Artykuł metodologiczny

Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

DOI:

10.3791/51305

⸱

16 kwietnia 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Veterans Affairs, Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Department of Integrative Biology and Physiology, University of Minnesota, 4Department of Medicine, University of Minnesota Medical School, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy multipleksowe mogą dostarczyć korzystnych informacji dla podstawowych mechanizmów komórkowych i wyeliminować marnotrawstwo odczynników oraz niepotrzebne powtarzalne eksperymenty. Opisujemy tutaj multipleksowy test aktywności kaspazy-3/7, przy użyciu metod fluorescencyjnych i luminescencyjnych, w celu określenia żywotności komórek w modelu podwzgórza in vitro po prowokacji oksydacyjnej kwasem palmitynowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość multipleksowania testów w badaniach złożonych mechanizmów komórkowych eliminuje potrzebę powtarzania eksperymentów, zapewnia wewnętrzną kontrolę i zmniejsza marnotrawstwo kosztów i odczynników. W tym miejscu opisujemy optymalizację testu multipleksowego w celu oceny apoptozy po prowokacji kwasem palmitynowym (PA) w modelu podwzgórza in vitro, wykorzystując zarówno testy fluorescencyjne, jak i luminescencyjne do pomiaru liczby żywotnych komórek i aktywności kaspazy-3/7 w 96-dołkowym formacie płytki do mikromiareczkowania. Po prowokacji PA żywe komórki oznaczono za pomocą testu fluorescencyjnego na bazie resazuryny. Aktywność kaspazy-3/7 została następnie określona za pomocą luminogenicznego substratu, DEVD, i znormalizowana do liczby komórek. Ten test multipleksowania jest przydatną techniką określania zmiany aktywności kaspazy po bodźcu apoptozowym, takim jak prowokacja nasyconymi kwasami tłuszczowymi. Nasycone kwasy tłuszczowe PA mogą zwiększać stres oksydacyjny podwzgórza i apoptozę, co wskazuje na potencjalne znaczenie testów, takich jak opisane tutaj, w badaniu związku między nasyconymi kwasami tłuszczowymi a funkcją neuronów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diety bogate w nasycone kwasy tłuszczowe, takie jak kwas palmitynowy (PA), zostały powiązane z otyłością i innymi chorobami współistniejącymi, w tym chorobami układu krążenia i cukrzycą 1,2. Wykazano również, że diety wysokotłuszczowe zwiększają stres oksydacyjny, apoptozę i zwyrodnienie neuronów w podwzgórzu, ważnym regulatorze apetytu i wydatku energetycznego3-7. Zrozumienie mechanizmu, za pomocą którego ekspozycja na dietę wysokotłuszczową indukuje rozregulowanie podwzgórza, jest zatem ważne dla opracowania farmakologicznych metod leczenia otyłości. Jednak mechanizmy komórkowe, poprzez które tłuszcz w diecie wpływa na funkcje neuronów, pozostają niejasne. Lepsze zrozumienie, w jaki sposób tłuszcze, takie jak PA, mogą wywoływać początek szlaków apoptozy podwzgórza, jest niezbędnym pierwszym krokiem w kierunku tego celu. Celem tego artykułu jest opisanie testu multipleksowego do badania in vitro odpowiedzi neuronalnej na ekspozycję na PA, opracowanego do stosowania w badaniach nad neurodegeneracją podwzgórza. Przedstawiamy szczegółowy opis 96-dołkowego testu multipleksowego w formacie in vitro do pomiaru aktywności kaspazy 3/7 na całkowitą liczbę komórek w zróżnicowanej, unieśmiertelnionej dorosłej linii komórkowej podwzgórza myszy (oznaczonej jako A12) po prowokacji oksydacyjnej PA8.

