Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Białka to najszybciej rosnąca klasa środków terapeutycznych⁶, a szybki rozwój linii bioterapeutycznych skupił coraz większą uwagę na wyzwaniach związanych z rozwojem i stosowaniem leków białkowych. Jedna wyjątkowa kwestia wynika z faktu, że w zdrowym i funkcjonującym układzie odpornościowym wszystkie białka zewnątrzkomórkowe są próbkowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Po internalizacji przez APC, białko jest rozszczepiane na małe fragmenty peptydu, a przypuszczalne segmenty immunogenne są ładowane do rowka białek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (MHC II). Kompleksy peptyd-MHC II są następnie wyświetlane na powierzchni APC, a prawdziwe peptydy immunogenne, zwane epitopami komórek T, tworzą trójskładnikowe kompleksy receptorów komórek T MHC II-peptyd-T z pokrewnymi receptorami powierzchniowymi komórek T^{CD4 7}. To krytyczne zdarzenie rozpoznawania molekularnego inicjuje złożoną kaskadę sygnalizacyjną, która powoduje aktywację limfocytów T, uwalnianie cytokin, dojrzewanie limfocytów B za pośrednictwem limfocytów T CD4 i ostatecznie wytwarzanie krążących przeciwciał IgG, które wiążą się z obraźliwym białkiem egzogennym i usuwają je. W ten sposób białka immunogenne mogą być odimmunizowane poprzez identyfikację epitopów składowych limfocytów T i mutację kluczowych reszt odpowiedzialnych za tworzenie kompleksu MHC II. Należy jednak zauważyć, że epitopy limfocytów T mogą być liczne i szeroko rozpowszechnione w białkach immunogennych, a większość mutacji usuwających epitopy może powodować niezamierzoną utratę funkcji lub stabilności białka. W związku z tym inżynieria odimmunizowanych terapii biologicznych może być złożonym i technicznie trudnym celem, ale istnieje kilka przykładów udanych projektów delecji epitopów limfocytów T^3,5,8-12. W przeciwieństwie do "humanizacji" opartej na szczepieniu, która jest w dużej mierze ograniczona do terapii przeciwciałami, delecja epitopu może być zastosowana do zasadniczo każdego celu białkowego, niezależnie od sekwencji, struktury, funkcji lub dostępności homologicznych ludzkich rusztowań. Pierwszym krokiem do wdrożenia takiego podejścia jest identyfikacja kluczowych epitopów peptydowych osadzonych w docelowej sekwencji białka.

Wysokoprzepustowe testy biochemiczne z wykorzystaniem syntetycznych peptydów i rekombinowanych ludzkich cząsteczek MHC II mogą dostarczyć szybkiego wstępnego wglądu w identyfikację epitopów i łagodzenie skutków^1,3-5. Te testy typu ELISA mogą być potężnym uzupełnieniem innych narzędzi do projektowania i opracowywania białek/szczepionek. Na przykład jedno z dobrze ugruntowanych eksperymentalnych podejść do mapowania epitopów opiera się na czasochłonnych, pracochłonnych i zasobochłonnych testach proliferacji komórek ex vivo ¹⁵. Krótko mówiąc, pierwotna sekwencja białka docelowego jest najpierw dzielona na panel nakładających się peptydów, często 15-merów z 12 resztami nakładającymi się na sąsiednie peptydy. Panel peptydowy jest syntetyzowany chemicznie, a immunogenność każdego peptydu jest testowana w jednym z kilku różnych testów immunologicznych, które wykorzystują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane od ludzkich dawców^13,14. Aby zapewnić większą pewność wyników, peptydy są zwykle testowane w replikacji z PBMC od 50 lub więcej różnych dawców. W przypadkach, w których deimmunizacja jest ostatecznym celem, prace są dodatkowo komplikowane przez konieczność wyprodukowania dodatkowych paneli zmutowanych peptydów i przetestowania nowych paneli peptydowych w testach PBMC przed wprowadzeniem jakichkolwiek mutacji deimmunizujących do białka o pełnej długości w celu późniejszej analizy funkcjonalnej¹⁰. Chociaż te testy komórkowe pozostają złotym standardem w ocenie potencjału immunogennego u ludzi, skuteczność takiego wyczerpującego podejścia można poprawić poprzez wstępną filtrację przypuszczalnych epitopów immunogennych przy użyciu szybkiego i wysokoprzepustowego testu wiązania peptydów MHC II.

