Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Podsumowanie

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Streszczenie

Wykrywanie impedancji podłoża elektrycznego (ECIS) to system pomiaru impedancji in vitro do ilościowego określania zachowania komórek w przylegających warstwach komórkowych. W tym celu komórki są hodowane w specjalnych komorach hodowlanych na przeciwległych, okrągłych złotych elektrodach. Między elektrodami doprowadzany jest stały, mały prąd przemienny i mierzony jest potencjał w poprzek. Właściwości izolacyjne błony komórkowej tworzą opór wobec przepływu prądu elektrycznego, co powoduje zwiększenie potencjału elektrycznego między elektrodami. Pomiar impedancji komórkowej w ten sposób umożliwia zautomatyzowane badanie przyczepienia, wzrostu, morfologii, funkcji i ruchliwości komórek. Chociaż sam pomiar ECIS jest prosty i łatwy do nauczenia, podstawowa teoria jest złożona, a wybór odpowiednich ustawień oraz prawidłowa analiza i interpretacja danych nie są oczywiste. Nie jest jednak dostępny jasny protokół opisujący poszczególne etapy od projektu eksperymentu do przygotowania, realizacji i analizy eksperymentu. W artykule omówiono podstawową zasadę pomiaru, a także możliwe zastosowania, rozważania eksperymentalne, zalety i ograniczenia systemu ECIS. Podano przewodnik do badania przyczepiania się komórek, rozprzestrzeniania się i proliferacji; kwantyfikacja zachowania komórek w warstwie zlewającej się, z uwzględnieniem funkcji bariery, ruchliwości komórek, jakości adhezji komórka-komórka i komórka-substrat; oraz kwantyfikacja gojenia się ran i odpowiedzi komórkowych na bodźce wazoaktywne. Reprezentatywne wyniki omówiono w oparciu o ludzkie komórki mikronaczyniowe (MVEC) i ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), ale mają zastosowanie do wszystkich przylegających komórek wzrostu.

Wprowadzenie

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę Electric Cell-substrate Impedance Sensing, znaną jako ECIS, która jest specyficzną metodą pomiaru i analizy widma impedancji adhezyjnych komórek w kulturze¹. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie ogólnie stosowalnego przewodnika po wykorzystaniu tego konkretnego rodzaju analiz komórkowych opartych na impedancji oraz dostarczenie protokołów dla niektórych kluczowych funkcji z stale rosnącej liczby zastosowań. Koncentracja zostanie położona na badaniu proliferacji komórek, funkcji barierowej, połączeń komórkowych oraz ruchliwości komórek.

Od czasu wprowadzenia przez Giaevera i Keese'a w 1991 roku² systemu ECIS oraz powiązanego z nim modelu przekształcania danych spektroskopii impedancyjnej w parametry istotne biologicznie w ich obecnej formie, często określano go mianem systemu do pomiaru TEER (trans-epithelial electrical resistance), co nie jest precyzyjne. Różnice te mogą wydawać się na początku marginalne, lecz są istotne dla interpretacji danych. W klasycznych pomiarach TEER komórki hoduje się na filtrach przepuszczalnych, aby scharakteryzować parakomórkowe mechanizmy transportu, w których dominującą rolę odgrywają połączenia ścisłe nabłonka lub połączenia przylegające śródbłonka³. Zazwyczaj stosuje się dwie elektrody umieszczone powyżej i poniżej filtra do przyłożenia prądu stałego (DC) przez warstwę komórek oraz dwie inne elektrody do pomiaru wynikającego spadku napięcia⁴. Opór elektryczny oblicza się zgodnie z prawem Ohma, co pozwala na numeryczny opis jakości bariery komórkowej.

ECIS opiera się na tej podstawowej zasadzie i ją rozszerza. W systemie ECIS komórki hoduje się na przeciwległych, okrągłych elektrodach złotych, które są wbudowane w dno specjalnych naczyń hodowlanych. Liczba elektrod w każdym dołku hodowlanym jest zmienna i zależy od zastosowania, a elektrody mają standardową średnicę 250 µm; w niektórych przypadkach do zamknięcia obwodu stosuje się większą elektrodę pomocniczą. ECIS wykorzystuje stały prąd przemienny (AC) o natężeniu 1 µA o określonej częstotliwości zamiast prądu stałego. Impedancję oblicza się na podstawie odpowiadających jej zmian napięcia (w mV) pomiędzy elektrodami. ECIS umożliwia pomiar impedancji w zakresie różnych częstotliwości w celu badania zależności właściwości komórkowych od częstotliwości, co daje kilka zalet w stosunku do metody TEER, co zostanie szczegółowo wyjaśnione w niniejszym artykule. Po pierwsze, pomiar impedancji zespolonej pozwala na rozdzielenie całkowitej impedancji na opór bariery komórkowej oraz pojemność komórkową. Ponadto, poprzez pozyskiwanie danych przy wielu częstotliwościach i zastosowanie modelu matematycznego, można odróżnić impedancję połączeń (szczelność kontaktów międzykomórkowych) od impedancji wynikającej z oddziaływań komórka-podłoże (odległość podstawnej błony komórkowej od leżącej poniżej macierzy), a także określić wpływ pojemności błony komórkowej. Po drugie, możliwe jest ocenianie proliferacji i mobilności komórek, ponieważ znajdują się one w bezpośrednim kontakcie z elektrodami. Po trzecie, podłoże i elektrody są wystarczająco cienkie, aby umożliwić zastosowanie mikroskopii w świetle przechodzącym oraz mikroskopii fazowo-kontrastowej.

Podstawy pomiarów impedancji: impedancja zespolona

Podstawą pomiaru impedancji elektrycznej obiektów biologicznych (np. komórek) jest prawo Ohma, podstawowa zasada elektrotechniczna, która opisuje zależność między rezystancją (R), natężeniem prądu (I) a napięciem (U) w obwodzie elektrycznym w danym czasie (t).
Zastosowanie w obwodzie prądu stałego: R(t) = U(t)/I(t)

Podczas pracy w systemie prądu przemiennego (AC), prąd i napięcie różnią się nie tylko amplitudą, ale także fazą (φ). W takim przypadku sam opór nie jest już wystarczający do opisania tych zależności. Zamiast tego stosuje się impedancję zespoloną (Z) lub w większości przypadków moduł impedancji (|Z|), który obejmuje wcześniej opisany opór omowy oraz reaktancję (X), wynikającą z przepływu prądu przemiennego przez kondensatory i cewki, co powoduje przesunięcie fazowe między napięciem a prądem⁵.
Wzór stosowany w obwodzie AC: |Z(f)| = √(R²+X(f)²)
φ = arctan(X/R)

Podczas pomiarów impedancji w nienaruszonych komórkach, ze względu na charakterystykę ich błony, komórki działają jak równoległe połączenie rezystora i kondensatora. Tutaj rezystancja reprezentuje opór przepływu prądu, podczas gdy pojemność (C) opisuje separację nośników ładunków elektrycznych na izolującej dwuwarstwie błony komórkowej, co powoduje polaryzację komórki. W związku z tym X jest zdominowana przez właściwości pojemnościowe błony komórkowej.
X(f) ≈ (2*Pi*f*C_Cell)^-1

Ponieważ X jest zależny od częstotliwości, zmiana częstotliwości pomiaru umożliwia badanie różnych właściwości funkcjonalnych i strukturalnych komórki. Urządzenie ECIS mierzy zarówno R, jak i X, co pozwala na obliczenie |Z|, C oraz φ.