Krótko mówiąc, żywotność komórek jest określana po prowokacji PA za pomocą testu opartego na reazurynie. Rezazuryna jest związkiem przepuszczalnym dla komórek, który ulega enzymatycznej redukcji w komórkach aktywnych metabolicznie, a proces ten zachodzi za pośrednictwem mitochondriów9. Żywe komórki w sposób ciągły przekształcają resazydynę w rezorufinę, wytwarzając sygnał fluorescencyjny proporcjonalny do liczby żywotnych komórek. Aktywność kaspazy-3/7 jest następnie analizowana za pomocą testu lumogennego opartego na DEVD. DEVD to sekwencja aminokwasowa (Asp-Glu-Val-Asp) rozszczepiona przez kaspazę-3. Gdy ta sekwencja jest sprzężona z substancją lumogenną, po aktywacji wewnątrzkomórkowej kaspazy-3/7, a następnie rozszczepieniu substratu DEVD, uwalniany jest produkt luminescencyjny. Reakcja ta jest proporcjonalna do aktywności kaspazy, a tym samym do indukcji apoptozy. Ponieważ martwe komórki nie mogą wytwarzać kaspazy, aktywność kaspazy-3/7 jest z natury przejściowa; Dlatego analizę należy przeprowadzić między 30 minutami a 4 godzinami po prowokacji, w zależności od skuteczności stresora komórkowego. Żywotność komórek jest odwrotnie proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7 i może być wykorzystana do określenia mechanizmów śmierci komórki. Na przykład metoda ta była wcześniej stosowana w celu wykazania, że wstępne leczenie hormonem peptydowym oreksyną zmniejsza apoptozę w komórkach podwzgórza podtlenionych nadtlenkiem wodoru, co sugeruje, że mechanizmy dotknięte tym leczeniem są ważne w ochronie przed uszkodzeniem oksydacyjnym10. Ważne jest, aby pamiętać, że testy te są zależne od linii komórkowej i tkanki, ponieważ opierają się na aktywności mitochondrialnej w celu zmniejszenia liczby odczynników testowych. Protokół ten został zoptymalizowany dla dorosłych mysich komórek podwzgórza (A12); Opisane metody mogą być jednak modyfikowane tak, aby mieściły się w zakresie podobnych badań.

Multipleksowanie testów z pojedynczej hodowli zapewnia przewagę nad tradycyjną metodą wykonywania indywidualnych testów z kilku powodów. Oprócz oszczędności czasu, próbek komórek i odczynników do hodowli, testy multipleksowania mogą również dostarczyć wiedzy na temat przeżycia i śmierci komórek, zapewnić kontrolę wewnętrzną i wyeliminować potrzebę powtarzania eksperymentów11,12.

Alternatywne metody polegały na Western blot lub ELISA, które są wiarygodnymi testami, ale są drogie i czasochłonne (1-2 dni), zwłaszcza przy użyciu formatu 96-dołkowego. Wyłączając czas potrzebny na hodowlę komórek do testu multipleksowania, całkowity czas wynosi mniej niż 3 godziny. Chociaż protokół ten został zoptymalizowany do użytku z komórkami A12, może zostać zmieniony do użytku w innych modelach, mając na uwadze czynniki, które mogą wpływać na integralność komórek. Ustalenie, czy ten protokół zadziała w przypadku serii eksperymentów, zależy od liczby próbek lub warunków eksperymentalnych oraz od planowanych dalszych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Posiewanie i utrzymanie hodowli komórkowej

  1. Podgrzej pożywkę hodowlaną Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco (DMEM + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny/neomycyny) do temperatury 37 °C.
  2. Zaopatrzyć się w zapas zamrożonych komórek A12 w temperaturze od -80 °C.
  3. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; po rozmrożeniu delikatnie odpipetować komórki, aby przenieść je do kolby hodowlanej o średnicy 75cm2 z wentylacją i dodać 10 ml pożywki hodowlanej.
  4. Inkubować kolbę przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach odessać pożywkę i zastąpić ją nową. Kontynuuj wzrost komórek, aż do uzyskania 70-80% konfluencji (2-3 dni wzrostu).

2. Liczenie i powlekanie komórek

  1. Ciepły roztwór DMEM i 1x-trypsyna-EDTA do 37 °C.
  2. Odessać pożywkę z komórek i przemyć dwukrotnie sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).
  3. Dodać 500 μl roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-5 minut.
  4. Oderwać komórki od kolby za pomocą skrobaka i zawiesić komórki w 5 ml pożywki. Przepuścić komórki przez sitko i przepuścić przez sitko do czystej probówki o pojemności 50 ml. Może być konieczne przepuszczenie komórek przez sitko więcej niż raz, ale nie powtarzaj więcej niż trzy razy.
  5. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić ilość komórek do hodowli w celu zasiania 6,000 komórek / studzienki na 96-dołkowej przezroczystej płytce o czarnych lub białych ściankach w końcowej objętości 100 μl pożywki. Inkubować płytkę w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.