Podobnie, biochemiczne testy wiązania peptyd-MHC II mogą być połączone z metodami predykcyjnymi in silico, aby radykalnie przyspieszyć proces identyfikacji epitopów. Istnieje wiele narzędzi obliczeniowych do przewidywania epitopów limfocytów T; Przykłady obejmują ProPred¹⁶, MHCPred¹⁷, SVRMHC¹⁸, ARB¹⁹, SMM-align²⁰, NetMHCIIpan²¹, a także zastrzeżone narzędzia, takie jak EpiMatrix firmy EpiVax²². Podobnie, predyktory epitopów zostały ostatnio połączone z innymi narzędziami bioinformatycznymi i modelowania molekularnego w celu uzyskania zintegrowanych algorytmów deimmunizacji białek zaprojektowanych w celu zmniejszenia ryzyka, że mutacje deimmunizujące mogą zakłócić strukturę i funkcję białka^23-26. Podczas gdy kilka predyktorów epitopów okazało się dość dokładnych^27,28, wyniki obliczeniowe niezmiennie wymagają walidacji eksperymentalnej. Szybkie, wysokowydajne i opłacalne metody eksperymentalne najlepiej nadają się jako filtr wstępny do przewidywania epitopów in silico.

Podobnie predyktory epitopów mogą kierować selekcją antygenów do odwróconej wakcynologii^29,30. Na przykład postępy w bioinformatyce zaowocowały badaniami przesiewowymi całego genomu, które szybko identyfikują kandydatów na szczepionki w postaci całych białek lub epitopów peptydowych wyekstrahowanych z proteomów patogenów. Chociaż ta technologia wspomagająca zmienia proces odkrywania i opracowywania szczepionek ochronnych, wprowadza nowe wyzwanie w postaci nieubłaganie długich list kandydatów na szczepionki immunogenne. Wysokoprzepustowe testy wiązania peptydu-MHC II mogą kierować selekcją epitopów poprzez ilościowe określenie powinowactwa wiązania peptydów i rozwiązłości wiązania między wieloma allelami MHC II. Podobnie jak w przypadku deimmunizacji białek, takie metody eksperymentalne są ostatecznie wymagane do walidacji przewidywania obliczeniowego obiecujących potencjalnych szczepionek.

Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do formatu 384-dołkowego. Protokół jest wysoce zrównoleglony i zmniejsza koszty odczynników o 75% w porównaniu z wcześniej opisanymi formatami płytek 96-dołkowych^1,3-5. Metoda ta, wykorzystująca jednego robota do obsługi cieczy, pozwala jednemu badaczowi łatwo przeanalizować około dziewięćdziesięciu peptydów testowych w trzech egzemplarzach w zakresie ośmiu stężeń i czterech typów alleli MHC II w czasie krótszym niż 48 godzin. W tym artykule opisano konfigurację jednej 384-dołkowej płytki ELISA do analizy siedmiu eksperymentalnych peptydów przeciwko jednemu allelowi MHC II, ale kalkulatory arkuszy kalkulacyjnych są dostarczane jako materiał dodatkowy, aby łatwo przeskalować eksperyment do dowolnej liczby pożądanych peptydów i / lub cząsteczek MHC II.

