Bioenergetyka i wybuch oksydacyjny: protokoły izolacji i oceny ludzkich leukocytów i płytek krwi

Podsumowanie

Leukocyty krwi i płytki krwi mogą być używane jako marker ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby, a więc mają potencjał do monitorowania procesów patologicznych i wpływu leczenia. Tutaj opisujemy metodę izolacji i pomiaru funkcji mitochondriów oraz wybuchu oksydacyjnego w tych komórkach.

Streszczenie

Dysfunkcja mitochondriów jest znana z tego, że odgrywa znaczącą rolę w wielu stanach patologicznych, takich jak miażdżyca, cukrzyca, wstrząs septyczny i choroby neurodegeneracyjne, ale ocena zmian w funkcjach bioenergetycznych u pacjentów jest wyzwaniem. Chociaż choroby takie jak cukrzyca czy miażdżyca objawiają się klinicznie specyficznym upośledzeniem narządów, ogólnoustrojowe składniki patologii, takie jak hiperglikemia czy stan zapalny, może zmieniać funkcje bioenergetyczne krążących leukocytów lub płytek krwi. Koncepcja ta jest znana od pewnego czasu, ale jej szerokie zastosowanie było ograniczone przez dużą liczbę komórek pierwotnych potrzebnych do analizy bioenergetycznej. To ograniczenie techniczne zostało przezwyciężone poprzez połączenie specyfiki technik izolacji kulek magnetycznych, technik adhezji komórek, które umożliwiają przyłączanie komórek bez aktywacji do mikropłytek, oraz czułość nowych technologii przeznaczonych do wysokoprzepustowej respirometrii mikropłytkowej. Przykładem takiego sprzętu jest analizator strumienia zewnątrzkomórkowego. Takie oprzyrządowanie zazwyczaj wykorzystuje sondy wrażliwe na tlen i pH do pomiaru szybkości zmian tych parametrów w przylegających komórkach, które można następnie powiązać z metabolizmem. Tutaj szczegółowo opisujemy metody izolacji i powlekania monocytów, limfocytów, neutrofili i płytek krwi, bez aktywacji, z ludzkiej krwi oraz analizę bioenergetycznej funkcji mitochondriów w tych komórkach. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób wybuch oksydacyjny w monocytach i neutrofilach może być również mierzony w tych samych próbkach. Ponieważ metody te wykorzystują tylko 8-20 ml ludzkiej krwi, mają potencjał do monitorowania reaktywnych form tlenu, wytwarzania i bioenergetyki w warunkach klinicznych.

Wprowadzenie

Monitorowanie zdrowia bioenergetycznego komórek odpornościowych (monocytów, limfocytów, neutrofili) i płytek krwi z krwi jest od pewnego czasu uznawane za potencjalnie użyteczne narzędzie diagnostyczne do oceny ogólnego zdrowia bioenergetycznego danej osoby. Pojawia się nowa literatura przypisująca dysfunkcji mitochondriów szereg chorób, takich jak nowotwory, choroby układu krążenia i choroby neurodegeneracyjne^1,2. Jest to klinicznie ważne, ponieważ dysfunkcja mitochondriów może zainicjować serię zdarzeń komórkowych, które promują prozapalne szlaki sygnałowe lub prowadzą do śmierci komórki. W kilku badaniach scharakteryzowano funkcję mitochondriów komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i płytek krwi w stanach takich jak fibromialgia, cukrzyca, wstrząs septyczny i choroba Alzheimera^3-7. Na przykład w niedawnym badaniu oceniono bioenergetykę płytek krwi jako markera funkcji mitochondriów i stwierdzono, że płytki krwi od pacjentów z cukrzycą typu 2 zmniejszyły zużycie tlenu w mitochondriach^7,8. Z tych i innych odkryć jasno wynika, że monocyty, limfocyty, neutrofile i płytki krwi mogą służyć jako zastępcze markery zmian w bioenergetyce w warunkach patologicznych, ponieważ badają krążenie ogólnoustrojowe i mogą odzwierciedlać lokalne i globalne zmiany metaboliczne. Aby określić, czy podejście to ma wartość prognostyczną, czy diagnostyczną, wymagana jest metoda analizy o wysokiej przepustowości i spójna metoda przygotowania komórek.

