Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

DOI:

10.3791/51308

⸱

25 marca 2014

 ,  ,  , 
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projekt epitopów immunogennych1,2. W tym przypadku test wiązania peptydu-MHC II jest skalowany do formatu 384-dołkowego. Zmniejszony protokół zmniejsza koszty odczynników o 75% i zapewnia wyższą przepustowość niż wcześniej opisane protokoły 96-dołkowe1,3-5. W szczególności projekt eksperymentalny pozwala na solidną i powtarzalną analizę do 15 peptydów przeciwko jednemu allelowi MHC II na 384-dołkową płytkę ELISA. Wykorzystując jednego robota do obsługi cieczy, metoda ta pozwala jednemu badaczowi przeanalizować około dziewięćdziesięciu peptydów testowych w trzech egzemplarzach w zakresie ośmiu stężeń i czterech typów alleli MHC II w czasie krótszym niż 48 godzin. Inni pracujący w dziedzinie deimmunizacji białek lub projektowania i opracowywania szczepionek mogą uznać protokół za przydatny w ułatwianiu własnej pracy. W szczególności instrukcje krok po kroku i format wizualny JoVE powinny pozwolić innym użytkownikom na szybkie i łatwe wdrożenie tej metodologii w ich własnych laboratoriach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka to najszybciej rosnąca klasa środków terapeutycznych6, a szybki rozwój linii bioterapeutycznych skupił coraz większą uwagę na wyzwaniach związanych z rozwojem i stosowaniem leków białkowych. Jedna wyjątkowa kwestia wynika z faktu, że w zdrowym i funkcjonującym układzie odpornościowym wszystkie białka zewnątrzkomórkowe są próbkowane przez komórki prezentujące antygen (APC). Po internalizacji przez APC, białko jest rozszczepiane na małe fragmenty peptydu, a przypuszczalne segmenty immunogenne są ładowane do rowka białek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy II (MHC II). Kompleksy peptyd-MHC II są następnie wyświetlane na powierzchni APC, a prawdziwe peptydy immunogenne, zwane epitopami komórek T, tworzą trójskładnikowe kompleksy receptorów komórek T MHC II-peptyd-T z pokrewnymi receptorami powierzchniowymi komórek TCD4 7. To krytyczne zdarzenie rozpoznawania molekularnego inicjuje złożoną kaskadę sygnalizacyjną, która powoduje aktywację limfocytów T, uwalnianie cytokin, dojrzewanie limfocytów B za pośrednictwem limfocytów T CD4 i ostatecznie wytwarzanie krążących przeciwciał IgG, które wiążą się z obraźliwym białkiem egzogennym i usuwają je. W ten sposób białka immunogenne mogą być odimmunizowane poprzez identyfikację epitopów składowych limfocytów T i mutację kluczowych reszt odpowiedzialnych za tworzenie kompleksu MHC II. Należy jednak zauważyć, że epitopy limfocytów T mogą być liczne i szeroko rozpowszechnione w białkach immunogennych, a większość mutacji usuwających epitopy może powodować niezamierzoną utratę funkcji lub stabilności białka. W związku z tym inżynieria odimmunizowanych terapii biologicznych może być złożonym i technicznie trudnym celem, ale istnieje kilka przykładów udanych projektów delecji epitopów limfocytów T3,5,8-12. W przeciwieństwie do "humanizacji" opartej na szczepieniu, która jest w dużej mierze ograniczona do terapii przeciwciałami, delecja epitopu może być zastosowana do zasadniczo każdego celu białkowego, niezależnie od sekwencji, struktury, funkcji lub dostępności homologicznych ludzkich rusztowań. Pierwszym krokiem do wdrożenia takiego podejścia jest identyfikacja kluczowych epitopów peptydowych osadzonych w docelowej sekwencji białka.

