Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.
Artykuł metodologiczny
Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dysfunkcja mitochondriów jest znana z tego, że odgrywa znaczącą rolę w wielu stanach patologicznych, takich jak miażdżyca, cukrzyca, wstrząs septyczny i choroby neurodegeneracyjne, ale ocena zmian w funkcjach bioenergetycznych u pacjentów jest wyzwaniem. Chociaż choroby takie jak cukrzyca czy miażdżyca objawiają się klinicznie specyficznym upośledzeniem narządów, ogólnoustrojowe składniki patologii, takie jak hiperglikemia czy stan zapalny, może zmieniać funkcje bioenergetyczne krążących leukocytów lub płytek krwi. Koncepcja ta jest znana od pewnego czasu, ale jej szerokie zastosowanie było ograniczone przez dużą liczbę komórek pierwotnych potrzebnych do analizy bioenergetycznej. To ograniczenie techniczne zostało przezwyciężone poprzez połączenie specyfiki technik izolacji kulek magnetycznych, technik adhezji komórek, które umożliwiają przyłączanie komórek bez aktywacji do mikropłytek, oraz czułość nowych technologii przeznaczonych do wysokoprzepustowej respirometrii mikropłytkowej. Przykładem takiego sprzętu jest analizator strumienia zewnątrzkomórkowego. Takie oprzyrządowanie zazwyczaj wykorzystuje sondy wrażliwe na tlen i pH do pomiaru szybkości zmian tych parametrów w przylegających komórkach, które można następnie powiązać z metabolizmem. Tutaj szczegółowo opisujemy metody izolacji i powlekania monocytów, limfocytów, neutrofili i płytek krwi, bez aktywacji, z ludzkiej krwi oraz analizę bioenergetycznej funkcji mitochondriów w tych komórkach. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób wybuch oksydacyjny w monocytach i neutrofilach może być również mierzony w tych samych próbkach. Ponieważ metody te wykorzystują tylko 8-20 ml ludzkiej krwi, mają potencjał do monitorowania reaktywnych form tlenu, wytwarzania i bioenergetyki w warunkach klinicznych.
Wprowadzenie
Monitorowanie zdrowia bioenergetycznego komórek odpornościowych (monocytów, limfocytów, neutrofili) i płytek krwi z krwi jest od pewnego czasu uznawane za potencjalnie użyteczne narzędzie diagnostyczne do oceny ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby. Pojawia się nowa literatura przypisująca dysfunkcji mitochondriów szereg chorób, takich jak nowotwory, choroby układu krążenia i choroby neurodegeneracyjne1,2. Jest to klinicznie ważne, ponieważ dysfunkcja mitochondriów może zainicjować serię zdarzeń komórkowych, które promują prozapalne szlaki sygnałowe lub prowadzą do śmierci komórki. W kilku badaniach scharakteryzowano funkcję mitochondriów komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i płytek krwi w stanach takich jak fibromialgia, cukrzyca, wstrząs septyczny i choroba Alzheimera3-7. Na przykład w niedawnym badaniu oceniono bioenergetykę płytek krwi jako markera funkcji mitochondriów i stwierdzono, że płytki krwi od pacjentów z cukrzycą typu 2 zmniejszyły zużycie tlenu w mitochondriach7,8. Z tych i innych odkryć jasno wynika, że monocyty, limfocyty, neutrofile i płytki krwi mogą służyć jako zastępcze markery zmian w bioenergetyce w warunkach patologicznych, ponieważ badają krążenie ogólnoustrojowe i mogą odzwierciedlać lokalne i globalne zmiany metaboliczne. Aby określić, czy podejście to ma wartość prognostyczną, czy diagnostyczną, wymagana jest metoda analizy o wysokiej przepustowości i spójna metoda przygotowania komórek.
Metody pomiaru funkcji mitochondriów w leukocytach i płytkach krwi wcześniej obejmowały izolację mitochondriów lub ocenę bioenergetyki komórkowej w nienaruszonych komórkach4,9. Zaletą komórkowej oceny bioenergetycznej za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (XF) jest to, że funkcję mitochondriów w komórkach można ustalić za pomocą endogennych substratów i określić parametry oddechowe, takie jak wyciek protonów i maksymalna wydolność oddechowa. My i inni wykorzystaliśmy tę technologię, aby pokazać, że profile bioenergetyczne w płytkach krwi, monocytach i limfocytach wyizolowanych z ludzkiej krwi mogą być ustalane i porównywane między typami komórek8. Ponadto zarówno neutrofile, jak i monocyty posiadają zdolność do wybuchu oksydacyjnego, w którym oksydazy NAPDH są aktywowane i zużywają tlen do wytworzenia ponadtlenku. Co ważne, szlak ten jest kluczowym składnikiem odporności wrodzonej i jest modulowany przez ogólnoustrojowy stan zapalny. Na przykład wykazano, że zmiany w zdolności wybuchu oksydacyjnego są związane z różnymi chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak stwardnienie rozsiane, zapalenie stawów i nawracające infekcje10,11. Obecnie nie ma wysokoprzepustowych testów ilościowych do pomiaru wybuchu oksydacyjnego w próbkach klinicznych. Jest to ważne, ponieważ scharakteryzowanie zdolności wybuchu oksydacyjnego neutrofili i monocytów może również służyć jako ważne narzędzie diagnostyczne dla kilku patologii.