Kwantyfikacja całych warstw komórkowych za pomocą spektroskopii impedancyjnej: równoważny obwód elektryczny.

Jak wyjaśniono wcześniej, gdy komórka zostanie umieszczona w polu elektrycznym, wykazuje ona właściwości pasywnych komponentów elektronicznych. Jeśli obecnie, zamiast pojedynczej komórki, bada się całą warstwę komórek wyhodowaną na elektrodach i uzupełnioną pożywką hodowlaną, prosty model rezystora i kondensatora musi zostać rozszerzony do pełnej sieci elektrycznej. W tym tak zwanym obwodzie zastępczym należy uwzględnić rezystancję pożywki (R_Med) oraz pojemność (C_Electr) i rezystancję (R_Electr) charakteryzujące oddziaływanie na granicy elektroda/elektrolit^3,6.

Uproszczony, ogólny przykład takiego obwodu równoważnego dla przytwierdzonej, rosnącej warstwy komórek przedstawiono na Rysunku 1. Zaletą takiego matematycznego podejścia do opisu układu biologicznego jest możliwość dowolnego (ad libitum) doprecyzowania tych obwodów i dostosowania ich do konkretnych pytań badawczych, np. poprzez uwzględnienie impedancji wywołanej przez organelle wewnątrzkomórkowe lub w celu rozróżnienia wpływu połączeń międzykomórkowych (R_Junc) i adhezji komórka-podłoże (R_Sub) na całkowitą impedancję^7,8. Niemniej jednak celem modelowania powinno być zawsze wykorzystanie jak najmniejszej liczby elementów opisujących wszystkie cechy zmierzonego widma impedancji, aby umożliwić wyciągnięcie znaczących korelacji.

Rysunek 1. Schemat systemu ECIS i reprezentatywny obwód zastępczy dla warstwy rosnących komórek adherentnych. A) Przekrój poprzeczny studzienki hodowlanej ECIS. Komórki rosną na elektrodzie pomiarowej i przeciwnej oraz są pokryte pożywką hodowlaną. Elektrody są połączone z wzmacniaczem synchronicznym, a sygnał AC jest przykładany poprzez rezystor 1 MΩ w celu utworzenia stałego źródła prądu. Bodźce mogą być dodawane bezpośrednio do pożywki hodowlanej w dowolnym momencie. B) ECIS mierzy sumę wszystkich poszczególnych składowych impedancji. Należy uwzględnić rezystancję pożywki hodowlanej (R_Med), impedancję spowodowaną interfejsem elektroda/elektrolit, przedstawioną dla uproszczenia jako równoległe połączenie rezystora (R_Electr) i kondensatora (C_Electr), a także właściwości elektryczne błony komórkowej, opisane przez równoległe połączenie rezystancji (R_Cell) i pojemności (C_Mem). R_Cell jest zmienna, ponieważ zależy od przepuszczalności komórek dla prądu. Obwód zastępczy może być rozbudowywany i doprecyzowany ad libitum. Jako przykład do obwodu dodano rezystancję połączeń międzykomórkowych (R_Junc) oraz podśródbłonkową (R_Sub). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Parametry impedancji i ich znaczenie biologiczne

Dwoma najbardziej bezpośrednimi parametrami wynikającymi z pomiarów impedancji są opór i pojemność elektryczna komórek. Opór reprezentuje jakość i funkcję bariery komórkowej, a tym samym uwzględnia opór przeciwko paracelularnemu i transcelularnemu przepływowi prądu. Pojemność zapewnia ogólną miarę pokrycia elektrody. Charakterystyczną cechą ECIS jest to, że dzięki zastosowaniu obwodów zastępczych i modelowania parametry globalne te dostarczają informacji o wielu innych właściwościach komórkowych, w tym o adhezjach komórka-komórka i komórka-podłoże, co zostanie omówione w dalszej części artykułu.

Przed rozpoczęciem: Uwagi eksperymentalne

Konfiguracja pomiarowa - Układ składa się z kilku oddzielnych komponentów: urządzenia ECIS z elektroniką pomiarową; komputera PC do akwizycji danych; uchwytu na matryce dla systemu 8- lub 96-dołkowego; matryc ECIS oraz wybranej hodowli komórkowej. Uchwyt na matryce należy umieścić w inkubatorze i podłączyć do urządzenia ECIS znajdującego się poza inkubatorem. Komputer PC musi być wyposażony w oprogramowanie ECIS (1.2.123.0 14th February 2013) i podłączony do urządzenia ECIS.

Wybór matrycy - Istnieje stale rosnąca różnorodność matryc ECIS, zaprojektowanych do wielu zastosowań. Standardowe matryce to 8W1E oraz 8W10E, które składają się z 8 dołków hodowlanych (oznaczonych jako W) zawierających odpowiednio 1 lub 10 elektrod pomiarowych (oznaczonych jako E). Obwód zamyka duża elektroda pomocnicza, jednak jej impedancja jest w rzeczywistym pomiarze w zasadzie pomijalna⁶. Standardowy uchwyt na matryce 8-dołkowe może pomieścić dwie matryce, co daje łącznie 16 dołków hodowlanych. Złote elektrody mają grubość 50 nm, są oddzielone warstwą izolacyjną i zamocowane na optycznie przejrzystym podłożu z poliwęglanu Lexan lub na płytce drukowanej (PCB). Matryce PCB są bardziej wytrzymałe i efektywne kosztowo. Przezroczyste płytki umożliwiają stosowanie mikroskopii świetlnej i immunofluorescencyjnej. Należy wziąć pod uwagę, że matryca 1E potęguje fluktuacje sygnału rezystancji wywołane ruchami komórek i jest niezbędna w badaniach gojenia ran. Dodatkowo pojedyncze elektrody pozwalają na korelację sygnałów elektrycznych i optycznych. W matrycach wieloelektrodowych sygnał jest uśredniany z kilku elektrod, co dzięki zwiększonej powierzchni pomiarowej obejmuje w pomiarze więcej komórek, ogranicza błąd danych wynikający z nierównomiernego zasiewu i wzrostu komórek oraz redukuje rozmycie sygnału spowodowane ruchami komórek. Dlatego matryce wieloelektrodowe są przydatne do badania proliferacji komórek i tworzenia bariery. Oprócz matryc standardowych dostępne są matryce specjalistyczne do aplikacji naprężeń ścinających⁹, badania chemotaksji¹⁰, migracji i proliferacji komórek, a także płytki 96-dołkowe do przesiewów wysokoprzepustowych. Podsumowując, dobór matrycy jest ściśle uzależniony od pytania badawczego oraz typu komórek i powinien być starannie wybrany oraz przetestowany.

