Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projekt epitopów immunogennych1,2. W tym przypadku test wiązania peptydu-MHC II jest skalowany do formatu 384-dołkowego. Zmniejszony protokół zmniejsza koszty odczynników o 75% i zapewnia wyższą przepustowość niż wcześniej opisane protokoły 96-dołkowe1,3-5. W szczególności projekt eksperymentalny pozwala na solidną i powtarzalną analizę do 15 peptydów przeciwko jednemu allelowi MHC II na 384-dołkową płytkę ELISA. Wykorzystując jednego robota do obsługi cieczy, metoda ta pozwala jednemu badaczowi przeanalizować około dziewięćdziesięciu peptydów testowych w trzech egzemplarzach w zakresie ośmiu stężeń i czterech typów alleli MHC II w czasie krótszym niż 48 godzin. Inni pracujący w dziedzinie deimmunizacji białek lub projektowania i opracowywania szczepionek mogą uznać protokół za przydatny w ułatwianiu własnej pracy. W szczególności instrukcje krok po kroku i format wizualny JoVE powinny pozwolić innym użytkownikom na szybkie i łatwe wdrożenie tej metodologii w ich własnych laboratoriach.
Wprowadzenie
Białka to najszybciej rosnąca klasa środków terapeutycznych6, a szybki rozwój linii bioterapeutycznych skupił coraz większą uwagę na wyzwaniach związanych z rozwojem i stosowaniem leków białkowych. Jedna wyjątkowa kwestia wynika z faktu, że w zdrowym i funkcjonującym układzie odpornościowym wszystkie białka zewnątrzkomórkowe są próbkowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Po internalizacji przez APC, białko jest rozszczepiane na małe fragmenty peptydu, a przypuszczalne segmenty immunogenne są ładowane do rowka białek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (MHC II). Kompleksy peptyd-MHC II są następnie wyświetlane na powierzchni APC, a prawd....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Test wiązania peptydów z MHC II składa się z czterech głównych etapów: 1-Wiązanie: Peptydy testowe konkurują z znakowanymi peptydami kontrolnymi o wiązanie rozpuszczalnych białek MHC II w fazie ciekłej. Wiązanie jest mierzone dla szerokiego zakresu stężeń peptydów testowych. 2-Wychwytywanie: Po osiągnięciu stanu równowagi reakcji wiązania, kompleksy peptyd-MHC II są wychwytywane i oddzielane od niezwiązanego peptydu i białka poprzez rozpoznawanie zależne od konformacji za pomocą unieruchomionego przeciwciała. 3-Detekcja: Wychwycony peptyd kontrolny jest wykrywany ilościowo przy użyciu fluorescencji rozdzielonej w czasie. 4-Analiza: Dane spektroskopowe są przetwarzane,....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Sekwencję dojrzałego peptydu beta-laktamazy (BLA) Enterobacter cloacae P99 (Genbank ID# X07274.1) przeanalizowano za pomocą programu ProPred16 w celu zidentyfikowania potencjalnych peptydów wiążących allel MHC II DRB1*1501 (Tabela 4). Program ProPred zidentyfikował 117 peptydów nonamerowych z obowiązkowym resztą kotwiczącą P1 (t.j. M, L, I, V, F, Y lub W w pozycji 1, co jest wymagane do wiązania z MHC II31). Przy progu 5%, prawdopodobnymi wiązadłami są tylko peptyd.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Bioterapeutyki stały się kamieniem węgielnym nowoczesnej medycyny, stanowiąc cztery z pięciu najlepiej sprzedających się leków w 2012 r.32. Sektor biofarmaceutyczny od kilku lat wykazuje stały wzrost6 , a ciągły rozwój nowych leków, a także pojawienie się leków biopodobnych poszerzyły linie biofarmaceutyczne. Patrząc w przyszłość, ocena i łagodzenie immunogenności terapii białkowych stanie się integralną częścią wczesnego etapu rozwoju bioterapeutyków. Aby ułatwić ten proces, biotechnolodzy mogą sko.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Leonard Moise jest zatrudniony i posiada opcje na akcje EpiVax, Inc., prywatnej firmy biotechnologicznej z siedzibą w Providence, RI. Praca zawarta w tym raporcie badawczym jest wolna od jakichkolwiek uprzedzeń, które mogą być związane z celami komercyjnymi firmy.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty NIH R01-GM-098977 i R21-AI-098122 dla CBK i KEG. RSS był częściowo wspierany przez stypendium Luce Foundation, a częściowo przez stypendium Thayer Innovation Program Fellowship z Thayer School of Engineering.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Tetraboran sodu Dekahydrat | Sigma | 221732 | |
| Kwas cytrynowy | Sigma | C1901 | |
| Dizasadowy fosforan sodu | Sigma | S7907 | |
| Trizma HCl | OmniPur | 9310 | |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | |
| 100% DMSO | Sigma | D8418 | |
| Oktyl-& beta;-D-Glucopyranaside | Fischer | 29836-26-8 | |
| Pefa Bloc SCF | Roche | 1158591600 | |
| Dulbecco' s 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Invitrogen | 14200-166 | |
| DELFIA Bufor | Perkin Elmer | 4002-0010 | |
| DELFIA Enhancement Buffer | Perkin Elmer | 4001-0010 | |
| Streptawidyna znakowana europem | Perkin Elmer | 1244-360 | |
| L243 przeciwciało anty-HLA-DR | Biolegend | 307602 | |
| Biotynylowane Peptydy znacznikowe | 21st Century Biochemicals | na zamówienie Peptydy | |
| testowe (1-4 mg, czystość 85%) | Genscript | Na zamówienie | |
| Oczyszczone monomery HLA-DRB1 (niebiotynylowane) | Instytut Badawczy Benaroya* | Zamówienie | |
| 384-dołkowa biała płytka EIA/RIA | Thermo | 460372 | |
| Polipropylenowa płytka 384-dołkowa | Costar | 3656 | |
| Folia, AxySeal, 80 i mikro; m, Aplikator ELISA | Axygen Ascientific | PCR-SP | |
| MilliQ Water | N/A | /A | |
| Epimotion Liquid Handler (lub podobny) | Eppendorf | 5075 | |
| Select TS Plate Washer (lub podobny) | BioTek | 405 | |
| SpectraMax Gemini Microplate Reader (lub podobny) | Urządzenia molekularne | N/A | |
| *Rekombinowane ludzkie cząsteczki MHC II można uzyskać w laboratorium Benaroya Tetramer Core Laboratory. Odesłanie: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory |
Bibliografia
- Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
- Raddrizzani, L., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes. There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2 in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
| MHC II Allele DRB1*: | 1501 |
| MHC II Stock Concentration (mg/ml) | 1.3 |
| MHC II Stock Concentration (mM) | 20 |
| Vol. MHC II Stock to Add (ml) | 14.65 |
| Vol. Reaction Buffer to Add (ml): | 2885.35 |
| MHC II Master Mix Concentration (nM) | 101 |
to:
| MHC II Allele DRB1*: | 1501 |
| MHC II Stock Concentration (mg/ml) | 1.3 |
| MHC II Stock Concentration (μM) | 20 |
| Vol. MHC II Stock to Add (μl) | 14.65 |
| Vol. Reaction Buffer to Add (μl): | 2885.35 |
| MHC II Master Mix Concentration (nM) | 101 |
