaj mechaniczne rany są nakładane poprzez zdrapywanie komórek z płytki hodowlanej za pomocą końcówek pipet, skrobaków do komórek lub specjalnych stempli i śledzenie ich remigracji pod mikroskopem¹⁶. Ta metoda ma oczywistą wadę polegającą na tym, że wielkość rysy jest różna i zwykle jest zbyt duża, aby pominąć wpływ proliferacji komórek na proces gojenia się ran. Funkcja nawijania ECIS wykorzystuje impuls o wysokim napięciu i wysokiej częstotliwości, aby uzyskać elektrodę wolną od ogniw, a następnie następuje remigracja sąsiednich komórek w celu zastąpienia komórek śmierci (rysunek 5A). Przewagą tej zautomatyzowanej metody nad standardowymi, pracochłonnymi testami zarysowania jest to, że ECIS wytwarza wysoce powtarzalną ranę o precyzyjnej średnicy 250 μm, która zamyka się w ciągu kilku godzin, w celu zbadania czystej migracji. Ponadto impuls elektryczny nie usuwa powłoki białkowej i wydzielanej macierzy zewnątrzkomórkowej. Przy założeniu, że komórki remigrują na elektrodzie ze wszystkich stron, szybkość migracji można łatwo obliczyć, dzieląc promień rany przez czas potrzebny do zamknięcia rany¹⁷. Jako alternatywę dla zranień elektrycznych niedawno wprowadzono tzw. metodę ogrodzenia elektrycznego (nie pokazano). W tym przypadku impulsy o wysokim natężeniu prądu zapobiegają przyłączaniu się i migracji komórek na elektrodach po inokulacji. Ogniwa będą rosły wokół elektrody pomiarowej i zaczną migrować do wewnątrz, gdy tylko impulsy elektryczne zostaną wyłączone. Przewagą ogrodzenia elektrycznego nad zranieniem elektrycznym jest to, że powierzchnia elektrody nie została zmieniona przez wzrost lub usunięcie komórki, co jest ważne do pomiaru wpływu różnych powłok na migrację komórek.

Stymulacja komórek

Oprócz badania migracji komórek, spektroskopia impedancyjna doskonale nadaje się do pomiaru wpływu leków i toksyn na komórki. Rycina 5B przedstawia klasyczny eksperyment stymulacji/hamowania, w którym trombinę zastosowano do wywołania nadmiernej przepuszczalności w zbiegającej się barierze EC poprzez kurczenie się i tworzenie luk w komórkach, co objawia się przejściowym spadkiem oporności. Poprzez preinkubację z inhibitorem kinazy Rho Y-27632 większość odpowiedzi trombiny jest zmniejszona poprzez obniżenie podstawowego napięcia komórkowego¹⁸ i zablokowanie tworzenia włókien stresowych¹⁹. Następnie bloker kinazy Rho stosowano w różnych punktach czasowych po dodaniu trombiny, co doprowadziło do natychmiastowego i całkowitego przywrócenia bariery EC. W tym miejscu oczywista staje się zaleta systemu ciągłego pomiaru impedancji do badania ostrych odpowiedzi komórkowych. W regularnych testach końcowych (np. barwienie immunofluorescencyjne lub pasaż makrocząsteczek) ta ostra odpowiedź na zastosowany bloker byłaby bardzo trudna, jeśli nie niemożliwa, do wykrycia i określenia ilościowego. Ważne jest, aby pamiętać, że przy pomiarach impedancji opisana jest przepuszczalność w kierunku jonów, a nie w kierunku makrocząsteczek. Proszę zapoznać się z Aman i wsp.²⁰, gdzie przedstawiono doskonałe porównanie pomiarów ECIS z doświadczeniami pasażu makromolekuł.