Metody pomiaru funkcji mitochondriów w leukocytach i płytkach krwi wcześniej obejmowały izolację mitochondriów lub ocenę bioenergetyki komórkowej w nienaruszonych komórkach^4,9. Zaletą komórkowej oceny bioenergetycznej za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego (XF) jest to, że funkcję mitochondriów w komórkach można ustalić za pomocą endogennych substratów i określić parametry oddechowe, takie jak wyciek protonów i maksymalna wydolność oddechowa. My i inni wykorzystaliśmy tę technologię, aby pokazać, że profile bioenergetyczne w płytkach krwi, monocytach i limfocytach wyizolowanych z ludzkiej krwi mogą być ustalane i porównywane między typami komórek⁸. Ponadto zarówno neutrofile, jak i monocyty posiadają zdolność do wybuchu oksydacyjnego, w którym oksydazy NAPDH są aktywowane i zużywają tlen do wytworzenia ponadtlenku. Co ważne, szlak ten jest kluczowym składnikiem odporności wrodzonej i jest modulowany przez ogólnoustrojowy stan zapalny. Na przykład wykazano, że zmiany w zdolności wybuchu oksydacyjnego są związane z różnymi chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak stwardnienie rozsiane, zapalenie stawów i nawracające infekcje^10,11. Obecnie nie ma wysokoprzepustowych testów ilościowych do pomiaru wybuchu oksydacyjnego w próbkach klinicznych. Jest to ważne, ponieważ scharakteryzowanie zdolności wybuchu oksydacyjnego neutrofili i monocytów może również służyć jako ważne narzędzie diagnostyczne dla kilku patologii.

Kluczowymi wyzwaniami technicznymi były niska czułość pomiaru zużycia tlenu przy użyciu konwencjonalnych technik polarograficznych oraz konieczność korzystania z dołączonych komórek przy użyciu bardziej czułych technik fluorometrycznych mikropłytek. W tym praktycznym filmie opisujemy techniczne rozwiązanie tych problemów. Szczegółowo opisujemy metody izolacji, galwanizacji i pomiaru bioenergetyki monocytów, limfocyty, neutrofile i płytki krwi oraz wybuch oksydacyjny monocytów i neutrofili z ludzkiej krwi. Metoda ta jest odpowiednia do klinicznej oceny bioenergetyki i wybuchu oksydacyjnego dla badaczy, którzy mają dostęp do populacji pacjentów i możliwość uzyskania świeżych próbek krwi.

Protokół

Wszystkie protokoły opisane w tym manuskrypcie dotyczące pobierania, izolacji i analizy krwi zostały przejrzane i zatwierdzone przez Institutional Review Board na Uniwersytecie Alabama w Birmingham.

1. Izolacja komórek (zmodyfikowana z Histopaque Sigma-Aldrich Protocol No. 1119 i Miltenyi Biotec MicroBead Positive and Negative Selection Protocols)