Wysokoprzepustowe testy biochemiczne z wykorzystaniem syntetycznych peptydów i rekombinowanych ludzkich cząsteczek MHC II mogą dostarczyć szybkiego wstępnego wglądu w identyfikację epitopów i łagodzenie skutków1,3-5. Te testy typu ELISA mogą być potężnym uzupełnieniem innych narzędzi do projektowania i opracowywania białek/szczepionek. Na przykład jedno z dobrze ugruntowanych eksperymentalnych podejść do mapowania epitopów opiera się na czasochłonnych, pracochłonnych i zasobochłonnych testach proliferacji komórek ex vivo 15. Krótko mówiąc, pierwotna sekwencja białka docelowego jest najpierw dzielona na panel nakładających się peptydów, często 15-merów z 12 resztami nakładającymi się na sąsiednie peptydy. Panel peptydowy jest syntetyzowany chemicznie, a immunogenność każdego peptydu jest testowana w jednym z kilku różnych testów immunologicznych, które wykorzystują komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane od ludzkich dawców13,14. Aby zapewnić większą pewność wyników, peptydy są zwykle testowane w replikacji z PBMC od 50 lub więcej różnych dawców. W przypadkach, w których deimmunizacja jest ostatecznym celem, prace są dodatkowo komplikowane przez konieczność wyprodukowania dodatkowych paneli zmutowanych peptydów i przetestowania nowych paneli peptydowych w testach PBMC przed wprowadzeniem jakichkolwiek mutacji deimmunizujących do białka o pełnej długości w celu późniejszej analizy funkcjonalnej10. Chociaż te testy komórkowe pozostają złotym standardem w ocenie potencjału immunogennego u ludzi, skuteczność takiego wyczerpującego podejścia można poprawić poprzez wstępną filtrację przypuszczalnych epitopów immunogennych przy użyciu szybkiego i wysokoprzepustowego testu wiązania peptydów MHC II.

Podobnie, biochemiczne testy wiązania peptyd-MHC II mogą być połączone z metodami predykcyjnymi in silico, aby radykalnie przyspieszyć proces identyfikacji epitopów. Istnieje wiele narzędzi obliczeniowych do przewidywania epitopów limfocytów T; Przykłady obejmują ProPred16, MHCPred17, SVRMHC18, ARB19, SMM-align20, NetMHCIIpan21, a także zastrzeżone narzędzia, takie jak EpiMatrix firmy EpiVax22. Podobnie, predyktory epitopów zostały ostatnio połączone z innymi narzędziami bioinformatycznymi i modelowania molekularnego w celu uzyskania zintegrowanych algorytmów deimmunizacji białek zaprojektowanych w celu zmniejszenia ryzyka, że mutacje deimmunizujące mogą zakłócić strukturę i funkcję białka23-26. Podczas gdy kilka predyktorów epitopów okazało się dość dokładnych27,28, wyniki obliczeniowe niezmiennie wymagają walidacji eksperymentalnej. Szybkie, wysokowydajne i opłacalne metody eksperymentalne najlepiej nadają się jako filtr wstępny do przewidywania epitopów in silico.

Podobnie predyktory epitopów mogą kierować selekcją antygenów do odwróconej wakcynologii29,30. Na przykład postępy w bioinformatyce zaowocowały badaniami przesiewowymi całego genomu, które szybko identyfikują kandydatów na szczepionki w postaci całych białek lub epitopów peptydowych wyekstrahowanych z proteomów patogenów. Chociaż ta technologia wspomagająca zmienia proces odkrywania i opracowywania szczepionek ochronnych, wprowadza nowe wyzwanie w postaci nieubłaganie długich list kandydatów na szczepionki immunogenne. Wysokoprzepustowe testy wiązania peptydu-MHC II mogą kierować selekcją epitopów poprzez ilościowe określenie powinowactwa wiązania peptydów i rozwiązłości wiązania między wieloma allelami MHC II. Podobnie jak w przypadku deimmunizacji białek, takie metody eksperymentalne są ostatecznie wymagane do walidacji przewidywania obliczeniowego obiecujących potencjalnych szczepionek.

Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do formatu 384-dołkowego. Protokół jest wysoce zrównoleglony i zmniejsza koszty odczynników o 75% w porównaniu z wcześniej opisanymi formatami płytek 96-dołkowych1,3-5. Metoda ta, wykorzystująca jednego robota do obsługi cieczy, pozwala jednemu badaczowi łatwo przeanalizować około dziewięćdziesięciu peptydów testowych w trzech egzemplarzach w zakresie ośmiu stężeń i czterech typów alleli MHC II w czasie krótszym niż 48 godzin. W tym artykule opisano konfigurację jednej 384-dołkowej płytki ELISA do analizy siedmiu eksperymentalnych peptydów przeciwko jednemu allelowi MHC II, ale kalkulatory arkuszy kalkulacyjnych są dostarczane jako materiał dodatkowy, aby łatwo przeskalować eksperyment do dowolnej liczby pożądanych peptydów i / lub cząsteczek MHC II.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cztery główne działania składają się na test wiązania peptyd-MHC II: 1-Wiązanie: Peptydy testowe konkurują z znakowanymi peptydami kontrolnymi o wiązanie rozpuszczalnych białek MHC II w fazie roztworu. Wiązanie mierzy się w szerokim zakresie stężeń peptydów testowych. 2-Wychwytywanie: Gdy reakcja wiązania zbliża się do równowagi, kompleksy peptyd-MHC II są wychwytywane i oddzielane od niezwiązanego peptydu i białka przez zależne od konformacji rozpoznawanie za pomocą unieruchomionego przeciwciała. 3-Detekcja: Przechwycony peptyd kontrolny jest wykrywany ilościowo za pomocą fluorescencji rozdzielczej w czasie. 4-Analiza: Dane spektroskopowe są przetwarzane, wykreślane i analizowane w celu ustalenia zależnych od dawki właściwości wiązania testowego peptydu i białek MHC II.

Na różnych etapach poniższej procedury, zaleca się użycie robota do obsługi cieczy, jeśli jest dostępny. Szczególnie w formacie 384-dołkowym, automatyczne dozowanie i rozcieńczanie płynów minimalizuje błąd użytkownika, skutkuje bardziej spójnymi objętościami od odwiertu do studni i daje węższe 95% przedziały ufności dla wartości IC50 w porównaniu z ręcznymi testami 96-dołkowymi (dane nie pokazane). Jeśli robot do obsługi cieczy nie jest dostępny, czynności oznaczone adnotacją "(robot do obsługi cieczy)" można wykonać ręcznie. Podobnie, jeśli to możliwe, zalecana jest automatyczna myjka do płytek, która jest kompatybilna z formatem 384-dołkowym. To skutecznie standaryzuje proces mycia płyt. Jeśli podkładka do blach nie jest dostępna, kroki oznaczone adnotacją "(podkładka do płyty)" można wykonać ręcznie.

1. Pokryj tabliczkę ELISA (Dzień 1)

  1. Rozcieńczyć zapas przeciwciał L243 (0,5 mg/ml) w buforze boranowym do stężenia roboczego 10 μg/ml.
    1. Aby pokryć pojedynczą płytkę 384-dołkową, dodaj 200 μl przeciwciała podstawowego do 9,8 ml buforu boranowego. (Zobacz dodatkowy kalkulator arkusza kalkulacyjnego, aby uzyskać alternatywne skalowanie).
  2. Dodać 25 μl roztworu przeciwciała L243 do każdego dołka 384-dołkowej białej płytki ELISA o wysokim poziomie wiązania. (robot do obsługi cieczy)
  3. Uszczelnić płytkę folią poliestrową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Każda 384-dołkowa płytka ELISA może pomieścić do 15 peptydów testowych w ośmiu rozcieńczeniach dla jednego allelu MHC II, a także kontrole dodatnie i ujemne. Ostatecznie pozwoli to na trzykrotne pomiary.

2. Wykonaj testowe rozcieńczenia peptydów (Dzień 1)

  1. Zaczynając od 10 mM zapasu każdego testowanego peptydu w DMSO, wykonaj następującą serię rozcieńczeń w buforze fosforanowo-cytrynianowym przy użyciu 384-dołkowych płytek polipropylenowych (Tabela 1). (robot do obsługi cieczy)
    Uwaga: Pełna 384-dołkowa płytka polipropylenowa wymaga trzech oddzielnych płytek ELISA. Jedna trzecia płytki polipropylenowej będzie wymagała tylko jednej płytki ELISA (rysunek 1).
Pręty TGL TGL TGL TGL szt. TGL TGL pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Liczba rozcieńczeniaObjętość do pobrania z wcześniejszego rozcieńczenia/zapasuBufor cytrynianu objętości do dodaniaStężenie rozcieńczeniaStężenie w reakcji wiążącejStężenie w zneutralizowanym teście ELISA
(μl)(μl)(μM)(μM)(μM)
10,7Pytanie 35,1195.53197.76548 883
cyfra arabskaRozdział 14,3Rozdział 14,397.76548 88324 441
37,1Klasa 28,719 3899,6954,847
4Rozdział 14,3Rozdział 14,39,6954,8472,424
57,1Klasa 28,71,9230,9610,481
6Rozdział 14,3Rozdział 14,30,9610,4810,24
77,1Klasa 28,70,1910,0950,048
8Rozdział 14,3Rozdział 14,30,0950,0480,024
Usuń i wyrzuć 7,1 μl roztworu peptydu z rozcieńczenia numer 8.