Częstotliwość pomiaru - Modelowanie Rb i alfa (patrz analiza danych) wymaga pomiarów wieloczęstotliwościowych (MFT). Alternatywnie impedancję można mierzyć w czasie przy jednej częstotliwości specyficznej dla danego typu komórek (SFT), co daje korzyść w postaci możliwości gromadzenia danych z wyższą rozdzielczością czasową. Najbardziej czułą częstotliwość pomiarową dla konkretnego typu komórek można wyznaczyć za pomocą skanowania częstotliwości. Podczas wykreślania impedancji lub rezystancji w funkcji częstotliwości na wykresie logarytmicznym, częstotliwość, przy której różnica między elektrodą wolną od komórek a elektrodą pokrytą komórkami jest największa, jest częstotliwością, przy której komórki najskuteczniej blokują prąd. W przypadku komórek śródbłonka (EC) częstotliwość ta wynosi około 4 kHz.

Gęstość wysiewu - Jak w każdym standardowym eksperymencie z wykorzystaniem komórek, gęstość wysiewu zależy od problemu badawczego. Podczas badania adhezji i rozprzestrzeniania się lub tworzenia bariery, komórki śródbłonka należy wysiać z wysoką gęstością wynoszącą 40,000-60,000 cells/cm², aby zagwarantować powstanie konfluentnej, stabilnej bariery po 48 hr. Jeśli celem eksperymentu jest proliferacja, komórki śródbłonka należy wysiać z niską gęstością wynoszącą około 2,000-10,000 cells/cm².

Protokół

1. Przygotowanie systemu pomiarowego

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy rozgrzać uchwyt matrycy w inkubatorze do temperatury 37 °C, aby zapobiec kondensacji.
2. Napełnij trumnę z wodą inkubatora wodą destylowaną, aby uniknąć wysuszenia studni.
3. Wykonuj wszystkie manipulacje na komórkach i macierzach w komorze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.

2. Przygotowanie tablic i inokulacja komórek

UWAGA: Tablice ECIS muszą zostać oczyszczone i ustabilizowane przed eksperymentem, aby zapobiec dryfowaniu elektrod, poprawić odtwarzalność sygnału do szumu i stosunek sygnału do szumu. Dlatego dostępne są dwie opcje: A) wstępna obróbka elektrod L-cysteiną i B) funkcja stabilizacji ECIS.

Opcja A: L-cysteina jest zalecana jako najbardziej konsekwentna obróbka wstępna, ale w niektórych szczególnych przypadkach może wchodzić w interakcje z powłokami białkowymi na elektrodach. Prezentowane objętości są używane dla standardowych macierzy 8-dołkowych.

1. Dodać 200 μl/basenik 10 mM L-cysteiny. Cysteina czyści i modyfikuje powierzchnię elektrody, zapewniając wysoką i powtarzalną pojemność elektrody.
2. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
3. Przemyć dwukrotnie 500 μl/studnię ultraczystą wodą (typ 1). Nie należy stosować fosforanowych, które mogą zakłócać adsorpcję niektórych białek. Unikaj również roztworów zawierających surowicę przed powlekaniem, ponieważ złota powierzchnia będzie adsorbować pierwsze makrocząsteczki, które wejdą w kontakt.
4. Posmarować 200 μl/dobrze ogrzaną 1% żelatyną.
5. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
6. Usuń żelatynę, ale nie pozwól, aby powierzchnia wyschła. Może to spowodować uszkodzenie elektrod.
7. Umyj raz ultraczystą wodą (typ 1).
8. Dodać 400 μl/dobrze kompletną pożywkę do hodowli komórkowych (zawierającą surowicę, antybiotyki i wszystkie czynniki wzrostu).
9. Wsuń matrycę do uchwytu macierzy i upewnij się, że tablica jest ustawiona w taki sposób, że dziewięć złotych kwadratowych padów jest prawidłowo stykanych przez sprężynowe kołki pogo i dokręć regulacyjną ręcznie. Uważaj na przezroczyste tablice, warstwa złota może zostać łatwo uszkodzona.
10. Otwórz oprogramowanie pomiarowe i naciśnij Setup, a następnie Check w sekcji "Zbierz dane", aby wykonać szybki pomiar impedancji każdego dołka. Uzyskane wartości są linią bazową pomiaru i zostaną automatycznie zapisane w "Komentarzach".
11. Kontrola odwiertu automatycznie określi rodzaj użytych tablic ECIS. Sprawdź wybrane tablice w sekcji "Konfiguracja studni".
12. Schemat tablicy świeci na zielono dla prawidłowo podłączonych studni i na czerwono dla pustych lub nieprawidłowo podłączonych studni. Mimo to zawsze upewnij się, że tablice zostały prawidłowo umieszczone w uchwycie.
    UWAGA: Jeśli czyszczenie i powlekanie się powiodło, matryce 8W1E ECIS mają pojemność około 5 nF, a matryce 8W10E 50 nF, co daje rezystancję bazową odpowiednio około 2 000 i 200 Ω.
13. Usuń tablicę z uchwytu.
14. Komórki nasienne w postaci zawiesiny jednokomórkowej w 400 μl/studzienkę kompletnej pożywki do hodowli komórkowych.

Opcja B: Funkcja stabilizacji ECIS może być użyta jako alternatywa lub w połączeniu z leczeniem L-cysteiną i w przypadku wystąpienia problemów z dryftem elektrody lub dużych różnic w rezystancji i pojemności well-to-well.