1. Odwirować krew pełną (zebraną w probówkach ACD lub EDTA) o masie 500 x g przez 15 minut w wirówce z wirnikiem z odchylanym wirnikiem (przyspieszenie = 5-6 i bez hamulca).
2. Usunąć górną warstwę zawierającą osocze bogatopłytkowe (PRP) za pomocą pipety transferowej, aż 1 cm pozostanie ponad warstwę komórkową (erytrocyty/kożuch). Odłóż PRP w temperaturze pokojowej do późniejszego przetworzenia.
3. Przenieść otoczkę kożuchową do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, rozcieńczyć do 24 ml za pomocą podstawowego RPMI lub do co najmniej 4-krotności początkowej objętości kożucha kożuchowego.
   Uwaga: Może być konieczne uwzględnienie górnej połowy warstwy RBC, chociaż spowoduje to proporcjonalne zwiększenie objętości RPMI.
4. Przygotować gradient gęstości za pomocą Ficollu o niskiej gęstości i ciężarze właściwym 1,077 (1077) dla warstwy górnej i Ficollu o wysokiej gęstości i ciężaru właściwego 1,119 (1119) dla warstwy dolnej w trzech stożkowych probówkach o pojemności 15 ml (każda po 3 ml). Aby wykonać ten krok, najpierw dodaj 1077 do każdej probówki. Za pomocą wąskiej pipety o pojemności 5 ml dodaj 1119 na dno probówki, umieszczając końcówkę pipety poniżej 1077 i powoli uwalniaj odczynnik, nie mieszając go z górnym gradientem. Na tym etapie powinno znajdować się łącznie 6 ml pożywki o gradiencie gęstości z widoczną fazą separacji na znaku 3 ml.
5. Za pomocą automatycznej pipety delikatnie dodaj 8 ml rozcieńczonej krwi (z kroku 1.3) do każdej probówki gradientowej, używając ustawienia niskiej mocy, aby zapobiec naruszeniu warstw gradientu. Na tym etapie całkowita objętość powinna wynosić 14 ml.
6. Probówki wirówkowe o ciśnieniu 700 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej (przyspieszenie 6, bez hamulca).
   Uwaga: Na tym etapie powinny być widoczne trzy wyraźne pasma komórek (ryc. 1A). Najwyższe pasmo (między 1077 a osoczem) zawiera komórki jednojądrzaste (MNC) i płytki krwi, a środkowe pasmo (między 1007 a 1119) zawiera komórki wielojądrzaste (PMN), a dolne pasmo (poniżej 1119) zawiera erytrocyty.
7. Zebrać MNC i PMN oddzielnie za pomocą sterylnych szklanych pipet, nie naruszając innych pasm komórek. Połącz populację MNC z każdej probówki w sterylną stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Powtórz to również dla populacji PMN.
8. Dodaj 4 objętości RPMI do każdej probówki zawierającej odpowiednio frakcje MNC i PMN, aby rozcieńczyć gradient gęstości.
9. Probówki wirować o masie 700 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
10. Zawiesić osad komórek MNC i osad komórek PMN w 1 ml RPMI zawierającym 0,5% ultraczystego BSA WOLNEGO OD ULTRA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH (RPMI-BSA) i przenieść do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Osadzać komórki za pomocą pikofugi stołowej przez 30 sekund.
11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą komórkę w 80 μl RPMI-BSA.
12. Dodać 20 μl przeciwciała antyCD14 znakowanego kulkami magnetycznymi do probówki zawierającej frakcję MNC w celu pozytywnej selekcji monocytów. Do probówki zawierającej frakcję komórkową PMN dodać 20 μl przeciwciała antyCD15 znakowanego kulkami magnetycznymi w celu pozytywnej selekcji neutrofili. Inkubować zawiesinę każdej komórki przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
13. Przemyć zawiesinę każdej komórki 1 ml pożywki i granulki RPMI-BSA jak poprzednio, a następnie ponownie zawiesić każdą osadkę w 500 μl RPMI-BSA.
14. Oznakowane komórki są rozdzielane w polu magnetycznym separatora sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS). Przygotować kolumny MACS LS (po jednej na każdą zawiesinę komórek), umieszczając kolumnę na separatorze MACS i przemłukując 3 ml RPMI-BSA przed dodaniem zawiesiny komórek.
15. Po nałożeniu zawiesin komórkowych umyj każdą kolumnę 3x 3 ml pożywki RPMI-BSA (upewnij się, że pożywka całkowicie spłynęła między praniami). Zebrać przepływ zawiesiny komórkowej i przepłukać kolumnę do sterylnej probówki.
16. W celu wyizolowania monocytów i neutrofili, po ostatnim płukaniu należy usunąć kolumnę z pola magnetycznego i wymyć pozytywnie wybrane komórki do sterylnej probówki z 5 ml RPMI-BSA za pomocą tłoka kolumny.
17. Aby wyizolować limfocyty, należy zagnieździć frakcję przepływową MNC z kroku 1.15 w temperaturze 300 x g przez 10 minut. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 80 μl RPMI-BSA. Dodać 20 μl przeciwciał CD61 i CD235a i inkubować zawiesinę komórek przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć separację MACS jak poprzednio i zebrać przepływ zawierający limfocyty.
18. Aby osadzać monocyty, neutrofile i frakcje limfocytów, należy odwirować jak poprzednio (krok 1.9) i odrzucić supernatanty. Osady komórkowe należy ponownie zawiesić w 1 ml pożywki o strumieniu zewnątrzkomórkowym (XF-DMEM) w celu zliczenia.
    Uwaga: 8 ml krwi pełnej powinno dać 1-5 x 10⁶ monocytów/ml i 5-20 x 10⁶ limfocytów i neutrofili/ml.
19. Aby wyizolować płytki krwi, odwirować PRP (krok 1.2) przez 8-10 minut w temperaturze 1 500 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć osocze i przemyć jednokrotnie osad komórek sterylnym 5 ml PBS uzupełnionym 1 μg/ml PGI₂, ponownie umieścić granulkę i zawiesić ostateczną osadkę w 1 ml buforu PBS-PGI₂.
20. Oznaczyć liczbę płytek krwi za pomocą mętności, gdy płytki krwi zostaną zawieszone w buforze PBS-PGI₂ za pomocą spektrofotometru, jak opisano przez Walkowiaka i wsp., używając następującego równania: [6,23/(2,016 – Abs₈₀₀)] – 3,09 x współczynnik rozcieńczenia = # x 10⁸ płytek krwi/ml ¹².