Tabela 1. Przygotowanie serii rozcieńczeń peptydu testowego.

figure-protocol-1
Rysunek 1. Mapa płytkowa testu wiązania peptydów. (A) Mapa rozcieńczeń peptydów w 384-dołkowych płytkach polipropylenowych. Każda płytka polipropylenowa może pomieścić trzy grupy po 15 peptydów w reakcjach wiązania konkurencyjnego przeciwko pojedynczemu allelowi MHC II. (B) Gdy reakcja wiązania zbliża się do równowagi, każda grupa peptydowa jest przenoszona, w trzech częściach, na oddzielną 384-dołkową płytkę ELISA, która została wstępnie pokryta przeciwciałem anty-MHC II.

3. Przygotuj główny miks MHC II (Dzień 1)

  1. Zrób bufor reakcyjny
    1. Dodać 80 μl 1 mM Pefa Bloc i 60 μg oktylo-β-D-glukopiprenidu do 3,920 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego. (Zobacz dodatkowy kalkulator arkusza kalkulacyjnego, aby uzyskać alternatywne skalowanie).
  2. Rozcieńczyć wybrane roztwory podstawowe MHC II do 101 nM w buforze reakcyjnym za pomocą stożkowej probówki o pojemności 15 ml (Tabela 2).
    Uwaga: Stężenie MHC II ostatecznie wyniesie 50 nM w reakcji wiązania i 25 nM w zobojętnionym teście ELISA. Stężenia zapasów MHC II będą się różnić w zależności od numeru partii producenta. (Zobacz dodatkowy kalkulator arkusza kalkulacyjnego).
szt. szt.
Allel MHC II DRB1*:1501
Stężenie zapasów MHC II (mg/ml)1.3
Stężenie zapasów MHC II (μM)20
Vol. MHC II Zapas do dodania (μl)godz. 14.65
Obj. Bufor reakcyjny do dodania (μl):2885.35
Stężenie MHC II Master Mix (nM)Rozdział 101

Tabela 2. Przygotowanie mieszanki głównej MHC II.

4. Przygotowanie kontroli negatywnej i pozytywnej (Dzień 1)

  1. Dodać 21,5 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego do studzienki "kontroli ujemnej" 384-dołkowej płytki polipropylenowej z kroku 2.1 (Rysunek 1A).
  2. Dodać 21,5 μl buforu fosforanowo-cytrynianowego do studzienki "kontroli pozytywnej" 384-dołkowej płytki polipropylenowej.
    Uwaga: "kontrola pozytywna" zostanie zakończona w sekcji 5 poniżej.
  3. Usunąć 49,5 μl MHC II Master Mix z kroku 3.2 i odpipetować do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml.
  4. Dodać 0,5 μl buforu cytrynianowego do 49,5 μl głównej mieszanki MHC II z kroku 4.3.
  5. Dodać 21,5 μl mieszanki MHC II Master Mix o skorygowanym stężeniu z kroku 4.4 do studzienki "kontroli ujemnej" 384-dołkowej płytki polipropylenowej (rysunek 1A).
    Uwaga: ta próbka reprezentuje kontrolę ujemną o zerowym sygnale zawierającą białko MHC II, peptyd kontrolny NO i peptyd testowy NO.