Kluczowymi wyzwaniami technicznymi były niska czułość pomiaru zużycia tlenu przy użyciu konwencjonalnych technik polarograficznych oraz konieczność korzystania z dołączonych komórek przy użyciu bardziej czułych technik fluorometrycznych mikropłytek. W tym praktycznym filmie opisujemy techniczne rozwiązanie tych problemów. Szczegółowo opisujemy metody izolacji, galwanizacji i pomiaru bioenergetyki monocytów, limfocyty, neutrofile i płytki krwi oraz wybuch oksydacyjny monocytów i neutrofili z ludzkiej krwi. Metoda ta jest odpowiednia do klinicznej oceny bioenergetyki i wybuchu oksydacyjnego dla badaczy, którzy mają dostęp do populacji pacjentów i możliwość uzyskania świeżych próbek krwi.
Protokół
Wszystkie protokoły opisane w tym manuskrypcie dotyczące pobierania, izolacji i analizy krwi zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie Alabama w Birmingham.
1. Izolacja komórek (zmodyfikowana z Histopaque Sigma-Aldrich Protocol No. 1119 i Miltenyi Biotec MicroBead Positive and Negative Selection Protocols)
- Odwirować krew pełną (zebraną w probówkach ACD lub EDTA) o masie 500 x g przez 15 minut w wirówce z wirnikiem z odchylanym wirnikiem (przyspieszenie = 5-6 i bez hamulca).
- Usunąć górną warstwę zawierającą osocze bogatopłytkowe (PRP) za pomocą pipety transferowej, aż 1 cm pozostanie ponad warstwę komórkową (erytrocyty/kożuch). Odłóż PRP w temperaturze pokojowej do późniejszego przetworzenia.
- Przenieść otoczkę kożuchową do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, rozcieńczyć do 24 ml za pomocą podstawowego RPMI lub do co najmniej 4-krotności początkowej objętości kożucha kożuchowego.
Uwaga: Może być konieczne uwzględnienie górnej połowy warstwy RBC, chociaż spowoduje to proporcjonalne zwiększenie objętości RPMI. - Przygotować gradient gęstości za pomocą Ficollu o niskiej gęstości i ciężarze właściwym 1,077 (1077) dla warstwy górnej i Ficollu o wysokiej gęstości i ciężaru właściwego 1,119 (1119) dla warstwy dolnej w trzech stożkowych probówkach o pojemności 15 ml (każda po 3 ml). Aby wykonać ten krok, najpierw dodaj 1077 do każdej probówki. Za pomocą wąskiej pipety o pojemności 5 ml dodaj 1119 na dno probówki, umieszczając końcówkę pipety poniżej 1077 i powoli uwalniaj odczynnik, nie mieszając go z górnym gradientem. Na tym etapie powinno znajdować się łącznie 6 ml pożywki o gradiencie gęstości z widoczną fazą separacji na znaku 3 ml.
- Za pomocą automatycznej pipety delikatnie dodaj 8 ml rozcieńczonej krwi (z kroku 1.3) do każdej probówki gradientowej, używając ustawienia niskiej mocy, aby zapobiec naruszeniu warstw gradientu. Na tym etapie całkowita objętość powinna wynosić 14 ml.
- Probówki wirówkowe o ciśnieniu 700 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej (przyspieszenie 6, bez hamulca).
Uwaga: Na tym etapie powinny być widoczne trzy wyraźne pasma komórek (ryc. 1A). Najwyższe pasmo (między 1077 a osoczem) zawiera komórki jednojądrzaste (MNC) i płytki krwi, a środkowe pasmo (między 1007 a 1119) zawiera komórki wielojądrzaste (PMN), a dolne pasmo (poniżej 1119) zawiera erytrocyty. - Zebrać MNC i PMN oddzielnie za pomocą sterylnych szklanych pipet, nie naruszając innych pasm komórek. Połącz populację MNC z każdej probówki w sterylną stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Powtórz to również dla populacji PMN.
- Dodaj 4 objętości RPMI do każdej probówki zawierającej odpowiednio frakcje MNC i PMN, aby rozcieńczyć gradient gęstości.
- Probówki wirować o masie 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
- Zawiesić osad komórek MNC i osad komórek PMN w 1 ml RPMI zawierającym 0,5% ultraczystego BSA WOLNEGO OD ULTRA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (RPMI-BSA) i przenieść do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Osadzać komórki za pomocą pikofugi stołowej przez 30 sekund.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 80 μl RPMI-BSA.