2. Poszycie komórek

1. Przygotowanie Cell-Tak (klej komórkowy): Dodać 90 μl kleju komórkowego do 180 μl diH₂0, 540 μl 0,1 N wodorowęglanu sodu (pH 8,0) i dostosować pH do 7,2-7,8 za pomocą 1 N NaOH. Przygotować płytki XF (24-dołkowe, mikropłytki V7), pokrywając każdą studzienkę 30 μl przygotowanego kleju komórkowego.
   Uwaga: Klej komórkowy powinien być przygotowywany świeży do każdego użycia.
2. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 20-30 minut, następnie odessać klej komórkowy i przemyć studzienki dwukrotnie PBS (1 ml / dołek).
3. Przeprowadzić liczenie komórek na izolowanych monocytach, limfocytach, neutrofilach i płytkach krwi i doprowadzić do odpowiedniej objętości za pomocą XF-DMEM, aby umożliwić gęstość wysiewu 250 tys. komórek / dołek dla monocytów, limfocytów i neutrofili oraz 25 x 10⁶ / dołek dla płytek krwi. Alternatywnie, aby zmierzyć odpowiedź impulsu oksydacyjnego, neutrofile można wysiać w 125 tys. komórek / studzienkę. Ostateczna objętość wysiewu dla każdej zawiesiny komórkowej powinna wynosić 200 μl/dołek.
4. Odwirować płytkę o masie 200 x g przez 1 sekundę bez hamowania. Obrócić płytkę o 180° i ponownie odwirować bez hamulca przy 300 x g.
5. Doprowadzić końcową objętość studzienki do 660 μl za pomocą XF-DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed testem XF. Uwaga: Mikrofotografie posianych komórek przed i po teście mogą być wykorzystane w celu zapewnienia odpowiedniego posiewu i wykluczenia oderwania komórek.

3. Przygotowanie 24-dołkowej płytki do badania strumienia zewnątrzkomórkowego (XF24)

1. Sondy XF należy uwodnić roztworem kalibru przez co najmniej 2 godziny przed badaniem.
2. Przygotuj 10 porcji 0,5 μg/ml oligomycyny, 0,6 μM FCCP i 10 μM antymycyny A w XF-DMEM i załaduj 75 μl roztworów podstawowych do portów iniekcji kartridży w powyższej kolejności. Jeśli mają być uzyskane pomiary impulsu oksydacyjnego, po antymycynie-A można wstrzyknąć 10-krotny zapas 100 ng / ml PMA.
3. Skalibruj uwodniony i załadowany wkład i wykonaj test XF. Szczegółowe metody analizy i interpretacji zarówno zużycia tlenu, jak i zmian pH zostały opisane w poprzednich publikacjach^9,13,14 i nie są tutaj szczegółowo omawiane.
4. Po teście XF odessać wszystkie oprócz ostatnich 50 μl XF-DMEM po teście, aby zapobiec utracie komórek z płytki i dodać 50 μl buforu do lizy komórek RIPA i wykonać test białka w celu normalizacji.

Wyniki

Aby ocenić bioenergetykę komórek krwi, pełna krew jest pobierana od ludzi przez nakłucie żyły w probówce do pobierania próżniowego EDTA lub ACD. Izolacja leukocytów i płytek krwi po pobraniu krwi jest wizualizowana na rysunku 1A, jak szczegółowo opisano w protokole. Próbki krwi pełnej są przetwarzane w ciągu 8 godzin od pobrania, aby uniknąć śmierci komórki i aktywacji. Wydłużony czas przechowywania dłuższy niż 8 godzin nie został przetestowany, ale może powodować zmiany bioenergetyczne i być mniej reprezentatywny dla warunków fizjologicznych. Dekstroza z kwaśnym cytrynianem (ACD-8 ml) i probówki próżniowe EDTA zostały użyte do izolacji komórek bez zaobserwowanego wpływu na funkcję bioenergetyczną izolowanych komórek. Antykoagulanty są niezbędne, ponieważ skrzepy zmniejszają liczbę uzyskiwanych komórek, zakłócają prawidłowe tworzenie faz podczas wirowania w gradiacji Ficoll i powodują niewielką liczbę płytek krwi w odwirowanej surowicy lub nie powodują jej braku. Cała krew stanowi zagrożenie biologiczne i przez cały czas trwania procedury należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, nawet po wyizolowaniu populacji komórek lub wytworzeniu lizatów komórkowych. Próbki należy utylizować zgodnie ze standardami utylizacji odpadów ludzkich obowiązującymi w instytucji.