1. Wykonaj leczenie cysteiną (opcjonalnie) i wstępnie pokryj elektrody białkiem (opcjonalnie).
2. Dodać 200 μl/studzienkę kompletnego podłoża do każdej studzienki i umieścić tablicę w uchwycie matrycy.
3. Otwórz oprogramowanie pomiarowe i naciśnij Setup, a następnie Sprawdź, aby upewnić się, że matryca jest prawidłowo podłączona i zmierzyć początkowe Z, R i C.
4. Ustabilizuj elektrody, naciskając Stabilizuj w sekcji "Zbierz dane". ECIS zastosuje impuls o wysokim natężeniu prądu (ok. 3 mA) i wysokiej częstotliwości (64 kHz) w celu oczyszczenia elektrod.
5. Sprawdź ponownie elektrody. Pojemność powinna być zwiększona, a wartości rezystancji powinny mieścić się w porównywalnym zakresie.
6. Jeśli wartości pojemności i rezystancji nadal nie są zadowalające, powtórz stabilizację.
7. Wyjmij tablicę z uchwytu i zaszczep komórki.

3. Konfiguracja oprogramowania pomiarowego i akwizycji danych

1. Umieść tablicę w uchwycie tablicy, jak opisano wcześniej.
2. Otwórz oprogramowanie pomiarowe i naciśnij przycisk Setup w sekcji "Zbieranie danych", aby połączyć oprogramowanie ECIS z instrumentem ECIS i uruchomić kolejną kontrolę odwiertu.
3. Sprawdź wybrane tablice w sekcji "Konfiguracja studni".
4. Wybierz studnie do pomiaru w sekcji "Konfiguracja studni".
5. Wybierz tryb pomiaru z opcji "Zbieraj dane":
   1. W przypadku szeregów czasowych o stałej częstotliwości wybierz opcję Pojedyncza częstotliwość / czas (SFT) i wybierz częstotliwość pomiaru z menu rozwijanego.
   2. Aby zmierzyć pokrycie elektrodą i modelować Rb i Alfa, wybierz opcję Multiple Freq. / Time (MFT). Urządzenie ECIS będzie dokonywać pomiarów automatycznie na wszystkich dostępnych częstotliwościach.
   3. W przypadku mikroruchu (patrz analiza danych) wybierz Rapid Time Collect (RTC) i dostosuj częstotliwość pomiaru oraz częstotliwość próbkowania. W tym przypadku standardowa rozdzielczość czasowa to jedna próbka na sekundę (1 Hz), ale częstotliwość próbkowania można również zwiększyć, aby śledzić szybkie zmiany impedancji do 25 Hz (dla Z-Theta). Ważna uwaga: w trybie RTC mierzony jest tylko jeden studzienek.
      UWAGA: Jeśli konieczne jest zmierzenie mikroruchu w kilku dołkach później, przejdź do Pomocy > Pokaż ekspercki pasek narzędzi/elementy menu > Zdobądź > Multi-Well RTC. Określ limit czasu (godz.) w sekcji Zbieranie danych; ECIS będzie teraz mierzył wybrane odwierty w kolejności numerycznej. Po rozpoczęciu pomiaru oprogramowanie poprosi o określenie liczby cykli. Wprowadź wartość określającą, jak często pomiar musi być powtarzany.
6. W przypadku SFT i MFT wybierz przedział czasu (s) między pomiarami lub jeśli dane muszą być pozyskiwane tak szybko, jak to możliwe, pozostaw tę opcję niezaznaczoną.
   UWAGA: Aby uzyskać dane, urządzenie ECIS wykorzystuje multiplekser do przełączania się z jednego dołka na drugi z minimalną szybkością akwizycji SFT wynoszącą 0,25 sekundy i 7,5 sekundy dla MFT. Oznacza to, że interwał jest zależny od liczby wybranych dołków i częstotliwości. W przypadku pomiarów na wolno proliferujących komórkach lub prostego zapisu rezystancji w funkcji czasu należy stosować interwały 600 sekund lub więcej.
7. Naciśnij Start, nazwij plik i wybierz lokalizację, w której chcesz przechowywać dane.
   UWAGA: Rozmiar pliku nie powinien stanowić problemu, ponieważ dane ECIS są zapisywane w formie zwykłego tekstu o nazwie *.abp, który nigdy nie przekracza kilkuset MB, nawet przy wybranych wszystkich częstotliwościach pomiarów i liczbie studzienek.
8. Zatrzymaj bieg, naciskając przycisk Zakończ.

4. Zmiana medium i manipulacja komórkami

1. Naciśnij pauzę, spowoduje to zatrzymanie pobierania danych, ale będzie kontynuowane uruchamianie zegara eksperymentalnego.
2. Wyjmij matrycę z uchwytu i manipuluj nią pod stołem z przepływem laminarnym (tj. zmień medium).
3. Umieść tablicę z powrotem w uchwycie i kliknij przycisk Sprawdź połączenie lub Wznów eksperyment, aby kontynuować pobieranie danych. Oprogramowanie pomiarowe umieści znacznik czasu w zestawie danych.

5. Ostra stymulacja podczas pozyskiwania danych

UWAGA: Drugą opcją jest manipulowanie komórkami podczas zbierania danych w celu śledzenia natychmiastowych zmian. Jest to możliwe tylko wtedy, gdy próbki nie muszą być sterylne w dalszym przebiegu eksperymentu.

1. Dodaj bodziec bezpośrednio do studzienki i upewnij się, że mieszasz ostrożnie z pipetą o pojemności 200 μl.
2. Zaznacz punkt czasu ręcznie, naciskając Zaznacz i dodaj komentarz.

6. Zranienie elektryczne

UWAGA: Znalezienie odpowiednich ustawień dla używanego typu ogniwa ma kluczowe znaczenie dla uzwojenia elektrycznego. Jeśli uwijanie jest zbyt krótkie, może to spowodować niewystarczające usunięcie komórek, natomiast jeśli uzrażanie jest zbyt długie i/lub szorstkie, może to spowodować uszkodzenie elektrod (szczególnie na przezroczystych matrycach). Dlatego zaleca się kilka krótkich impulsów nawijania. W przypadku hodowli HUVEC za optymalne uznano dwa 10-20 sekundowe impulsy nawijania o napięciu 5 V przy 60 kHz każdy przy użyciu ECIS 1600R. Ogólnie rzecz biorąc, zaleca się stosowanie wysokich częstotliwości >20 kHz w celu utrzymania jednolitych wysokich pól w ogniwach i uniknięcia uszkodzenia elektrod.