- Dodać 20 μl przeciwciała antyCD14 znakowanego kulkami magnetycznymi do probówki zawierającej frakcję MNC w celu pozytywnej selekcji monocytów. Do probówki zawierającej frakcję komórkową PMN dodać 20 μl przeciwciała antyCD15 znakowanego kulkami magnetycznymi w celu pozytywnej selekcji neutrofili. Inkubować zawiesinę każdej komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Przemyć zawiesinę każdej komórki 1 ml pożywki i granulki RPMI-BSA jak poprzednio, a następnie ponownie zawiesić każdą osadkę w 500 μl RPMI-BSA.
- Oznakowane komórki są rozdzielane w polu magnetycznym separatora sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Przygotować kolumny MACS LS (po jednej na każdą zawiesinę komórek), umieszczając kolumnę na separatorze MACS i przemłukując 3 ml RPMI-BSA przed dodaniem zawiesiny komórek.
- Po nałożeniu zawiesin komórkowych umyj każdą kolumnę 3x 3 ml pożywki RPMI-BSA (upewnij się, że pożywka całkowicie spłynęła między praniami). Zebrać przepływ zawiesiny komórkowej i przepłukać kolumnę do sterylnej probówki.
- W celu wyizolowania monocytów i neutrofili, po ostatnim płukaniu należy usunąć kolumnę z pola magnetycznego i wymyć pozytywnie wybrane komórki do sterylnej probówki z 5 ml RPMI-BSA za pomocą tłoka kolumny.
- Aby wyizolować limfocyty, należy zagnieździć frakcję przepływową MNC z kroku 1.15 w temperaturze 300 x g przez 10 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 80 μl RPMI-BSA. Dodać 20 μl przeciwciał CD61 i CD235a i inkubować zawiesinę komórek przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć separację MACS jak poprzednio i zebrać przepływ zawierający limfocyty.
- Aby osadzać monocyty, neutrofile i frakcje limfocytów, należy odwirować jak poprzednio (krok 1.9) i odrzucić supernatanty. Osady komórkowe należy ponownie zawiesić w 1 ml pożywki o strumieniu zewnątrzkomórkowym (XF-DMEM) w celu zliczenia.
Uwaga: 8 ml krwi pełnej powinno dać 1-5 x 106 monocytów/ml i 5-20 x 106 limfocytów i neutrofili/ml. - Aby wyizolować płytki krwi, odwirować PRP (krok 1.2) przez 8-10 minut w temperaturze 1 500 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć osocze i przemyć jednokrotnie osad komórek sterylnym 5 ml PBS uzupełnionym 1 μg/ml PGI2, ponownie umieścić granulkę i zawiesić ostateczną osadkę w 1 ml buforu PBS-PGI2.
- Oznaczyć liczbę płytek krwi za pomocą mętności, gdy płytki krwi zostaną zawieszone w buforze PBS-PGI2 za pomocą spektrofotometru, jak opisano przez Walkowiaka i wsp., używając następującego równania: [6,23/(2,016 – Abs800)] – 3,09 x współczynnik rozcieńczenia = # x 108 płytek krwi/ml 12.
2. Poszycie komórek
- Przygotowanie Cell-Tak (klej komórkowy): Dodać 90 μl kleju komórkowego do 180 μl diH20, 540 μl 0,1 N wodorowęglanu sodu (pH 8,0) i dostosować pH do 7,2-7,8 za pomocą 1 N NaOH. Przygotować płytki XF (24-dołkowe, mikropłytki V7), pokrywając każdą studzienkę 30 μl przygotowanego kleju komórkowego.
Uwaga: Klej komórkowy powinien być przygotowywany świeży do każdego użycia. - Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20-30 minut, następnie odessać klej komórkowy i przemyć studzienki dwukrotnie PBS (1 ml / dołek).
- Przeprowadzić liczenie komórek na izolowanych monocytach, limfocytach, neutrofilach i płytkach krwi i doprowadzić do odpowiedniej objętości za pomocą XF-DMEM, aby umożliwić gęstość wysiewu 250 tys. komórek / dołek dla monocytów, limfocytów i neutrofili oraz 25 x 106 / dołek dla płytek krwi. Alternatywnie, aby zmierzyć odpowiedź impulsu oksydacyjnego, neutrofile można wysiać w 125 tys. komórek / studzienkę. Ostateczna objętość wysiewu dla każdej zawiesiny komórkowej powinna wynosić 200 μl/dołek.
- Odwirować płytkę o masie 200 x g przez 1 sekundę bez hamowania. Obrócić płytkę o 180° i ponownie odwirować bez hamulca przy 300 x g.
- Doprowadzić końcową objętość studzienki do 660 μl za pomocą XF-DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed testem XF. Uwaga: Mikrofotografie posianych komórek przed i po teście mogą być wykorzystane w celu zapewnienia odpowiedniego posiewu i wykluczenia oderwania komórek.