Rysunek 2. Pomiar reprezentatywny. MVEC hodowano na pokrytych żelatyną matrycach 8W1E o niskiej gęstości wysiewu 5 000 komórek/^cm2, a zapis MFT prowadzono przez 10 dni. Pomiar ilustruje różne odczyty doświadczenia ECIS: A) adhezja, rozprzestrzenianie się i proliferacja; B) tworzenie i dojrzewanie zlewającej się bariery komórkowej; C) gojenie się ran po założeniu rany elektrycznej; D) stymulacja czynnikiem wazoaktywnym trombiną. Dwie strzałki wskazują średnie orzeźwienie, które zostało wykonane w odstępach 4-dniowych i dają wyobrażenie o czułości pomiarów na bodźce mechaniczne oraz zmiany temperatury i pH. Obrazy w górnym panelu odpowiadają pomiarowi i zostały pozyskane bezpośrednio z elektrody pomiarowej. Obraz z kontrastem fazowym po lewej stronie pokazuje komórki śródbłonka 24 godziny po inokulacji, zaczynając pokrywać elektrodę. Obrazy immunofluorescencyjne w środku i po prawej stronie przedstawiają barwienie F-aktyną zlewającej się warstwy śródbłonka przed i po stymulacji trombiną (1 U/ml). Trombina powoduje obkurczanie się komórek śródbłonka poprzez tworzenie tzw. włókien naprężeniowych i przejściowe otwieranie szczelin międzyśródbłonkowych (strzałek i wstawek obrazu), rozpoznawalnych w sygnale ECIS po spadku oporu w stosunku do linii podstawowej. Tutaj czułość pomiaru staje się oczywista i to, jak zmiany w warstwie ogniwa korelują z sygnałem impedancji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Przyczepianie i wzrost komórek. MVEC od tego samego dawcy wysiewano z trzema różnymi gęstościami na pokrytych żelatyną matrycach 8W10E, a wzrost komórek rejestrowano z wieloma częstotliwościami przez 60 godzin. A) Wartości rezystancji dla trzech warunków przy ich optymalnej częstotliwości 4 kHz w celu pomiaru tworzenia bariery. Wszystkie trzy gęstości wysiewu stworzyły zlewającą się barierę o długości ok. 1 200 Ω na koniec pomiaru; Tempo proliferacji (nachylenie krzywych) różni się jednak znacznie. B) Pomiar pojemności przy 64 kHz dostarcza informacji na temat adhezji i rozprzestrzeniania się. Adhezja to początkowa faza plateau na krzywej pojemności (od 2 do 8 godzin). Rozsiewanie, które jest liniowo zależne od pokrycia elektrodą, jest reprezentowane przez nachylenie krzywej i kończy się po 10-30 godzinach, w zależności od gęstości wysiewu. Punkt czasowy t_1/2 (połowa maksymalnego pokrycia) może być wykorzystany do analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Charakterystyka bariery zlewającej się. Dwóch donorów MVEC o różnych numerach pasaży (pasaż 3 i 6) wysiano na żelatynowych matrycach 8W1E i wykonywano pomiar MFT przez 30 godzin w celu scharakteryzowania bariery EC. A) Pomiary oporności wykazują, że młodszy dawca 1 ma wyższą oporność wynoszącą ok. 11 000 Ω w porównaniu do ok. 7 500 Ω od starszego dawcy 2. B-C) Możliwości modelowania ECIS zostały wykorzystane do znalezienia przyczyny niższego oporu. Modelowanie ujawniło porównywalną interakcję komórka-komórka Rb i wskazało na osłabioną interakcję komórka-macierz Alfa jako możliwą przyczynę. D) RTC przeprowadzono w celu ilościowego określenia mikroruchu w zlewającej się warstwie komórkowej za pomocą transformacji Fouriera, gdzie obszar pod krzywą jest proporcjonalny do mikroruchu. Analizy widm wykazują mniejsze mikroruchy starszego dawcy 2, a tym samym potwierdzają to, co można już założyć na podstawie sygnału rezystancji (mniejsza wariancja). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5. Migracja komórek po zranieniu elektrycznym i efekty stymulacji trombiny. Nagrania impedancyjne wykonywano z częstotliwością 4 kHz z maksymalną rozdzielczością czasową. A) Dawor 1 MVEC został użyty w pasażu 3, a dawca 2 w pasażu 6 na galatynowych matrycach 8W1E pokrytych żelatyną i wyhodowany do konfluencji. Następnie wytworzyła się uzwojenie elektryczne poprzez zastosowanie dwóch impulsów o napięciu 5 V o częstotliwości 60 kHz każdy, z których każdy trwał 20 sekund. Młodszy dawca 1 wykazywał lepsze zdolności gojenia się ran w oparciu o szybsze zamykanie się rany (migracja, nachylenie krzywych) i wyższą odporność po zranieniu w porównaniu ze starszym dawcą 2. B) HUVEC uprawiano na galatynowych matrycach 8W10E. Po zbiegu komórki były głodzone surowicą przez 1,5 godziny poprzez zastąpienie kompletnej pożywki hodowlanej podłożem podstawowym z 1% albuminą surowicy ludzkiej (HSA). Stosowanie zwykłej pożywki z HSA jest krytycznym krokiem, ponieważ składniki surowicy blokują odpowiedź trombiny. Gdy tylko wykryto stabilny plateau rezystancji, trombinę dodawano bezpośrednio do studzienek i starannie mieszano z pipetą o pojemności 200 μl. Maksymalne działanie trombiny jest widoczne po 30 minutach, charakteryzuje się przejściowym spadkiem oporności w stosunku do wartości wyjściowej i ok. 30-50% niższa odporność po rekonwalescencji. Komórki były albo wstępnie inkubowane z blokerem kinazy Rho Y-27632 przez 30 minut, albo bloker dodawano 20, 30 lub 40 minut po dodaniu trombiny, co natychmiast zmniejszało efekt trombiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