1. Wykonać zranienie podczas aktywnego pomiaru ECIS.
2. Włącz konfigurację nawijania / elektroporacji, a następnie kliknij Nawijanie i wprowadź czas (s), napięcie uzwojenia (V dla 1,600 R) lub prąd (μA dla Z i Z-Theta) i częstotliwość (Hz). Wyświetlane wartości domyślne są oparte na typie macierzy i urządzenia ECIS.
3. Wybierz studnie do nawijania w sekcji "Konfiguracja studni". Tylko sprawdzone studnie zostaną zranione.
4. Włącz opcję Opóźnienie do godziny i wypełnij czas opóźnienia, aby aktywować funkcję opóźnienia nawijania. Funkcję tę można zatrzymać w dowolnym momencie, naciskając przycisk Stop lub ręcznie nakładając ranę. W danym momencie może być aktywne tylko jedno polecenie opóźnienia.
5. Naciśnij Aktywuj i kliknij OK w wyskakującym okienku, aby rozpocząć ranienie.
6. Upewnij się, że sygnał rezystancji spada do impedancji przesunięcia po uzwojeniu, w przeciwnym razie powtórz uzwojenie.

7. Analiza danych

1. Reprezentacja i eksport danych.
   1. Zakończ pomiar lub załaduj zestaw danych za pomocą Plik -> Otwórz.
   2. Wybierz studnie do wyświetlenia w oknie "Konfiguracja studni". Grupuj poszczególne studnie, aby przedstawić średnią.
   3. Wybierz parametr, który ma być wyświetlany z górnego paska narzędzi (Z, R lub C).
   4. Wybierz typ wykresu z górnego paska narzędzi (T = czas, F = częstotliwość, 3D = plama wodospadu).
   5. Zdefiniuj przesunięcie i zakres wykresu za pomocą suwaków poniżej okna wykresu lub wypełnij dokładne wartości w sąsiednich kontrolkach.
   6. Wybierz jedną z podstawowych opcji "Opcje szeregów czasowych" w sekcji "Analizuj", aby wykonać odchylenie standardowe, średnią bieżącą lub normalizację danych.
   7. Aktywuj pasek narzędzi Ekspert w menu Pomoc, aby uzyskać bardziej zaawansowane operacje, takie jak wykres Nyuista i transformacja Fouriera.
   8. Użyj opcji "Opcje wyświetlania" w sekcji "Analizuj", aby zdefiniować zakres osi x i y oraz wyeksportować wykres.
   9. Eksportuj wybrane dane do pliku Excel za pomocą opcji Plik -> Eksportuj dane -> Do Excela (wybrane) i użyj wybranego oprogramowania innej firmy do dogłębnej analizy, statystyk i reprezentacji w razie potrzeby.
2. Modelowanie Rb i Alpha.
   UWAGA: Do modelowania zaleca się użycie bezkomórkowego, wypełnionego medium dobrze jako odniesienia.
   1. Zakończ pomiar MFT lub załaduj zestaw danych MFT.
   2. Jeśli dostępna jest studnia referencyjna bez komórek, naciśnij przycisk Znajdź, aby automatycznie wybrać wartość odniesienia, lub Ustaw, aby ręcznie wybrać punkt czasu wolnego od komórek z opcji "Freq. Scan Modeling" w sekcji "Analizowanie".
   3. Jeśli nie ma odwołania bez komórek, zaimportuj wartość odwołania z innego zestawu danych. Otwórz zestaw danych referencyjnych (upewnij się, że użyto tej samej tablicy i nośnika) i użyj polecenia Znajdź lub Ustaw, aby wybrać wartość odwołania. Następnie przejdź do zmierzonych danych i naciśnij Pobierz.
   4. Jeśli nie ma dostępnego zestawu danych referencyjnych bez komórek, należy użyć domyślnych ustawień fabrycznych.
   5. Naciśnij przycisk Model, aby rozpocząć obliczenia. Modelowanie może potrwać kilka minut w zależności od rozmiaru zestawu danych.
3. Obliczanie mikroruchu.
   UWAGA: Obliczenia te nie są częścią oprogramowania pomiarowego, ale można je wykonać za pomocą dowolnego oprogramowania do przetwarzania sygnałów.
   1. Zakończ pomiar RTC lub załaduj zestaw danych RTC.
   2. Normalizuj zestaw danych według uśrednionego oporu z całego okresu.
   3. Podziel zestaw danych na segmenty o długości 256 punktów danych i wyczyść każdy segment za pomocą okna Hanninga.
   4. Uruchom 256-punktową transformację Fouriera i uśrednij wynikowe widma częstotliwości do jednostronnego 129-punktowego widma mocy, aby zminimalizować losowy szum i wzmocnić sygnał biologiczny.
   5. Wykreślić częstotliwość w funkcji amplitudy na wykresie logarytmicznym i zastosować dopasowanie liniowe metodą najmniejszych kwadratów.
   6. Nachylenie dopasowania liniowego jest miarą ogólnego szumu w sygnale, a tym samym mikroruchu komórek.

Wyniki

Przygotowanie eksperymentu jest dość proste, a sam pomiar odbywa się w pełni automatycznie, jednak – jak to często bywa – kluczowa jest prawidłowa analiza i interpretacja danych. W sekcji danych reprezentatywnych znajduje się przewodnik po interpretacji najważniejszych parametrów dostarczanych przez spektroskopię impedancyjną z wykorzystaniem ECIS. Pomoże to w decyzji, w przypadku jakiego problemu badawczego pomiar ECIS może być użyteczny oraz które parametry należy rejestrować.

Typowy odczyt eksperymentalny można ogólnie podzielić na fazę wzrostu po inokulacji komórek oraz fazę plateau, gdy komórki osiągną konfluencję. Każda z tych faz dostarcza informacji o innych właściwościach komórkowych. Reprezentatywny pomiar przedstawiono na Rysunku 2, dzieląc go na cztery podfazy w celu analizy: A) adhezji, rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek; B) tworzenia dojrzałej bariery EC; C) migracji komórek po wygenerowaniu rany elektrycznej; oraz D) odpowiedzi komórkowej na stymulację wazoaktywnym czynnikiem, jakim jest trombina. Obrazy w kontraście fazowym oraz obrazy immunofluorescence pozyskano bezpośrednio z elektrody pomiarowej podczas poszczególnych podfaz, aby zilustrować związek między pokryciem elektrody, stanem komórek a zarejestrowanym sygnałem impedancji.