3. Przygotowanie 24-dołkowej płytki do badania strumienia zewnątrzkomórkowego (XF24)
- Sondy XF należy uwodnić roztworem kalibru przez co najmniej 2 godziny przed badaniem.
- Przygotuj 10 porcji 0,5 μg/ml oligomycyny, 0,6 μM FCCP i 10 μM antymycyny A w XF-DMEM i załaduj 75 μl roztworów podstawowych do portów iniekcji kartridży w powyższej kolejności. Jeśli mają być uzyskane pomiary impulsu oksydacyjnego, po antymycynie-A można wstrzyknąć 10-krotny zapas 100 ng / ml PMA.
- Skalibruj uwodniony i załadowany wkład i wykonaj test XF. Szczegółowe metody analizy i interpretacji zarówno zużycia tlenu, jak i zmian pH zostały opisane w poprzednich publikacjach9,13,14 i nie są tutaj szczegółowo omawiane.
- Po teście XF odessać wszystkie oprócz ostatnich 50 μl XF-DMEM po teście, aby zapobiec utracie komórek z płytki i dodać 50 μl buforu do lizy komórek RIPA i wykonać test białka w celu normalizacji.
Wyniki
W celu oceny bioenergetyki komórek krwi, pobiera się krew pełną od ludzi poprzez nakłucie żyły do probówek próżniowych z EDTA lub ACD. Izolacja leukocytów i płytek krwi po pobraniu krwi jest przedstawiona na Rysunku 1A, zgodnie ze szczegółami zawartymi w protokole. Próbki krwi pełnej są przetwarzane w ciągu 8 hr od pobrania, aby uniknąć śmierci i aktywacji komórek. Wydłużony czas przechowywania przekraczający 8 hr nie został przebadany, lecz może prowadzić do zmian w bioenergetyce i być mniej reprezentatywny dla warunków fizjologicznych. Do izolacji komórek stosowano probówki próżniowe z kwasem cytrynowym, dekstrozą (ACD-8 ml) i EDTA, nie obserwując wpływu na funkcje bioenergetyczne izolowanych komórek. Przeciwzakrzepowe są niezbędne, ponieważ skrzepy zmniejszają liczbę otrzymanych komórek, zakłócają prawidłowe formowanie się faz podczas wirowania w gradiencie Ficoll oraz powodują uzyskanie niewielkiej ilości lub całkowity brak płytek krwi w odwirowanej surowicy. Cała krew stanowi zagrożenie biologiczne, dlatego podczas całej procedury należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, nawet po wyizolowaniu populacji komórek lub przygotowaniu lizatów komórkowych. Próbki należy utylizować zgodnie z instytucjonalnymi standardami utylizacji odpadów pochodzenia ludzkiego.
Krew pełną wiruje się w celu oddzielenia osocza bogatego w płytki krwi od warstwy leukocytarnej (buffy coat), czyli białej warstwy znajdującej się bezpośrednio nad osadem erytrocytów, która zawiera leukocyty. Warstwę leukocytarną nakłada się na gradienty gęstości i wiruje, aby uzyskać mononuklearne komórki krwi obwodowej (monocyty i limfocyty) oraz komórki wielojądrowe (granulocyty). Zanieczyszczenie poszczególnych frakcji MNC i PMN erytrocytami jest na tym etapie powszechne i powinno zostać usunięte podczas oczyszczania metodą MACS. Następnie poszczególne typy komórek otrzymuje się poprzez inkubację z przeciwciałami magnetycznymi w celu uzyskania czystych frakcji. Monocyty zbiera się poprzez inkubację frakcji PBMC z CD14; ciecz przepływowa po wydzieleniu monocytów zawiera limfocyty, które następnie są oczyszczane z erytrocytów i płytek krwi. Neutrofile otrzymuje się poprzez inkubację warstwy komórek wielojądrowych z przeciwciałem CD15 (Rysunek 1A). Następnie płytki krwi można wytrącić poprzez wirowanie osocza bogatego w płytki krwi i przemyć, aby usunąć pozostałe składniki osocza. Po tych selekcjach płytki krwi, monocyty CD14+, limfocyty oraz neutrofile CD15+ mogą zostać policzone i wysiane na płytkę analizatora XF pokrytą medium do adhezji komórkowej w celu analizy bioenergetyki i wyrzutu oksydacyjnego.
Każdy etap procedury powinien być przeprowadzany w warunkach sterylnych, co jest zalecane w celu zapobiegania przedwczesnej aktywacji odpowiedzi oksydacyjnej w monocytach i neutrofilach. Wskaźnikiem niedostatecznej sterylności podczas izolacji jest sytuacja, w której neutrofile, wykazujące niewielkie lub żadne zużycie tlenu w warunkach podstawowych, rozpoczynają test przepływu zewnątrzkomórkowego z podwyższonymi pomiarami OCR, które stopniowo rosną lub spadają w trakcie analizy. Podkreślamy znaczenie obrazowania komórek za pomocą mikroskopii świetlnej przy powiększeniu 200X lub większym, aby upewnić się, że przed testem nie wystąpiły morfologiczne oznaki aktywacji. Na przykład neutrofile zazwyczaj wykazują kształt od okrągłego do nieregularnego z wyraźnymi granicami komórek, co widoczne jest na Ryc. 1B. Jednakże komórki te, po aktywacji, spłaszczają się na powierzchni płytki i tracą swoją charakterystyczną morfologię. Wcześniej opisaliśmy zmiany morfologiczne aktywowanych leukocytów i płytek krwi przy użyciu tego protokołu; w przypadku stwierdzenia aktywacji należy podjąć dodatkowe środki w celu zapewnienia warunków sterylnych8.