Cztery główne działania składają się na test wiązania peptyd-MHC II: 1-Wiązanie: Peptydy testowe konkurują z znakowanymi peptydami kontrolnymi o wiązanie rozpuszczalnych białek MHC II w fazie roztworu. Wiązanie mierzy się w szerokim zakresie stężeń peptydów testowych. 2-Wychwytywanie: Gdy reakcja wiązania zbliża się do równowagi, kompleksy peptyd-MHC II są wychwytywane i oddzielane od niezwiązanego peptydu i białka przez zależne od konformacji rozpoznawanie za pomocą unieruchomionego przeciwciała. 3-Detekcja: Przechwycony peptyd kontrolny jest wykrywany ilościowo za pomocą fluorescencji rozdzielczej w czasie. 4-Analiza: Dane spektroskopowe są przetwarzane, wykreślane i analizowane w celu ustalenia zależnych od dawki właściwości wiązania testowego peptydu i białek MHC II.

Na różnych etapach poniższej procedury, zaleca się użycie robota do obsługi cieczy, jeśli jest dostępny. Szczególnie w formacie 384-dołkowym, automatyczne dozowanie i rozcieńczanie płynów minimalizuje błąd użytkownika, skutkuje bardziej spójnymi objętościami od odwiertu do studni i daje węższe 95% przedziały ufności dla wartości IC₅₀ w porównaniu z ręcznymi testami 96-dołkowymi (dane nie pokazane). Jeśli robot do obsługi cieczy nie jest dostępny, czynności oznaczone adnotacją "(robot do obsługi cieczy)" można wykonać ręcznie. Podobnie, jeśli to możliwe, zalecana jest automatyczna myjka do płytek, która jest kompatybilna z formatem 384-dołkowym. To skutecznie standaryzuje proces mycia płyt. Jeśli podkładka do blach nie jest dostępna, kroki oznaczone adnotacją "(podkładka do płyty)" można wykonać ręcznie.

1. Pokryj tabliczkę ELISA (Dzień 1)

1. Rozcieńczyć zapas przeciwciał L243 (0,5 mg/ml) w buforze boranowym do stężenia roboczego 10 μg/ml.
   1. Aby pokryć pojedynczą płytkę 384-dołkową, dodaj 200 μl przeciwciała podstawowego do 9,8 ml buforu boranowego. (Zobacz dodatkowy kalkulator arkusza kalkulacyjnego, aby uzyskać alternatywne skalowanie).
2. Dodać 25 μl roztworu przeciwciała L243 do każdego dołka 384-dołkowej białej płytki ELISA o wysokim poziomie wiązania. (robot do obsługi cieczy)
3. Uszczelnić płytkę folią poliestrową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   Uwaga: Każda 384-dołkowa płytka ELISA może pomieścić do 15 peptydów testowych w ośmiu rozcieńczeniach dla jednego allelu MHC II, a także kontrole dodatnie i ujemne. Ostatecznie pozwoli to na trzykrotne pomiary.

2. Wykonaj testowe rozcieńczenia peptydów (Dzień 1)

1. Zaczynając od 10 mM zapasu każdego testowanego peptydu w DMSO, wykonaj następującą serię rozcieńczeń w buforze fosforanowo-cytrynianowym przy użyciu 384-dołkowych płytek polipropylenowych (Tabela 1). (robot do obsługi cieczy)
   Uwaga: Pełna 384-dołkowa płytka polipropylenowa wymaga trzech oddzielnych płytek ELISA. Jedna trzecia płytki polipropylenowej będzie wymagała tylko jednej płytki ELISA (rysunek 1).

Tabela 1. Przygotowanie serii rozcieńczeń peptydu testowego.

Rysunek 1. Mapa płytkowa testu wiązania peptydów. (A) Mapa rozcieńczeń peptydów w 384-dołkowych płytkach polipropylenowych. Każda płytka polipropylenowa może pomieścić trzy grupy po 15 peptydów w reakcjach wiązania konkurencyjnego przeciwko pojedynczemu allelowi MHC II. (B) Gdy reakcja wiązania zbliża się do równowagi, każda grupa peptydowa jest przenoszona, w trzech częściach, na oddzielną 384-dołkową płytkę ELISA, która została wstępnie pokryta przeciwciałem anty-MHC II.