ECIS jest doskonałym narzędziem do badań przesiewowych właściwości i zachowania komórek, a także do ilościowego określania skutków działania znanych i nieznanych substancji. W ten sposób komórki są utrzymywane w standardowych warunkach hodowli, impedancja może być stale monitorowana z wysoką rozdzielczością czasową i skorelowana z sygnałami optycznymi. W ten sposób można wybrać optymalny punkt czasowy dla manipulacji komórkami na podstawie morfologicznego i funkcjonalnego stanu komórki. Niestety, ta wysoka rozdzielczość pomiaru wiąże się z ceną, że niewielkie zmiany temperatury, pH lub mechaniczna stymulacja komórek (zmiana medium) natychmiast wpłyną na sygnał impedancji.

Zastosowanie małego prądu pomiarowego do ogniw sprawia, że pomiar ECIS jest nieinwazyjny, nieniszczący i bezznacznikowy, ale w rezultacie można mierzyć tylko pasywne właściwości bioelektryczne (brak potencjałów czynnościowych). Kluczową cechą jest to, że z jednego pomiaru można wyprowadzić szereg parametrów, łącząc informacje z kilku klasycznych testów, takich jak testy przepuszczalności lub gojenia się ran. W tym przypadku szczególnie interesującym aspektem jest to, że matematycznie modelowane dane można wykorzystać do zbadania zmian rezystancji i pojemności oraz odniesienia ich do odrębnych struktur komórkowych (np. kontaktów komórkowych lub błony komórkowej). Ważne jest, aby pamiętać, że spektroskopia impedancyjna zawsze zapewnia uśredniony sygnał ze wszystkich komórek na elektrodzie czujnikowej, co nie pozwala na badania na pojedynczych komórkach, a model matematyczny jest ważny tylko w zlewających się warstwach komórek. Dlatego komórki śródbłonka powinny być utrzymywane w stanie zlewania się przez co najmniej jeden dzień przed użyciem do modelowania, aby zapewnić dojrzałe zrosty komórkowe i komórki w stanie spoczynku. Podobnie, urazy elektryczne powinny być nakładane tylko na zlewające się warstwy komórek przy użyciu wielu krótkich impulsów uzwojenia o wysokich częstotliwościach, aby osiągnąć optymalną wydajność nawijania i zapobiec uszkodzeniu elektrod.

Aby uzyskać maksymalną ilość informacji z pomiaru ECIS, tak jak w każdym teście, przed eksperymentem należy przetestować i zoptymalizować kilka parametrów, takich jak kombinacja podłoża matrycowego, powłoka i gęstość wysiewu dla indywidualnego typu komórki.

Głównym ograniczeniem ECIS jest to, że pomiar nie dostarcza bezpośrednich informacji na poziomie molekularnym. W związku z tym pomiary ECIS są zwykle najbardziej pouczające na początku serii eksperymentalnej, aby pomóc powiązać problem naukowy ze strukturami lub właściwościami komórkowymi i dostarczyć istotnych danych wejściowych do wygenerowania możliwej do przetestowania hipotezy. W związku z tym modułowa konstrukcja ECIS zapewnia szerokie spektrum zastosowań z możliwością tworzenia matryc dostosowanych do indywidualnych potrzeb. Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie matryc wskazują na przyszłe skupienie się na wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych impedancji do proliferacji komórek i zranień elektrycznych oraz na postęp w zakresie specjalnych matryc przepływowych do symulacji naprężeń ścinających in vivo o różnych profilach przepływu.

Dalsza literatura
Na stronie internetowej Biofizyki Stosowanej (www.biophysics.com) znajdują się noty aplikacyjne, seminaria internetowe i szczegółowy wykaz publikacji obejmujących całe spektrum ECIS.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Monachium, Niemcy
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Monachium, Niemcy
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Monachium, Niemcy
8W10E PCB Electrode	Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Monachium, Niemcy
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gelatin	Merck Millipore	104070
Trombin bydlęcy	Merck Millipore	604980
Albuman (Albumina surowicy ludzkiej)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Długopis/Paciorkowiec	Lonza	17-602E