Uproszczony schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 2 w formie harmonogramu, w którym szczegółowo opisano główne etapy izolacji komórek, przygotowania płytki XF oraz analizy XF. Izolacja polega na rozdziału typów komórek metodą gradientu gęstości, po której następuje separacja magnetyczna. Równolegle do procesu izolacji komórek konieczne jest przygotowanie płytki XF, aby uniknąć opóźnień w wysiewaniu komórek lub rozpoczęciu analizy XF. Jest to krytyczne, ponieważ znaczne opóźnienia mogą prowadzić do aktywacji komórek i pogorszenia parametrów bioenergetycznych.
Niewystarczające stężenia komórek po izolacji są powszechnym problemem, a optymalizacja każdego procesu wirowania jest niezbędna, aby uniknąć utraty komórek. Udane izolacje przeprowadzono przy użyciu nawet 6 ml krwi, jednak można wprowadzać zmiany w zależności od stężeń krążącego pożądanego typu komórek. Jeśli gradient gęstości zostanie przygotowany nieprawidłowo, wyraźne fazy komórkowe mogą nie być widoczne i może dojść do utraty komórek (wizualną demonstrację przedstawiono w filmie instruktażowym JoVE). Niedostateczna ilość płytek krwi wyizolowanych z PRP zdarza się rzadko, ale wystąpiła w przypadkach, gdy bufor piorący nie zawierał PGI2 lub gdy izolacja odbywała się w temperaturze poniżej temperatury pokojowej. Ryzyko aktywacji płytek krwi jest często ograniczane, jeśli są one ostatnimi izolowanymi komórkami; jednak w przypadku pozostawienia płytek w buforze piorącym przez dłuższy czas, ich bioenergetyka zostanie zaburzona. Odnotowano przypadki mniejszych populacji płytek krwi, które nie tworzyły osadu podczas wirowania przy 1,500 x g, a bioenergetyka tych komórek nie została szczegółowo scharakteryzowana. Bardziej kompletny przewodnik rozwiązywania problemów znajduje się w Tabeli 2.
Profile bioenergetyczne leukocytów i płytek krwi można oznaczyć przy użyciu analizatora XF, który w sposób nieinwazyjny mierzy zużycie O2 w komórkach w czasie rzeczywistym. Każdy typ komórek jest wysiewany na płytkę XF24 w pięciu powtórzeniach, jak pokazano na Rysunku 3A. Tabela 1 przedstawia oczekiwane wartości podstawowe i wartości wyrzutu oksydacyjnego dla poszczególnych typów komórek podczas analizy oraz średnie stężenia białka na studzienkę. Dostępne są technologie o wyższej przepustowości, takie jak XF96, która umożliwia jednoczesną ocenę czterech dawców, co przedstawiono na Rysunku 3B. Po zakończeniu analizy dane są eksportowane do stacji roboczej w celu analizy z wykorzystaniem odpowiedniego oprogramowania XF oraz programu Microsoft Excel. Wartości OCR zostały znormalizowane do całkowitej zawartości białka w odpowiadających im studzienkach i wyrażone jako pmol/min/mg białka. Reprezentatywne profile bioenergetycznego wyrzutu oksydacyjnego dla każdego typu komórek zostały niedawno opisane przez nasz zespół8. Dalsza analiza parametrów bioenergetycznych testu (podstawowe, związane z ATP, wyciek protonów, maksymalne, niemitochondrialne i wyrzut oksydacyjny) może być obliczana dla poszczególnych studnikek, jak wykazano wcześniej i opisano poniżej8.
Bazowy poziom zużycia tlenu (OCR) zostaje ustalony na podstawie pierwszych 3 pomiarów, jak pokazano na Rysunku 4A. Do pożywki XF wstrzykuje się oligomycynę (0,5 µg/ml), inhibitor mitochondrialnej syntazy ATP, aby oszacować OCR powiązany z syntezą ATP, reprezentowany jako OCR związany z ATP (ATP-linked). Pozostały OCR pomniejszony o OCR niemitochondrialny można przypisać do przecieku protonów. Następnie dodaje się FCCP, który jest odsprzęgaczem, aby określić maksymalny OCR, a następnie antymycynę A, inhibitor oddychania mitochondrialnego, w celu określenia niemitochondrialnych źródeł zużycia tlenu. Pojemność rezerwowa jest miarą ilości ATP, która może zostać wyprodukowana w warunkach zapotrzebowania energetycznego i może być obliczona jako różnica między maksymalnym tempem oddychania a bazowym. Aby określić zdolność do wywołania wyrzutu tlenowego, wstrzykuje się 12-mirystynian 13-octan forbolu (PMA), agonistę PKC, w celu zwiększenia aktywnościy NADPH-oksydazy, a wzrost tempa zużycia tlenu po stymulacji PMA można zmierzyć za pomocą analizatora XF. Rysunek 4B pokazuje, jak obliczać poszczególne parametry funkcji mitochondrialnej i wyrzutu tlenowego.