3. Przygotuj główny miks MHC II (Dzień 1)

1. Zrób bufor reakcyjny
   1. Dodać 80 μl 1 mM Pefa Bloc i 60 μg oktylo-β-D-glukopiprenidu do 3,920 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego. (Zobacz dodatkowy kalkulator arkusza kalkulacyjnego, aby uzyskać alternatywne skalowanie).
2. Rozcieńczyć wybrane roztwory podstawowe MHC II do 101 nM w buforze reakcyjnym za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml (Tabela 2).
   Uwaga: Stężenie MHC II ostatecznie wyniesie 50 nM w reakcji wiązania i 25 nM w zobojętnionym teście ELISA. Stężenia zapasów MHC II będą się różnić w zależności od numeru partii producenta. (Zobacz dodatkowy kalkulator arkusza kalkulacyjnego).

Tabela 2. Przygotowanie mieszanki głównej MHC II.

4. Przygotowanie kontroli negatywnej i pozytywnej (Dzień 1)

1. Dodać 21,5 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego do studzienki "kontroli ujemnej" 384-dołkowej płytki polipropylenowej z kroku 2.1 (Rysunek 1A).
2. Dodać 21,5 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego do studzienki "kontroli pozytywnej" 384-dołkowej płytki polipropylenowej.
   Uwaga: "kontrola pozytywna" zostanie zakończona w sekcji 5 poniżej.
3. Usunąć 49,5 μl MHC II Master Mix z kroku 3.2 i odpipetować do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
4. Dodać 0,5 μl buforu cytrynianowego do 49,5 μl głównej mieszanki MHC II z kroku 4.3.
5. Dodać 21,5 μl mieszanki MHC II Master Mix o skorygowanym stężeniu z kroku 4.4 do studzienki "kontroli ujemnej" 384-dołkowej płytki polipropylenowej (rysunek 1A).
   Uwaga: ta próbka reprezentuje kontrolę ujemną o zerowym sygnale zawierającą białko MHC II, peptyd kontrolny NO i peptyd testowy NO.

5. Dodaj odpowiedni peptyd kontrolny do głównego miksu MHC II (Dzień 1)

*Zalecamy zamówienie skali 10 mg dla economy.
Tabela 3. Peptydy kontrolne dla różnych alleli MHC II.*

1. Rozcieńczyć peptyd kontrolny (przechowywany w temperaturze 400 μM w DMSO) w stosunku 1:20 w świeżym DMSO, aby otrzymać rozcieńczony materiał w temperaturze 20 μM.
   1. Dodać 25 μl 400 μM peptydu kontrolnego do 475 μl DMSO. Uwaga: jest to duży nadmiar, ale pozwala na dokładne obchodzenie się z lepkimi roztworami DMSO.
2. Dalej rozcieńczyć peptyd kontrolny z kroku 5.1 (20 μM) 1:100 do MHC II Master Mix z kroku 3.2.
   1. Dodać 28,8 μl peptydu kontrolnego rozcieńczonego w kroku 5.2 do pozostałych 2 850,5 μl MHC II Master Mix.
3. Dodać 21,5 μl mieszanki MHC II Master Mix z peptydem kontrolnym (krok 5.2) do studzienki kontroli pozytywnej 384-dołkowej płytki polipropylenowej (krok 4.2) (rysunek 1A). Uwaga: ta próbka reprezentuje wysokosygnałową kontrolę pozytywną zawierającą białko MHC II, peptyd kontrolny i peptyd testowy NO.