Pełna krew jest odwirowywana w celu oddzielenia osocza bogatopłytkowego od kożuchowca, białej warstwy tuż nad upakowanymi czerwonymi krwinkami, która zawiera leukocyty. Płaszcz kożuchowy nakłada się na gradienty gęstości i odwirowuje w celu uzyskania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (monocyty i limfocyty) oraz komórek wielojądrzastych (granulocyty). Zanieczyszczenie RBC poszczególnych faz komórkowych MNC i PMN jest powszechne na tym etapie i powinno ustąpić podczas oczyszczania MACS. Różne typy komórek są następnie uzyskiwane przez inkubację z przeciwciałami magnetycznymi w celu uzyskania czystych frakcji. Monocyty są zbierane przez inkubację frakcji PBMC z CD14, przepływ z monocytów zawiera limfocyty, które są następnie pozbawiane erytrocytów i płytek krwi. Neutrofile uzyskuje się przez inkubację warstwy komórek wielojądrzastych z przeciwciałem CD15 (ryc. 1A). Następnie płytki krwi można granulować przez odwirowanie osocza bogatopłytkowego i przemywać w celu usunięcia innych składników osocza. Po tych selekcjach płytki krwi, monocyty CD14 +, limfocyty, neutrofile CD15 + można policzyć i posiać na płytce analizatora XF pokrytej adhezją komórek w celu bioenergetyki i analizy wybuchów oksydacyjnych.

Każdy etap procedury powinien być wykonywany w sterylnych warunkach i jest zalecany, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji reakcji oksydacyjnej u monocytów i neutrofili. Wskaźnik mniej niż sterylnych warunków podczas izolacji jest widoczny, gdy neutrofile, które mają niewielkie lub żadne zużycie tlenu w warunkach podstawowych, rozpoczynają test strumienia zewnątrzkomórkowego z podwyższonymi pomiarami OCR, które stopniowo rosną lub maleją w trakcie trwania testu. Podkreślamy znaczenie obrazowania komórek za pomocą mikroskopii świetlnej 200X lub większej, aby upewnić się, że przed testem nie wystąpiły żadne morfologiczne oznaki aktywacji. Na przykład neutrofile zwykle mają zaokrąglony lub nieregularny kształt z wyraźnymi granicami komórek, jak widać na rysunku 1B. Jednak komórki te spłaszczają się na powierzchni płytki po aktywacji i tracą swoją wyraźną morfologię komórkową. Wcześniej informowaliśmy o zmianach morfologicznych aktywowanych leukocytów i płytek krwi przy użyciu tego protokołu i należy podjąć dodatkowe środki, aby zapewnić sterylne warunki w przypadku napotkania aktywacji⁸.

Uproszczony schemat protokołu jest widoczny na rysunku 2 jako tabela czasu, w której szczegółowo opisane są główne etapy izolacji komórek, przygotowania płytki XF i testu XF. Izolacja polega na separacji w gradiencie gęstości typów komórek, po której następuje separacja magnetyczna. Równolegle do procesu izolacji komórek konieczne jest przygotowanie płytki XF, aby uniknąć opóźnień w posiewaniu komórek lub rozpoczęciu testu XF. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ znaczne opóźnienia mogą prowadzić do aktywacji komórek i obniżenia parametrów bioenergetycznych.

Nieodpowiednie stężenia komórek po izolacji są częstym problemem i konieczna jest optymalizacja każdego procesu wirowania, aby uniknąć utraty komórek. Udane izolacje przeprowadzono już na 6 ml krwi, ale zmiany mogą być dokonywane w zależności od stężenia krążącego pożądanego typu komórek. Jeśli gradient gęstości jest niewłaściwie przygotowany, wyraźne fazy komórkowe mogą nie być widoczne i może dojść do utraty komórek (zobacz film instruktażowy JoVE, aby uzyskać wizualną demonstrację). Niewystarczająca liczba płytek krwi wyizolowanych z PRP występuje rzadko, ale występuje, jeśli bufor płuczący nie zawiera PGI₂ lub jeśli izolacja odbywa się poniżej temperatury pokojowej. Ryzyku aktywacji płytek krwi często można zapobiec, jeśli płytki krwi są ostatnimi komórkami, które mają zostać wyizolowane; Jeśli jednak płytki krwi pozostaną w buforze płuczącym przez dłuższy czas, wpłynie to na bioenergetykę. Zdarzały się przypadki mniejszych populacji płytek krwi, które nie granulowały się podczas wirowania 1500 x g, a bioenergetyka tych komórek nie została dokładnie scharakteryzowana. Zobacz Tabelę 2, aby uzyskać bardziej kompletny przewodnik rozwiązywania problemów.