Rysunek 1. Izolacja leukocytów i płytek krwi z krwi pełnej. A) Świeżo pobrane próbki są rozdzielane na osocze i składniki komórkowe poprzez wirowanie, a następnie oczyszczane za pomocą gradientu gęstości Ficoll oraz magnetycznego sortowania komórek (MACS) poprzez selekcję pozytywną (monocyty i neutrofile) lub negatywną (limfocyty), podczas gdy płytki krwi są izolowane przez wirowanie osocza bogatego w płytki krwi z dużą prędkością. B) Obrazy izolowanych populacji komórek po resuspensji w XF DMEM i wysianiu przy wskazanych gęstościach komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2. Przygotowanie płytek XF24 do badań bioenergetycznych leukocytów i płytek krwi. Szczegółowy harmonogram przygotowania płytki analizy XF24 poprzez izolację i wysiewanie komórek oraz nawilżanie kartridża i napełnianie portów wstrzykiwania.
Rysunek 3. Układ leukocytów i płytek krwi na płytkach analizatora XF24 i XF96. A) Leukocyty (125-250k komórek/studzienkę) i płytki krwi (25 x 106 komórek/studzienkę) od jednego dawcy są wysiewane na płytkę testową XF24 pomiędzy kontrole tła. 75 µl 10-krotnych stężenia zapasów oligomycyny (0,5 µg / ml), FCCP (0,6 µM), antymycyny-A (10 µM) oraz PMA (100 ng/ml) rozpuszczonych w medium XF są wprowadzane do wskazanych portów wtryskowych. B) Leukocyty (75-150k komórek/studzienkę) i płytki krwi (10 x106 komórek/studzienkę) od maksymalnie czterech dawców mogą być wysiewane na płytkę XF96 w całkowitej objętości 180 µl XF-DMEM. 20 µl 10-krotnych stężenia zapasów oligomycyny (1,0 µg/ml), FCCP (0,6 µM), antymycyny-A (10 µM) oraz PMA (100 ng/ml) rozpuszczonych w XF-DMEM są wprowadzane do wskazanych portów wtryskowych.
Rycina 4. Analiza wskaźników bioenergetycznych. A) Reprezentatywny przebieg tempa zużycia tlenu (OCR) przez mitochondria oraz wyrzutu tlenowego w monocytach. Ustalono podstawowy poziom OCR (pierwsze 3 wartości wskazane liczbami w okręgach). Następnie sekwencyjnie wstrzyknięto oligomycynę (O; 0,5 µg/ml), FCCP (F; 0,6 µM) i antymycynę-A (A; 10 µM), aby określić oddychanie mitochondrialne i pozamitochondrialne nieaktywowanych komórek. Na koniec dodano PMA (100 ng/ml), aby zmierzyć wyrzut tlenowy. B) Modułowa analiza funkcji mitochondrialnych i wyrzutu tlenowego obliczona na podstawie różnic w tempach zużycia, zgodnie z oznaczeniami.
| Optymalna gęstość wysiewu | Śr. podstawowy OCR (pmol O22/min) | Śr. OCR wyrzutu oksydacyjnego (pmol O2)2/min) | Śr. białka (µg)/dołek | |
| Monocyty | 250 tys. komórek/dołek | 83.9 ( ± 13.0) | 300.3 ( ± 58.8) | 19.0 ( ± 2.4) |
| Neutrofile | 250 tys. komórek / dołek | 6.1 ( ± 2.2) | 1411.8 ( ± 233.3) | 20.6 ( ± 2.7) |
| Limfocyty | 250 tys. komórek / studzienkę | 52.9 ( ± 7.7) | 15 ( ± 4.1) | 13.2 ( ± 2.1) |
| Trombocyty | 25 x 106 komórek / studzienkę | 199.4 ( ± 20.3) | 24 ( ± 2.7) | 47.5 ( ± 3.1) |
Tabela 1. Normalne parametry dla analizy XF24: Średnie podstawowe (Rate 3) i oksydacyjne wyrzuty (Rate 7) OCR, niekorygowane względem OCR niemitochondrialnego ani białka, przedstawiono w zależności od typu komórek wysianych przy wskazanych gęstościach. Średnią zawartość białka na dołek wyznaczono za pomocą metody Lowry'ego (DC Lowry). Dane te reprezentują wartości średnie dla 6-8 zdrowych dawców, przy czym w nawiasach podano ± SEM.