6. Wykonaj reakcję wiążącą (Dzień 1)

1. Dodać MHC II Master Mix zawierającą peptyd kontrolny (krok 5.2) do każdego z rozcieńczeń peptydu testowego (etap 2.1) w stosunku 1:1, aby uzyskać reakcję wiązania.
   1. Dodać 21,5 μl mieszaniny MHC II Master Mix zawierającej peptyd kontrolny z kroku 5.2 do 21,5 μl każdego rozcieńczenia peptydu testowego z kroku 2.1. (robot do obsługi cieczy)
2. Uszczelnić reakcję wiązania folią poliestrową i inkubować przez 12-24 godziny w inkubatorze niekontrolowanym przez CO₂ w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.

7. Neutralizacja i przeniesienie reakcji wiązania (Dzień 2)

1. Wyjąć 384-dołkową płytkę polipropylenową zawierającą reakcję wiązania (krok 6.2) z inkubatora w temperaturze 37 °C.
2. Rozcieńczyć reakcję wiązania w stosunku 1:1 buforem neutralizacyjnym. (robot do obsługi cieczy)
   1. Dodać 43 μl buforu neutralizacyjnego do każdej studzienki reakcji wiązania.
3. Wyjąć płytkę ELISA (krok 1.3) z 4 °C i przemyć 3x 60 ml/studzienkę PBS-0,05% Tween 20. (podkładka do płyty)
4. Przenieść 25 μl każdej zobojętnionej reakcji wiązania z kroku 7.2 do potrójnych studzienek pokrytej przeciwciałem 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 7.3. (Rysunek 1) (robot do obsługi cieczy)
5. Przykryj płytkę ELISA folią poliestrową i umieść na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub w lodówce o temperaturze 4 °C.

8. Rozwój testu ELISA (dzień 2 lub 3)

1. Wyjmij płytkę ELISA z kroku 7.5, przemyj 3 razy 60 μl/studzienkę PBS-0,05% Tween. (podkładka do płyty)
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy streptawidyny-europu (0,1 mg/ml streptawidyny, 7 Eu³⁺/streptawidyna) 1000-krotnie w buforze testowym DELFIA.
   1. Na jedną płytkę 384-dołkową rozcieńczyć 10 μl streptawidyny-europu w 10 ml buforu do oznaczania.
3. Dodać 25 μl rozcieńczonej streptawidyny-europu do każdego dołka 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.1. (robot do obsługi cieczy)
4. Przykryj płytkę folią poliestrową i umieść w ciemności w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Uwaga: Podczas 1-godzinnej inkubacji wyjmij roztwór wzmacniający z lodówki i odstaw 10 ml/płytkę na ciemność w temperaturze pokojowej.
5. Po 1-godzinnej inkubacji umyj 384-dołkową płytkę ELISA z kroku 8.3 3x 60 μl/studzienkę PBS-0,05% Tween. (podkładka do płyty)
6. Dodaj 25 μl roztworu wzmacniającego do każdego dołka 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.5. (robot do obsługi cieczy)
7. Przykryj 384-dołkową płytkę ELISA folią poliestrową i pozostaw płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej na 10-15 minut.
8. Po 10-15 minutowej inkubacji odczytaj fluorescencję 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.7 za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych z rozdzielczością czasową z ustawieniami europu (na przykład Start Int: 200, Stop Int: 1,000, Ex. 340, Em. 615, Cutoff: None, PMT: Auto, Reads/Well: 50).

9. Analiza danych

1. Wprowadź dane w formacie XY wykres z 3 powtórzonymi wartościami w kolumnach obok siebie (X = testowe stężenie peptydu; Y = pomiar fluorescencji).
2. Log przekształca wartości X dla wszystkich danych: X=log(X)
3. Dopasuj przekształcone dane dziennika do modelu powiązania konkurencyjnego z jedną lokacją, aby wyodrębnić wartość IC₅₀.
4. Ograniczyć dolną wartość do średniej wartości kontroli ujemnej.
5. Globalnie dopasuj najwyższą wartość i upewnij się, że parametr dopasowania globalnego jest niższy lub równy kontroli dodatniej.