Adhezja, rozprzestrzenianie się i proliferacja

Każdy typ komórek posiada charakterystyczną krzywą adhezji i wzrostu, którą można modyfikować poprzez zmianę gęstości zasiewu, powlekanie białkami macierzy zewnątrzkomórkowej lub inne bodźce. Jedną z głównych trudności w badaniu tych procesów jest rozróżnienie między adhezją, rozprzestrzenianiem się (spreadingiem) a proliferacją. Wegener et al.¹¹ przedstawili szczegółowy opis wykorzystania kombinacji rezystancji i pojemności do rozróżnienia tych parametrów, a na Rysunku 3 staje się oczywiste, w jaki sposób rezystancja i pojemność mogą się wzajemnie uzupełniać. W badaniach nad adhezją i rozprzestrzenianiem się komórek ważne jest zrozumienie wpływu częstotliwości pomiarowej, ponieważ w tym przypadku pole elektryczne powoduje polaryzację błony komórkowej komórek w zawiesinie⁸, co wymusza przepływ prądu wyłącznie wokół komórek. Gdy komórki przytwierdzają się, zaczynają ograniczać przepływ prądu, rozprzestrzeniając się po elektrodzie, a pojemność maleje liniowo wraz z procentowym udziałem wolnej powierzchni na elektrodzie (powierzchnia frakcyjna). Zatem adhezję, rozprzestrzenianie się i proliferację można najlepiej ilościowo określić, rejestrując pojemność przy częstotliwości wyższej niż 40 kHz (Rysunek 3B), gdzie spadek pojemności jest wprost proporcjonalny do stopnia pokrycia elektrody. Alternatywnie, rezystancja przy jej najczulszej częstotliwości pomiarowej stanowi bezpośrednią miarę różnicowania i dojrzewania komórek w zwartą barierę (Rysunek 3A). Oprócz powierzchni frakcyjnej, Wegener et al. wprowadzili dwa inne parametry do ilościowego określenia adhezji i pokrycia elektrody: t_1/2 (połowa maksymalnej pojemności), czyli czas do momentu, gdy 50% elektrody zostanie pokryte komórkami (Rysunek 3B, wstawka), oraz nachylenie krzywej pojemności (s, nie pokazano) jako tempo rozprzestrzeniania się i proliferacji komórek.

Opór jako miara jakości bariery

Rezystancja jest tą częścią impedancji, która najlepiej opisuje jakość i funkcję bariery, ponieważ pomija komponenty pojemnościowe wynikające z błony, elektrody i medium. Tutaj użyto terminu jakość bariery, a nie przepuszczalność, ponieważ przepuszczalność z definicji zależy wyłącznie od kontaktów międzykomórkowych. Rezystancja jest natomiast określana przez zdolność komórek oraz ich oddziaływań międzykomórkowych i komórka-macierz do blokowania przepływu prądu. W związku z tym różne typy komórek (klony i pasażowania) mają swoje specyficzne wartości rezystancji (Rycina 4A). Chociaż rezystancja daje znacznie jaśniejszy obraz bariery komórkowej, sygnał impedancji powinien być zawsze brany pod uwagę.

Modelowanie Rb i Alpha

Oprogramowanie ECIS posiada szczególną funkcję umożliwiającą modelowanie dwóch parametrów, które rozróżniają adhezje międzykomórkowe od adhezji komórka-macierz (Rysunki 4B i 4C). Rb (w cm² x ohm) to rezystywność kontaktów międzykomórkowych dla przepływu prądu, a tym samym odwrotna miara klasycznej przepuszczalności. Wysoka wartość Rb oznacza niską przepuszczalność dla przepływu prądu. Alpha (w cm x ohm^0.5) jest miarą wkładu impedancji wynikającego z połączeń komórka-elektroda. Model służący do ilościowego określania kontaktów międzykomórkowych i kontaktów komórka-macierz został wprowadzony w 1991 roku przez Giaevera i Keese'a i opiera się na założeniu, że komórki są okrągłymi obiektami w kształcie dysku, które posiadają izolującą membranę, unoszą się nad elektrodą i są wypełnione przewodzącym elektrolitem². Właściwości izolacyjne błony komórkowej pozostawiają tylko trzy drogi dla prądu: a) między powierzchnią brzuszną komórek a elektrodą, b) między kontaktami międzykomórkowymi oraz c) przez komórki (prawdopodobne tylko przy zastosowaniu wysokiej częstotliwości pomiarowej). Bardziej szczegółne wyprowadzenie i wyjaśnienie można znaleźć w pracach Lo et al^3,12.

Mikroruchy

Wykazano, że niewielkie fluktuacje sygnału rezystancji (Rysunek 4A) wynikają z subtelnych, losowych ruchów komórek w konfluentnych warstwach komórkowych, a także z przemieszczania się komórek na elektrodę i poza nią w kulturach o niskiej gęstości². Ten aspekt danych z przebiegu czasowego ECIS, opisany przez Lo i Opp et al.^13,14, jest często pomijany i najlepiej widoczny podczas pomiarów z użyciem matryc 1E oraz przy najczulszej częstotliwości, aby uwzględnić parakomórkowe i subkomórkowe ścieżki przepływu prądu. Obliczanie tego szumu wywołanego przez komórki (mikroruchów) nie jest częścią standardowego oprogramowania pomiarowego, choć w najnowszej wersji zintegrowano szybką transformatę Fouriera (FFT). Rejestracja danych RTC z częstotliwością próbkowania 1 Hz przez 1 hr przy 4 kHz zapewnia wystarczającą rozdzielczość do obliczenia mikroruchów EC. Obliczenie to daje jedną, konkretną wartość, którą można bezpośrednio wykorzystać w analizie statystycznej. Rozszerzoną dyskusję na temat zastosowania analizy częstotliwościowej w badaniu mikroruchów można znaleźć w innym opracowaniu¹⁵. Alternatywnie do FFT można zastosować inne strategie analizy, takie jak wariancja przyrostów. Wariancja jest bardziej czuła na niewielkie zmiany w mikroruchach, ale ze względu na tę czułość porównywanie poszczególnych eksperymentów staje się trudne. Nachylenia widma mocy stanowią bardziej odporną miarę mikroruchów (Rysunek 4D). W tym przypadku pole pod krzywą można traktować jako ilość mikroruchów lub szumu generowanego przez komórki. Zatem im bardziej strome nachylenie widma mocy, tym mniejsze pole pod krzywą i mniejsza skala mikroruchów.