3. Określanie żywotności komórek i aktywności kaspazy-3/7

  1. Przenieść PA do sterylnej szklanej fiolki o pojemności 5 ml i rozpuścić w 100% dimetylosulfotlenku (DMSO). Rozcieńczyć podstawowy roztwór PA w stosunku 1:10 w DMSO i dodać go do wstępnie podgrzanego DMEM, aby uzyskać końcowe stężenie robocze 0,1 mM PA. W przypadku pożywek kontrolnych należy dodać takie samo stężenie DMSO, jakie dodaje się do pożywki zawierającej PA.
  2. Usuń pożywkę z każdej studzienki i zastąp ją 50 μl pożywki +/- PA. Inkubować płytkę przez 2 godziny w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Następnie dodać 5 μl odczynnika rezazurynowego i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Za pomocą wielomodowego czytnika mikropłytek zarejestruj fluorescencję (560EX/590EM) w celu zmierzenia żywotności komórek. Wyniki są prezentowane jako względne jednostki fluorescencji (RFU).
  4. Do tej samej płytki dodać 55 μl odczynnika kaspazy i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  5. Ponownie za pomocą czytnika mikropłytek zarejestruj luminescencję, aby zmierzyć aktywność kaspazy-3/7. Wyniki przedstawiono jako względne jednostki luminescencji (RLU), przy czym luminescencja jest wprost proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7.
  6. Aby znormalizować aktywność kaspazy-3/7 do liczby komórek, podziel żywotność komórek (RFU) przez aktywność kaspazy-3/7 (RLU).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół opisuje wyniki multipleksowania dwóch oddzielnych testów w celu określenia mechanizmów śmierci komórki. Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu określania żywotności komórek i aktywności kaspazy-3/7. Aktywność kaspazy była znacznie zwiększona w komórkach prowokowanych PA po 2-godzinnej inkubacji (Figura 2A i Tabela 1). Utrata integralności błony komórkowej jest zmianą morfologiczną związaną z indukcją apoptozy, która jest widoczna w komórkach po 2 godz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test multipleksowy jest dobrze akceptowaną techniką, która była wykorzystywana przez naukowców w wielu zastosowaniach, takich jak mikromacierze PCR, immunodetekcja i inne metody wykrywania oparte na białkach13,14. Ostatnio testy multipleksowania są coraz częściej stosowane w eksperymentach in vitro na płytkach i zostały zatwierdzone jako dokładna metoda oceny cytotoksyczności i żywotności12. W powyższym protokole wykazujemy skuteczność multipleksowanych testów fluoresc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj praca została sfinansowana przez Departament Spraw Weteranów Stanów Zjednoczonych, Laboratorium Biomedyczne, Badań i Rozwoju BX001686-1A1 oraz VA Rehabilitacja, Badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa podwzgórza dorosłej myszy mHypoA-1/2 Cellutions Biosystems Inc.CLU172
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s MediumInvitrogen10313-039
Surowica bydlęca płodu PAA LabsA15-751
Penicylina/StreptomycynaInvitrogen15070-063
Kwas palmitynowySigma-AldrichP0500
Dimetynosulfotlenek Sigma-AldrichD2650

Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlue		InvitrogenA13262
Systemy testowe Caspase-Glo 3/7PromegaG8091
96 W Opyczna płyta dolna, polistyren, poddany obróbce kultur komórkowych, z pokrywką, sterylnyThermo Fisher Scientific165305
SpectraMax M5 Multi-ModeMicroplate Molecular Devices

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
  2. Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
  3. Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
  4. Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5' monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
  5. Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
  6. Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
  7. Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
  8. Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
  9. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  10. Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
  11. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  12. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
  13. Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
  14. Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
  15. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  16. Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
  17. Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wykrywanie apoptozyneurony podwzg rzatest z kwasem palmitynowymtest ywotno ci kom rekaktywno kaspazy 3 7testy fluorescencyjne i luminescencyjneanaliza za pomoc czytnika p ytek mikrotytracyjnychtest oparty na rezazuryniesubstrat DEVD

Powiązane artykuły