Dojrzała sekwencja peptydowa beta-laktamazy Enterobacter cloacae P99 (BLA) (Genbank ID# X07274.1) została przeanalizowana za pomocą ProPred16 pod kątem przypuszczalnych wiążących peptydy z allelem MHC II DRB1*1501 (Tabela 4). ProPred zidentyfikował 117 peptydów nonamerowych z obowiązkową resztą kotwiczącą P1 (tj. M, L, I, V, F, Y lub W w pozycji 1, która jest wymagana do wiązania MHC II31). Przy progu 5% tylko peptydy z wynikami większymi lub równymi 2,6 są prawdopodobnymi spoiwami. Tak więc, przy progu 5%, przewiduje się, że tylko 11 górnych peptydów wiąże MHC II DRB1*1501.

Tabela 4. Najwyżej oceniane prognozy ProPred dla peptydów BLA i allelu MHC II DRB1*1501.

Reprezentatywny panel przewidywanych epitopów został wybrany do analizy w naszym teście wiązania MHC II (Tabela 4, pogrubione wpisy). Fragmenty peptydu BLA piętnastu reszt zostały zsyntetyzowane chemicznie w taki sposób, że przypuszczalne epitopy nonamerowe MHC II zostały osadzone w syntetycznych fragmentach białka. Podczas gdy sam rowek wiążący MHC II mieści tylko dziewięć aminokwasów, dowody sugerują, że sekwencje flankujące mogą wpływać na interakcje peptyd-MHC II, a zatem powszechnie stosuje się syntetyczne peptydy 15-20 reszt15. Aby przedstawić złożoność nakładających się na siebie epitopów, które mogą wystąpić w biologicznie przetworzonych fragmentach białek, przetestowaliśmy syntetyczne sekwencje, które zawierały (i) pojedyncze przewidywane spoiwa, (ii) pojedyncze przewidywane niewiążące, (iii) wiele przewidywanych niewiążących, (iv) wiele przewidywanych niewiążących lub (v) mieszaninę przewidywanych spoiw i niewiążących (tabele 4 i 5).

Tabela 5. Lista chemicznie syntetyzowanych peptydów.

Zdolność tych syntetycznych peptydów do konkurowania z biotynylowanym peptydem kontrolnym MBP-B (Tabela 3) do wiązania z MHC II DRB1*1501 została przeanalizowana zgodnie z opisem w powyższym protokole. Konkurencyjne krzywe wiązania dla peptydów syntetycznych przedstawiono na rysunku 2. Wartości IC50 obliczono poprzez dopasowanie danych przekształconych logarytmicznie przy użyciu jednomiejscowego konkurencyjnego wiązania, nieliniowej funkcji dopasowania Prism (Tabela 6). Jak widać na rysunku 2, peptydy naturalnie dzielą się na trzy grupy: silne spoiwa z IC50 < 1 μM (peptydy 2 i 10); umiarkowane spoiwa o sile 1 μM ≤ IC50 < 100 μM (peptydy 4, 9, 11 i 24); słabe spoiwa z IC50 ≥ 100 μM (peptyd 31).

Rysunek 2. Konkurencyjna krzywa wiązania peptydów BLA dla allelu MHC II DRB1*1501. Ciasne segregatory są dopasowane do pomarańczowych linii, umiarkowane do zielonych linii, a słabe do spoiwa do bordowej linii.

Tabela 6. Obliczono wartości IC50 fragmentów peptydu BLA dla DRB1*1501.

Leonard Moise jest zatrudniony i posiada opcje na akcje EpiVax, Inc., prywatnej firmy biotechnologicznej z siedzibą w Providence, RI. Praca zawarta w tym raporcie badawczym jest wolna od jakichkolwiek uprzedzeń, które mogą być związane z celami komercyjnymi firmy.