| Krok | Problem | Możliwa przyczyna | Rozwiązanie |
| 1.2 | przezroczysta plazma | osadzenie się płytek krwi podczas wirowania | skrócić czas wirowania do 10 min lub zmniejszyć prędkość do 400 x g |
| mętna plazma | nadmiar lipidów | unikać pobierania krwi po posiłku | |
| 1.6 | niecałkowite utworzenie się pierścieni komórkowych | nieprawidłowe przygotowanie gradientu, zimny odczynnik | unikać zaburzania gradientu podczas pipetowania, używać odczynników o temperaturze pokojowej |
| grudki w pierścieniach komórkowych | mógł nastąpić proces krzepnięcia krwi | pobierać krew z użyciem przeciwkrzepliwych, takich jak ACD lub EDTA | |
| 1.10 | brak osadu komórkowego | patrz krok 1.6 | jeśli supernatant jest mętny, patrz poniżej |
| mętny supernatant | silne zanieczyszczenie gradientem Ficoll, zanieczyszczenie płytkami krwi | zwiększyć prędkość wirowania do 900 x g, rozcieńczyć większą ilością RPMI | |
| 1.16, 1.17 | niska wydajność leukocytów | silne zanieczyszczenie RBC, zbyt mała ilość krwi pełnej, krzepnięcie | podwoić objętość przeciwciał i RPMI-BSA, pobrać więcej krwi, dodać przeciwkrzepliwie |
| 1.19 | agregacja płytek krwi | pominięcie PGI2, ekspozycja na zimne medium, przedłużone przechowywanie w plazmie | dodać PGI2 do buforu do płukania płytek, używać odczynników o temperaturze pokojowej |
| 1.20 | niska liczba płytek krwi | strata podczas wirowania wstępnego, agregacja płytek krwi | patrz kroki 1.2 i 1.19 |
| 2.3 | zanieczyszczenie RBC | powtórzyć separację MACS |
Tabela 2. Rozwiązywanie problemów podczas izolacji leukocytów i płytek krwi. Tabela wymienia typowe problemy występujące podczas izolacji leukocytów i płytek krwi z krwi pełnej oraz rozwiązania, które mogą pomóc użytkownikom w procesie rozwiązywania problemów.
Dyskusja
Protokół ten stanowi kompilację kilku powszechnie stosowanych technik izolacji komórek krwi w sposób odpowiedni do analizy bioenergetycznej. Przedstawione techniki przylegające do siebie są korzystne w porównaniu z innymi metodami izolacji (tj. analizą FAC) ze względu na ich zdolność do izolowania dużej liczby komórek w kontrolowanych warunkach pożywki przy minimalnym obciążeniu izolowanych komórek. Ma tę wadę, że zapewnia długie izolacje nawet przy minimalnych przerwach. Protokół ten służy jako podstawa do izolacji pierwotnych komórek krwi od ludzi, które można ekstrapolować na warunki kliniczne i badania translacyjne.
Separacja MACS to niezawodna technika izolacji komórek, która daje możliwość izolowania komórek bezpośrednio z krwi pełnej; Jednak ta metoda wymaga większych ilości przeciwciał i nie jest optymalna do izolacji wszystkich czterech różnych typów komórek, jak opisano w tej metodzie. Nie ma dowodów na to, że pozytywna selekcja leukocytów przez separację MACS powoduje aktywację przy użyciu naszego protokołu izolacji. Kolumny MACS działają poprzez sekwestrację znakowanych komórek w polu magnetycznym przy użyciu przeciwciał sprzężonych z cząstkami superparamagnetycznymi o długości fali 50 nm. Komórki oznaczone etykietami są następnie eluowane z kolumny. W tym protokole zaimplementowano selekcje pozytywne i negatywne, aby zapewnić szybką izolację i czystość. Jeśli w wyniku izolacji uzyska się nieodpowiednią liczbę komórek lub kwestionowana jest czystość, do próbki można dodać więcej przeciwciał zgodnie z instrukcją dostawcy, a drugie przejście przez kolumnę LS może skutkować większą czystością (tabela 2). Nasze laboratorium stwierdziło wysoką czystość i wydajność galwanu przy użyciu istniejącego protokołu, analizując końcowe zawiesiny komórek za pomocą analizy FACS8.
Analizatory strumienia zewnątrzkomórkowego mają możliwość monitorowania zarówno zużycia tlenu, jak i zakwaszenia mediów w czasie rzeczywistym w porównaniu z innymi elektrodami. Zużycie tlenu obserwowane przez odpowiedź wybuchu oksydacyjnego w monocytach i neutrofilach jest zależne od oksydazy NADPH, co pokazuje hamowanie za pomocą DPI8. Zaobserwowaliśmy zależną od czasu utratę zdolności do wybuchów oksydacyjnych przy przedłużonych izolacjach lub rozszerzonych testach XF. Protokół ten został zaprojektowany i opracowany do użytku w XF24, ale jest również zgodny z XF96 przy około jednej trzeciej do połowy gęstości wysiewu komórek XF24 (ilustracja 3).