5. Dodaj odpowiedni peptyd kontrolny do głównego miksu MHC II (Dzień 1)

szt.
Allel MHC II DRB1*Biotynylowany peptyd kontrolny(pozostałości)kolejność
Numer katalogowy 0101Grypa-HA-B(306-318)Biotyna-(Ahx)(Ahx)PRYVKQNTLKLAT-amid
Numer katalogowy: 0301Mioglobiny(137-148)Biotyna-(Ahx)-(Ahx)-LFRKDIAAKYKE-OH
Numer katalogowy: 0401YAR-B(1-14)Biotyna-(Ahx)(Ahx)YARFQSQTTLKQKT-OH
Numer katalogowy: 0701TetTox-B(830-843)Biotyna-(Ahx)(Ahx)QYIKANSKFIGITE-OH
Numer katalogowy 1101Grypa-HA-B(306-318)Biotyna-(Ahx)(Ahx)PRYVKQNTLKLAT-amid
1501MBP-B (84-102)Biotyna-(Ahx)(Ahx)NPVVHFFKNKNIVTPRTPPPS-OH

*Zalecamy zamówienie skali 10 mg dla economy.
Tabela 3. Peptydy kontrolne dla różnych alleli MHC II.*

  1. Rozcieńczyć peptyd kontrolny (przechowywany w temperaturze 400 μM w DMSO) w stosunku 1:20 w świeżym DMSO, aby otrzymać rozcieńczony materiał w temperaturze 20 μM.
    1. Dodać 25 μl 400 μM peptydu kontrolnego do 475 μl DMSO. Uwaga: jest to duży nadmiar, ale pozwala na dokładne obchodzenie się z lepkimi roztworami DMSO.
  2. Dalej rozcieńczyć peptyd kontrolny z kroku 5.1 (20 μM) 1:100 do MHC II Master Mix z kroku 3.2.
    1. Dodać 28,8 μl peptydu kontrolnego rozcieńczonego w kroku 5.2 do pozostałych 2 850,5 μl MHC II Master Mix.
  3. Dodać 21,5 μl mieszanki MHC II Master Mix z peptydem kontrolnym (krok 5.2) do studzienki kontroli pozytywnej 384-dołkowej płytki polipropylenowej (krok 4.2) (rysunek 1A). Uwaga: ta próbka reprezentuje wysokosygnałową kontrolę pozytywną zawierającą białko MHC II, peptyd kontrolny i peptyd testowy NO.

6. Wykonaj reakcję wiążącą (Dzień 1)

  1. Dodać MHC II Master Mix zawierającą peptyd kontrolny (krok 5.2) do każdego z rozcieńczeń peptydu testowego (etap 2.1) w stosunku 1:1, aby uzyskać reakcję wiązania.
    1. Dodać 21,5 μl mieszaniny MHC II Master Mix zawierającej peptyd kontrolny z kroku 5.2 do 21,5 μl każdego rozcieńczenia peptydu testowego z kroku 2.1. (robot do obsługi cieczy)
  2. Uszczelnić reakcję wiązania folią poliestrową i inkubować przez 12-24 godziny w inkubatorze niekontrolowanym przez CO2 w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.

7. Neutralizacja i przeniesienie reakcji wiązania (Dzień 2)

  1. Wyjąć 384-dołkową płytkę polipropylenową zawierającą reakcję wiązania (krok 6.2) z inkubatora w temperaturze 37 °C.
  2. Rozcieńczyć reakcję wiązania w stosunku 1:1 buforem neutralizacyjnym. (robot do obsługi cieczy)
    1. Dodać 43 μl buforu neutralizacyjnego do każdej studzienki reakcji wiązania.
  3. Wyjąć płytkę ELISA (krok 1.3) z 4 °C i przemyć 3x 60 ml/studzienkę PBS-0,05% Tween 20. (podkładka do płyty)
  4. Przenieść 25 μl każdej zobojętnionej reakcji wiązania z kroku 7.2 do potrójnych studzienek pokrytej przeciwciałem 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 7.3. (Rysunek 1) (robot do obsługi cieczy)
  5. Przykryj płytkę ELISA folią poliestrową i umieść na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C lub w lodówce o temperaturze 4 °C.