Profile bioenergetyczne leukocytów i płytek krwi można określić za pomocą analizatora XF, który nieinwazyjnie mierzy zużycie_O2 w komórkach w czasie rzeczywistym. Każdy typ ogniwa jest posiany na płytce XF24 pięcioma powtórzeniami, jak pokazano na rysunku 3A. Tabela 1 przedstawia oczekiwane wartości wybuchu podstawowego i oksydacyjnego według typu komórki podczas testu oraz średnie stężenia białka na studzienkę. Dostępne są technologie o wyższej przepustowości, takie jak XF96, który pozwala na jednoczesną ocenę czterech dawców, jak pokazano na rysunku 3B. Po wykonaniu testu dane są eksportowane do komputera stacji roboczej w celu analizy przy użyciu odpowiedniego oprogramowania XF i programu Microsoft Excel. Wartości OCR znormalizowano do całkowitej zawartości białka w odpowiednich studzienkach i wyrażono jako białko pmol/min/mg. Reprezentatywne profile wybuchów bioenergetyczno-oksydacyjnych każdego typu komórek zostały niedawno zgłoszone przez naszą grupę⁸. Dalsza analiza parametrów bioenergetycznych testu (podstawa, sprzężenie z ATP, wyciek protonów, maksimum, wybuch niemitochondrialny i oksydacyjny) można obliczyć dla poszczególnych dołków, jak pokazano wcześniej i opisano poniżej⁸.

Podstawowy wskaźnik zużycia tlenu (OCR) jest ustalany na podstawie pierwszych 3 pomiarów, jak pokazano na rysunku 4A. Oligomycyna (0,5 μg/ml), inhibitor mitochondrialnej syntazy ATP, jest wstrzykiwana do pożywki XF w celu oszacowania OCR sprzężonego z syntezą ATP i reprezentowanego jako sprzężony z ATP. Szczątkowy OCR minus niemitochondrialny OCR można przypisać wyciekowi protonów. Następnie dodaje się FCCP rozprzęgacz w celu określenia maksymalnego OCR, a następnie antymycynę-A, inhibitor oddychania mitochondrialnego, w celu określenia niemitochondrialnych źródeł zużycia tlenu. Pojemność rezerwowa jest miarą ilości ATP, która może być wytwarzana przy zapotrzebowaniu na energię i może być obliczana jako różnica między maksymalnym tempem oddychania a wartością podstawową. W celu określenia zdolności do wybuchu oksydacyjnego wstrzykuje się 12-mirystynian 13-octanu forbolu (PMA), agonistę PKC, w celu zwiększenia aktywności oksydazy NADPH, a wzrost szybkości zużycia tlenu po stymulacji PMA można zmierzyć za pomocą analizatora XF. Rysunek 4B pokazuje, jak obliczyć różne parametry funkcji mitochondriów i wybuchu oksydacyjnego.

Rysunek 1. Izolacja leukocytów i płytek krwi z krwi pełnej. A) Świeżo pobrane próbki rozdziela się na ich osocze i składniki komórkowe przez odwirowanie i oczyszcza za pomocą gradientu gęstości Ficoll oraz sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS) przez selekcję dodatnią (monocyty i neutrofile) lub negatywną (limfocyty), podczas gdy płytki krwi są izolowane przez szybkie wirowanie osocza bogatopłytkowego. B) Obrazy wyizolowanych populacji komórek po ponownym zawieszeniu w XF DMEM i posianiu ich we wskazanych gęstościach komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Przygotowanie płytek XF24 do badań bioenergetycznych leukocytów i płytek krwi. Szczegółowy harmonogram przygotowania płytki testowej XF24 poprzez izolację komórek i posiew oraz hydratację wkładu i ładowanie portu iniekcyjnego.

Rysunek 3. Rozmieszczenie leukocytów i płytek krwi na płytkach analizatora XF24 i XF96. A) Leukocyty (125-250 tys. komórek / basen) i płytki krwi (25 x 10⁶ komórek / dołek) od jednego dawcy są siane na płytce testowej XF24 wśród kontroli tła. Do wskazanych portów iniekcyjnych ładuje się 75 μl 10x zapasów oligomycyny (0,5 μg / ml), FCCP (0,6 μM), antymycyny-A (10 μM) i PMA (100 ng / ml) rozcieńczonych w pożywkach XF. B) Leukocyty (75-150 tys. komórek/dołek) i płytki krwi (10 x 10^{6 komórek}/dołek) od aż czterech dawców można posiać na XF96 w łącznej objętości 180 μl XF-DMEM. Do wskazanych portów iniekcyjnych ładuje się 20 μl 10x zapasów oligomycyny (1,0 μg/ml), FCCP (0,6 μM), antymycyny-A (10 μM) i PMA (100 ng/ml) rozcieńczonych w XF-DMEM.