Test elektrycznego gojenia ran

Aby badać migrację komórek, zazwyczaj stosuje się rany mechaniczne poprzez usuwanie komórek z płytki hodowlanej za pomocą końcówek pipet, skrobaczek do komórek lub specjalnych stempli, a następnie obserwuje się ich remigrację mikroskopowo¹⁶. Ta metoda ma oczywistą wadę w postaci zmiennej wielkości zadrapania, która zazwyczaj jest zbyt duża, aby można było pominąć wpływ proliferacji komórek na proces gojenia rany. Funkcja zadawania ran w systemie ECIS wykorzystuje impuls o wysokim napięciu i wysokiej częstotliwości, aby uzyskać elektrodę wolną od komórek, a następnie śledzi remigrację sąsiednich komórek w miejsce komórek martwych (Rycyna 5A). Przewagą tej zautomatyzowanej metody nad standardowymi, pracochłonnymi testami zadrapania jest to, że ECIS generuje wysoce powtarzalną ranę o precyzyjnej średnicy 250 µm, która zamyka się w ciągu kilku godzin, co pozwala na badanie czystej migracji. Ponadto impuls elektryczny nie usuwa powłoki białkowej ani wydzielonej macierzy pozakomórkowej. Przy założeniu, że komórki remigrują na elektrodę ze wszystkich stron, szybkość migracji można łatwo obliczyć, dzieląc promień rany przez czas potrzebny do jej zamknięcia¹⁷. Jako alternatywę dla zadawania ran elektrycznych wprowadzono niedawno tzw. metodę elektrycznego ogrodzenia (nie pokazano). W tej metodzie impulsy o wysokim natężeniu prądu zapobiegają przyleganiu i migracji komórek na elektrodach po inokulacji. Komórki rosną wokół elektrody pomiarowej i zaczynają migrować do wewnątrz natychmiast po wyłączeniu impulsów elektrycznych. Przewagą elektrycznego ogrodzenia nad elektrycznym zadawaniem ran jest to, że powierzchnia elektrody nie została zmieniona przez wzrost lub usuwanie komórek, co jest istotne przy pomiarze wpływu różnych powłok na migrację komórek.

Stymulacja komórek

Oprócz badania migracji komórek, spektroskopia impedancyjna doskonale nadaje się do pomiaru wpływu leków i toksyn na komórki. Rysunek 5B przedstawia klasyczny eksperyment stymulacji/inhibicji, w którym trombinę wykorzystano do wywołania nadprzepuszczalności w konfluentnej barierze EC poprzez skurcz i tworzenie przerw między komórkami, co przejawia się jako przejściowy spadek rezystancji. Dzięki preinkubacji z inhibitorem kinazy Rho Y-27632 większość odpowiedzi na trombinę zostaje osłabiona poprzez obniżenie podstawowego napięcia komórkowego¹⁸ i blokowanie tworzenia włókien stresowych¹⁹. Następnie bloker kinazy Rho był stosowany w różnych punktach czasowych po dodaniu trombiny, co prowadziło do natychmiastowego i całkowitego przywrócenia szczelności bariery EC. W tym przypadku oczywista staje się zaleta systemu ciągłego pomiaru impedancji w badaniu ostrych odpowiedzi komórkowych. W standardowych testach punktowych (np. barwieniu immunofluorescencyjnym lub badaniu przenikania makrocząsteczek), wykrycie i kwantyfikacja tej ostrej odpowiedzi na zastosowany bloker byłyby bardzo trudne, jeśli nie niemożliwe. Ważne jest, aby zauważyć, że pomiary impedancji opisują przepuszczalność dla jonów, a nie dla makrocząsteczek. W tym celu należy odnieść się do pracy Aman et al.²⁰, w której przedstawiono doskonałe porównanie pomiarów ECIS z eksperymentami dotyczącymi przenikania makrocząsteczek.

Rycina 2. Reprezentatywny pomiar. Komórki MVEC hodowano na matrycach 8W1E powlekanych żelatyną przy niskiej gęstości wysiewu wynoszącej 5 000 cells/cm², a rejestrację MFT przeprowadzano przez 10 dni. Pomiar ilustruje różne wyniki eksperymentu ECIS: A) adhezja, rozprzestrzenianie się i proliferacja; B) formowanie i dojrzewanie konfluentnej bariery komórkowej; C) gojenie rany po zastosowaniu rany elektrycznej; D) stymulacja wazoaktywnym czynnikiem – trombiną. Dwie strzałki wskazują odświeżenia medium, które były wykonywane w odstępach 4 dni i dają wyobrażenie o czułości pomiarów na bodźce mechaniczne oraz zmiany temperatury i pH. Obrazy w górnym panelu odpowiadają pomiarowi i zostały pozyskane bezpośrednio z elektrody pomiarowej. Obraz w kontraście fazowym po lewej stronie przedstawia komórki śródbłonka 24 hr po inokulacji, zaczynające pokrywać elektrodę. Zdjęcia immunofluorescencyjne w centrum i po prawej stronie przedstawiają barwienie F-aktyny konfluentnej warstwy śródbłonka przed i po stymulacji trombiną (1 U/ml). Trombina powoduje kurczenie się komórek śródbłonka poprzez tworzenie tzw. włókien stresowych i przejściowe otwarcie szczelin międzyśródbłonkowych (strzałki i wstawki na obrazach), co jest rozpoznawalne w sygnale ECIS jako spadek rezystancji do poziomu bazowego. Tutaj staje się oczywista czułość pomiaru oraz sposób, w jaki zmiany w warstwie komórkowej korelują z sygnałem impedancji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3. Adhezja i wzrost komórek. Komórki MVEC od tego samego dawcy wysiano z trzema różnymi gęstościami na matrycach 8W10E powlekanych żelatyną, a wzrost komórek rejestrowano przy wielu częstotliwościach przez 60 hr. A) Wartości rezystancji dla trzech warunków przy optymalnej częstotliwości 4 kHz w celu pomiaru tworzenia bariery. Wszystkie trzy gęstości wysiewu utworzyły zlewne bariery o wartości ca. 1 200 Ω na koniec pomiaru; jednak tempo proliferacji (nachylenia krzywych) różni się znacząco. B) Pomiar pojemności przy 64 kHz dostarcza informacji o adhezji i rozprzestrzenianiu się komórek. Adhezja to początkowa faza plateau na krzywej pojemności (między 2-8 hr). Rozprzestrzenianie się, które jest w relacji liniowej do pokrycia elektrod, jest reprezentowane przez nachylenie krzywej i kończy się po 10-30 hr w zależności od gęstości wysiewu. Punkt czasowy t_1/2 (połowa maksymalnego pokrycia) może być wykorzystany do analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 4. Charakterystyka bariery konfluentnej. Komórki MVEC od dwóch dawców o różnych numerach pasażu (pasaż 3 i 6) wysiano na matryce 8W1E powlekane żelatyną, a następnie przeprowadzono pomiar MFT przez 30 hr w celu scharakteryzowania bariery EC. A) Pomiary rezystancji wykazują, że młodszy dawca 1 posiada wyższą rezystancję wynoszącą ca. 11,000 Ω w porównaniu do ca. 7,500 Ω u starszego dawcy 2. B-C) Możliwości modelowania ECIS zostały wykorzystane do znalezienia przyczyny niższej rezystancji. Modelowanie wykazało porównywalną interakcję komórka-komórka Rb i wskazało osłabioną interakcję komórka-macierz Alpha jako możliwą przyczynę. D) Wykonano RTC, aby za pomocą transformaty Fouriera ilościowo określić mikroruchy w konfluentnej warstwie komórek, gdzie pole pod krzywą jest proporcjonalne do mikroruchów. Analiza widm wykazuje mniejsze mikroruchy u starszego dawcy 2, co potwierdza wnioski, jakie można już wyciągnąć z sygnału rezystancji (mniejsza wariancja). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5. Migracja komórek po elektrycznym tworzeniu rany oraz efekty stymulacji trombyną. Rejestracja impedancji była prowadzona przy częstotliwości 4 kHz z maksymalną rozdzielczością czasową. A) MVEC od dawcy 1 (pasaż 3) oraz dawcy 2 (pasaż 6) hodowano do konfluencji na matrycach 8W1E powlekanych żelatyną. Następnie utworzono ranę elektryczną poprzez przyłożenie dwóch impulsów 5 V o częstotliwości 60 kHz, trwających po 20 sec każdy. Młodszy dawca 1 wykazał lepsze zdolności gojenia rany, co objawiało się szybszym zamykaniem rany (migracja, nachylenie krzywych) oraz wyższą opornością po zranieniu w porównaniu z starszym dawcą 2. B) HUVEC hodowano na matrycach 8W10E powlekanych żelatyną. Po osiągnięciu konfluencji komórki poddano głodzeniu surowiczym przez 1,5 hr poprzez zastąpienie pełnej pożywki wzrostowej pożywką bazową z dodatkiem 1% albuminy surowicy ludzkiej (HSA). Zastosowanie samej pożywki z HSA jest krokiem krytycznym, ponieważ składniki surowicy blokują odpowiedź na trombynę. Po wykryciu stabilnego plateau oporności trombynę dodano bezpośrednio do dołków i wymieszano ostrożnie za pomocą pipety 200 µl. Maksymalny efekt trombyny jest widoczny po 30 min i charakteryzuje się przejściowym spadkiem oporności do poziomu bazowego oraz o ca. 30-50% niższą opornością po regeneracji. Komórki inkubowano wstępnie z blokerem kinazy Rho Y-27632 przez 30 min lub bloker dodano 20, 30 lub 40 min po dodaniu trombyny, co natychmiast osłabiło efekt trombyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