Podczas projektowania tego protokołu wymagane było przestrzeganie istniejących protokołów dla każdej techniki w celu uzyskania optymalnej wydajności, z modyfikacjami wprowadzonymi wyłącznie w celu kontrolowania warunków podłoża do analizy bioenergetycznej. Po opanowaniu technik, taki protokół może być stosowany w szerokim zakresie zastosowań translacyjnych i badawczych do pomiaru toksyczności lub skuteczności strategii leczenia, badania charakterystyki metabolicznej choroby oraz produkcji utleniaczy przez monocyty i neutrofile w stanach zapalnych.
Oświadczenia
VDU jest członkiem Naukowej Rady Doradczej Seahorse Bioscience.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować za techniczny wkład Glorii A Benavides. Praca ta była wspierana przez American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK Diabetic Complications Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) grant DK076169 (subgrant VDU) oraz O'Brien Center P30 DK079337 (VDU).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw startowy QuadroMACS zawiera separator QuadroMACS i stojak MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
| CD235a (glikoforyna A) Mikrokulki, ludzkie | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
| CD61 Mikrokulki, ludzkie do płytek krwi | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
| CD14 Mikrokulki, ludzkie do monocytów | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| CD15 Mikrokulki, ludzkie do granulocytów | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
| LS Kolumny | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| BD Vacutainer ACD Probówki do pobierania krwi | Fisher | 02-684-26 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | z L-glutaminą i bez czerwieni fenolowej |
| Prostaglandyna I2, sód sól | Cayman | 18220 | |
| 1,5 ml półmikro kuwety | Produkty badawcze Phenix | SC-2410 | |
| Gradient gęstości histopacznej, ciężar właściwy 1,077 | Sigma | 10771 | |
| Gradient gęstości histopatycznej, ciężar właściwy 1,119 | Sigma | 11191 | |
| Albumina surowicy bydlęcej Frakcja V | Roche | 3117405001 | ultra wolne od kwasów tłuszczowych |
| 12-mirystynian 13-octan | Phorbol Sigma | P8139 | |
| XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
| DMEM | Fisher | MT90113PB | bez glukozy, L-glutaminy, pirogronianu, czerwieni fenolowej i wodorowęglanu |
| L-glutaminy, 200 mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
| D-Glucose | Sigma | G7528 | |
| Pirogronian sodu | Sigma | P8574 | |
| Cell-Tak (adhezja komórkowa) | BD Biosciences | CB-40242 | |
| Oligomycyna | Sigma | O4876 | |
| Antymycyna A | Sigma | A8674 | |
| (FCCP) 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu | Sigma | C-2920 | |
| Odczynnik do oznaczania białek DC | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Odczynnik do oznaczania białek DC S | Bio-Rad | 500-0015 | |
| Odczynnik do oznaczania białek DC B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Seahorse | Biosciences | ||
| Separator QuadroMACS i | |||
Bibliografia
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int. J. Alzheimer's Dis. 2009, (2009).
- Jin, S. Autophagy, mitochondrial quality control, and oncogenesis. Autophagy. 2, 80-84 (2006).
- Cordero, M. D., et al. Mitochondrial dysfunction and mitophagy activation in blood mononuclear cells of fibromyalgia patients: implications in the pathogenesis of the disease. Arthritis Res. Ther. 12, R17(2010).
- Japiassu, A. M., et al. Bioenergetic failure of human peripheral blood monocytes in patients with septic shock is mediated by reduced F1Fo adenosine-5'-triphosphate synthase activity. Crit. Med. 39, 1056-1063 (2011).
- Widlansky, M. E., et al. Altered mitochondrial membrane potential, mass, and morphology in the mononuclear cells of humans with type 2 diabetes. Transl. Res. 156, 15-25 (2010).
- Shi, C., et al. Effects of ageing and Alzheimer's disease on mitochondrial function of human platelets. Exp. Gerontol. 43, 589-594 (2008).
- Avila, C., et al. Platelet mitochondrial dysfunction is evident in type 2 diabetes in association with modifications of mitochondrial anti-oxidant stress proteins. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes. 120, 248-251 (2012).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab. Invest. 93, 690-700 (2013).
- Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol. Chem. 393, 1485-1512 (2012).
- Hultqvist, M., et al. Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12646-12651 (2004).
- Rosa-Borges, A., et al. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency with recurrent infections: case report. J. Ped. 77, 331-336 (2001).
- Walkowiak, B., Kesy, A., Michalec, L. Microplate reader--a convenient tool in studies of blood coagulation. Thromb. Res. 87, 95-103 (1997).
- Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic. Biol. Med. 51, 1621-1635 (2011).
- Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp.. (46), e2511(2010).
Przedruki i uprawnienia