Rysunek 4. Analiza wskaźników bioenergetycznych. A) Reprezentatywny ślad wskaźnika zużycia tlenu (OCR) przez mitochondria i wybuch oksydacyjny w monocytach. Ustala się podstawowy OCR (pierwsze 3 wskaźniki oznaczone liczbami w kółkach). Następnie wstrzykuje się sekwencyjne dodatki oligomycyny (O; 0,5 μg/ml), FCCP (F; 0,6 μM) i antymycyny-A (A; 10 μM) w celu określenia oddychania mitochondrialnego i niemitochondrialnego komórek nieaktywowanych. Na koniec dodaje się PMA (100 ng / ml) w celu zmierzenia wybuchu oksydacyjnego. B) Modułowa analiza funkcji mitochondriów i wybuchu oksydacyjnego jest obliczana na podstawie różnic w szybkościach, jak wskazano.

krwi

	Optymalna gęstość wysiewu	Śr. Podstawowy OCR (pmol O2/min)	Śr. OCR wybuchu oksydacyjnego (pmol O2/min)	Średnia białko (μg)/dobrze
Monocyty	250 tys. komórek / studnię	83,9 ( ± 13,0)	300,3 ( ± 58,8)	19,0 ( ± 2,4)
Neutrofile	250 tys. komórek / studnię	6.1 ( ± 2.2)	1411,8 ( ± 233,3)	20,6 ( ± 2,7)
Limfocyty	250 tys. komórek / studnię	52,9 ( ± 7,7)	15 ( ± 4.1)	13.2 ( ± 2.1)
Płytki	25 x 106 komórek / studzienka	199,4 ( ± 20,3)	24 ( ± 2.7)	47,5 ( ± 3,1)

Tabela 1. Normalne parametry dla testu XF24: Średni podstawowy (Rate 3) i oksydacyjny (Rate 7) OCR nieskorygowany do niemitochondrialnego OCR lub białka jest pokazany przez typ komórki posianej we wskazanych gęstościach komórek. Średnia zawartość białka w basenie jest pokazana jako przeprowadzona za pomocą testu DC Lowry'ego. Dane te reprezentują średnie wartości 6-8 zdrowych dawców z nawiasem zawierającym ± SEM.

krwi krwi

krok	problem	Możliwa przyczyna	rozwiązanie
1.2	wyczyść plazmę	płytki krwi granulowane podczas wirowania	skróć czas wirowania do 10 min lub powoli do 400 x g
	mleczna plazma	nadmiar lipidów	unikaj kolekcji poposiłkowej
1.6	utworzone niekompletne pasma komórek	niewłaściwe przygotowanie gradientu, zimny odczynnik	unikaj zakłócania gradientu podczas pipetowania, użyj odczynnika o temperaturze pokojowej
	grudki w pasmach komórek	mogło dojść do zakrzepów krwi	Zbierz krew za pomocą antykoagulantów, takich jak ACD lub EDTA.
1.10	brak granulki komórek	zobacz krok 1.6	Jeśli supernatant jest zamglony, patrz poniżej
	mglisty supernatant	Ciężkie zanieczyszczenie gradientem Ficoll, zanieczyszczenie płytek krwi	Zwiększ prędkość wirowania do 900 x g, rozcieńcz z większą prędkością RPMI
1.16, 1.17	niska wydajność leukocytów	ciężkie zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi, za mało krwi pełnej, krzepnięcie	Podwójna objętość przeciwciał i RPMI-BSA, zbierz więcej krwi, dodaj antykoagulant
1.19	agregacja płytek	PGI2 pominięte, ekspozycja na zimne media, przedłużone przechowywanie w plazmie	dodaj PGI2 do bufora do płukania płytek krwi, użyj odczynników o temperaturze pokojowej
1.20	niska liczba płytek	strata podczas wirowania pierwotnego, agregacja płytek krwi	Zobacz kroki 1.2 i 1.19
2.3	zanieczyszczenie RBC		Powtórz separację MACS

Tabela 2. Rozwiązywanie problemów z izolacją leukocytów i płytek krwi. Tabela zawiera listę typowych problemów napotykanych podczas izolacji leukocytów i komórek płytkowych z krwi pełnej oraz rozwiązania, które mogą pomóc użytkownikom w procesie rozwiązywania problemów.

Dyskusja

Protokół ten stanowi kompilację kilku powszechnie stosowanych technik izolacji komórek krwi w sposób odpowiedni do analizy bioenergetycznej. Przedstawione techniki przylegające do siebie są korzystne w porównaniu z innymi metodami izolacji (tj. analizą FAC) ze względu na ich zdolność do izolowania dużej liczby komórek w kontrolowanych warunkach pożywki przy minimalnym obciążeniu izolowanych komórek. Ma tę wadę, że zapewnia długie izolacje nawet przy minimalnych przerwach. Protokół ten służy jako podstawa do izolacji pierwotnych komórek krwi od ludzi, które można ekstrapolować na warunki kliniczne i badania translacyjne.