ECIS jest doskonałym narzędziem do badań przesiewowych właściwości i zachowania komórek, a także do ilościowego określania skutków działania znanych i nieznanych substancji. W ten sposób komórki są utrzymywane w standardowych warunkach hodowli, impedancja może być stale monitorowana z wysoką rozdzielczością czasową i skorelowana z sygnałami optycznymi. W ten sposób można wybrać optymalny punkt czasowy dla manipulacji komórkami na podstawie morfologicznego i funkcjonalnego stanu komórki. Niestety, ta wysoka rozdzielczość pomiaru wiąże się z ceną, że niewielkie zmiany temperatury, pH lub mechaniczna stymulacja komórek (zmiana medium) natychmiast wpłyną na sygnał impedancji.

Zastosowanie małego prądu pomiarowego do ogniw sprawia, że pomiar ECIS jest nieinwazyjny, nieniszczący i bezznacznikowy, ale w rezultacie można mierzyć tylko pasywne właściwości bioelektryczne (brak potencjałów czynnościowych). Kluczową cechą jest to, że z jednego pomiaru można wyprowadzić szereg parametrów, łącząc informacje z kilku klasycznych testów, takich jak testy przepuszczalności lub gojenia się ran. W tym przypadku szczególnie interesującym aspektem jest to, że matematycznie modelowane dane można wykorzystać do zbadania zmian rezystancji i pojemności oraz odniesienia ich do odrębnych struktur komórkowych (np. kontaktów komórkowych lub błony komórkowej). Ważne jest, aby pamiętać, że spektroskopia impedancyjna zawsze zapewnia uśredniony sygnał ze wszystkich komórek na elektrodzie czujnikowej, co nie pozwala na badania na pojedynczych komórkach, a model matematyczny jest ważny tylko w zlewających się warstwach komórek. Dlatego komórki śródbłonka powinny być utrzymywane w stanie zlewania się przez co najmniej jeden dzień przed użyciem do modelowania, aby zapewnić dojrzałe zrosty komórkowe i komórki w stanie spoczynku. Podobnie, urazy elektryczne powinny być nakładane tylko na zlewające się warstwy komórek przy użyciu wielu krótkich impulsów uzwojenia o wysokich częstotliwościach, aby osiągnąć optymalną wydajność nawijania i zapobiec uszkodzeniu elektrod.

Aby uzyskać maksymalną ilość informacji z pomiaru ECIS, tak jak w każdym teście, przed eksperymentem należy przetestować i zoptymalizować kilka parametrów, takich jak kombinacja podłoża matrycowego, powłoka i gęstość wysiewu dla indywidualnego typu komórki.

Głównym ograniczeniem ECIS jest to, że pomiar nie dostarcza bezpośrednich informacji na poziomie molekularnym. W związku z tym pomiary ECIS są zwykle najbardziej pouczające na początku serii eksperymentalnej, aby pomóc powiązać problem naukowy ze strukturami lub właściwościami komórkowymi i dostarczyć istotnych danych wejściowych do wygenerowania możliwej do przetestowania hipotezy. W związku z tym modułowa konstrukcja ECIS zapewnia szerokie spektrum zastosowań z możliwością tworzenia matryc dostosowanych do indywidualnych potrzeb. Najnowsze osiągnięcia w dziedzinie matryc wskazują na przyszłe skupienie się na wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych impedancji do proliferacji komórek i zranień elektrycznych oraz na postęp w zakresie specjalnych matryc przepływowych do symulacji naprężeń ścinających in vivo o różnych profilach przepływu.

Dalsza literatura
Na stronie internetowej Biofizyki Stosowanej (www.biophysics.com) znajdują się noty aplikacyjne, seminaria internetowe i szczegółowy wykaz publikacji obejmujących całe spektrum ECIS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ECIS Zθ	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Monachium, Niemcy
8W1E PCB Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Monachium, Niemcy
8W1E Lexan Electrode Array	Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Monachium, Niemcy
8W10E PCB Electrode	Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA	ibidi GmbH, Monachium, Niemcy
L-Cystein	Merck Millipore	102838
Gelatin	Merck Millipore	104070
Trombin bydlęcy	Merck Millipore	604980
Albuman (Albumina surowicy ludzkiej)	Sanquin
Y-27632	Tocris Biosciences	1254
EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Długopis/Paciorkowiec	Lonza	17-602E