Separacja MACS to niezawodna technika izolacji komórek, która daje możliwość izolowania komórek bezpośrednio z krwi pełnej; Jednak ta metoda wymaga większych ilości przeciwciał i nie jest optymalna do izolacji wszystkich czterech różnych typów komórek, jak opisano w tej metodzie. Nie ma dowodów na to, że pozytywna selekcja leukocytów przez separację MACS powoduje aktywację przy użyciu naszego protokołu izolacji. Kolumny MACS działają poprzez sekwestrację znakowanych komórek w polu magnetycznym przy użyciu przeciwciał sprzężonych z cząstkami superparamagnetycznymi o długości fali 50 nm. Komórki oznaczone etykietami są następnie eluowane z kolumny. W tym protokole zaimplementowano selekcje pozytywne i negatywne, aby zapewnić szybką izolację i czystość. Jeśli w wyniku izolacji uzyska się nieodpowiednią liczbę komórek lub kwestionowana jest czystość, do próbki można dodać więcej przeciwciał zgodnie z instrukcją dostawcy, a drugie przejście przez kolumnę LS może skutkować większą czystością (tabela 2). Nasze laboratorium stwierdziło wysoką czystość i wydajność galwanu przy użyciu istniejącego protokołu, analizując końcowe zawiesiny komórek za pomocą analizy FACS⁸.

Analizatory strumienia zewnątrzkomórkowego mają możliwość monitorowania zarówno zużycia tlenu, jak i zakwaszenia mediów w czasie rzeczywistym w porównaniu z innymi elektrodami. Zużycie tlenu obserwowane przez odpowiedź wybuchu oksydacyjnego w monocytach i neutrofilach jest zależne od oksydazy NADPH, co pokazuje hamowanie za pomocą DPI⁸. Zaobserwowaliśmy zależną od czasu utratę zdolności do wybuchów oksydacyjnych przy przedłużonych izolacjach lub rozszerzonych testach XF. Protokół ten został zaprojektowany i opracowany do użytku w XF24, ale jest również zgodny z XF96 przy około jednej trzeciej do połowy gęstości wysiewu komórek XF24 (ilustracja 3).

Podczas projektowania tego protokołu wymagane było przestrzeganie istniejących protokołów dla każdej techniki w celu uzyskania optymalnej wydajności, z modyfikacjami wprowadzonymi wyłącznie w celu kontrolowania warunków podłoża do analizy bioenergetycznej. Po opanowaniu technik, taki protokół może być stosowany w szerokim zakresie zastosowań translacyjnych i badawczych do pomiaru toksyczności lub skuteczności strategii leczenia, badania charakterystyki metabolicznej choroby oraz produkcji utleniaczy przez monocyty i neutrofile w stanach zapalnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw startowy QuadroMACS zawiera separator QuadroMACS i stojak MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-094-833
CD235a (glikoforyna A) Mikrokulki, ludzkie	Miltenyi Biotec	130-050-501
CD61 Mikrokulki, ludzkie  do płytek krwi	Miltenyi Biotec	130-051-101
CD14 Mikrokulki, ludzkie  do monocytów	Miltenyi Biotec	130-050-201
CD15 Mikrokulki, ludzkie  do granulocytów	Miltenyi Biotec	130-046-601
LS Kolumny	Miltenyi Biotec	130-042-401
BD Vacutainer ACD Probówki do pobierania krwi	Fisher	02-684-26
RPMI 1640	Gibco	11835-030	z L-glutaminą i bez czerwieni fenolowej
Prostaglandyna I2, sód sól	Cayman	18220
1,5 ml półmikro kuwety	Produkty badawcze Phenix	SC-2410
Gradient gęstości histopacznej, ciężar właściwy 1,077	Sigma	10771
Gradient gęstości histopatycznej, ciężar właściwy 1,119	Sigma	11191
Albumina surowicy bydlęcej Frakcja V	Roche	3117405001	ultra wolne od kwasów tłuszczowych
12-mirystynian 13-octan	Phorbol Sigma	P8139
XF24 FluxPak	Seahorse Biosciences	100850-001
DMEM	Fisher	MT90113PB	bez glukozy, L-glutaminy, pirogronianu, czerwieni fenolowej i wodorowęglanu
L-glutaminy, 200 mM (100x)	Invitrogen	25030-081
D-Glucose	Sigma	G7528
Pirogronian sodu	Sigma	P8574
Cell-Tak (adhezja komórkowa)	BD Biosciences	CB-40242
Oligomycyna	Sigma	O4876
Antymycyna A	Sigma	A8674
(FCCP) 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu	Sigma	C-2920
Odczynnik do oznaczania białek DC	Bio-Rad	500-0113
Odczynnik do oznaczania białek DC S	Bio-Rad	500-0015
Odczynnik do oznaczania białek DC B	Bio-Rad	500-0114
Seahorse	Biosciences
Separator QuadroMACS i