8. Rozwój testu ELISA (dzień 2 lub 3)

  1. Wyjmij płytkę ELISA z kroku 7.5, przemyj 3 razy 60 μl/studzienkę PBS-0,05% Tween. (podkładka do płyty)
  2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy streptawidyny-europu (0,1 mg/ml streptawidyny, 7 Eu3+/streptawidyna) 1000-krotnie w buforze testowym DELFIA.
    1. Na jedną płytkę 384-dołkową rozcieńczyć 10 μl streptawidyny-europu w 10 ml buforu do oznaczania.
  3. Dodać 25 μl rozcieńczonej streptawidyny-europu do każdego dołka 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.1. (robot do obsługi cieczy)
  4. Przykryj płytkę folią poliestrową i umieść w ciemności w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Uwaga: Podczas 1-godzinnej inkubacji wyjmij roztwór wzmacniający z lodówki i odstaw 10 ml/płytkę na ciemność w temperaturze pokojowej.
  5. Po 1-godzinnej inkubacji umyj 384-dołkową płytkę ELISA z kroku 8.3 3x 60 μl/studzienkę PBS-0,05% Tween. (podkładka do płyty)
  6. Dodaj 25 μl roztworu wzmacniającego do każdego dołka 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.5. (robot do obsługi cieczy)
  7. Przykryj 384-dołkową płytkę ELISA folią poliestrową i pozostaw płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej na 10-15 minut.
  8. Po 10-15 minutowej inkubacji odczytaj fluorescencję 384-dołkowej płytki ELISA z kroku 8.7 za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych z rozdzielczością czasową z ustawieniami europu (na przykład Start Int: 200, Stop Int: 1,000, Ex. 340, Em. 615, Cutoff: None, PMT: Auto, Reads/Well: 50).

9. Analiza danych

  1. Wprowadź dane w formacie XY wykres z 3 powtórzonymi wartościami w kolumnach obok siebie (X = testowe stężenie peptydu; Y = pomiar fluorescencji).
  2. Log przekształca wartości X dla wszystkich danych: X=log(X)
  3. Dopasuj przekształcone dane dziennika do modelu powiązania konkurencyjnego z jedną lokacją, aby wyodrębnić wartość IC50.
  4. Ograniczyć dolną wartość do średniej wartości kontroli ujemnej.
  5. Globalnie dopasuj najwyższą wartość i upewnij się, że parametr dopasowania globalnego jest niższy lub równy kontroli dodatniej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dojrzała sekwencja peptydowa beta-laktamazy Enterobacter cloacae P99 (BLA) (Genbank ID# X07274.1) została przeanalizowana za pomocą ProPred16 pod kątem przypuszczalnych wiążących peptydy z allelem MHC II DRB1*1501 (Tabela 4). ProPred zidentyfikował 117 peptydów nonamerowych z obowiązkową resztą kotwiczącą P1 (tj. M, L, I, V, F, Y lub W w pozycji 1, która jest wymagana do wiązania MHC II31). Przy progu 5% tylko peptydy z wynikami większymi lub równymi 2,6 są prawdop...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bioterapeutyki stały się kamieniem węgielnym nowoczesnej medycyny, stanowiąc cztery z pięciu najlepiej sprzedających się leków w 2012 r.32. Sektor biofarmaceutyczny od kilku lat wykazuje stały wzrost6 , a ciągły rozwój nowych leków, a także pojawienie się leków biopodobnych poszerzyły linie biofarmaceutyczne. Patrząc w przyszłość, ocena i łagodzenie immunogenności terapii białkowych stanie się integralną częścią wczesnego etapu rozwoju bioterapeutyków. Aby ułatwić ten proces, biotechnolodzy mogą sko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leonard Moise jest zatrudniony i posiada opcje na akcje EpiVax, Inc., prywatnej firmy biotechnologicznej z siedzibą w Providence, RI. Praca zawarta w tym raporcie badawczym jest wolna od jakichkolwiek uprzedzeń, które mogą być związane z celami komercyjnymi firmy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01-GM-098977 i R21-AI-098122 dla CBK i KEG. RSS był częściowo wspierany przez stypendium Luce Foundation, a częściowo przez stypendium Thayer Innovation Program Fellowship z Thayer School of Engineering.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tetraboran sodu DekahydratSigma221732
Kwas cytrynowySigmaC1901
Dizasadowy fosforan soduSigmaS7907
Trizma HClOmniPur9310
Tween-20SigmaP7949
100% DMSOSigmaD8418
Oktyl-& beta;-D-GlucopyranasideFischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco' s 10x sól fizjologiczna buforowana fosforanamiInvitrogen14200-166
DELFIA BuforPerkin Elmer4002-0010
DELFIA Enhancement BufferPerkin Elmer4001-0010
Streptawidyna znakowana europemPerkin Elmer1244-360
L243 przeciwciało anty-HLA-DRBiolegend307602
Biotynylowane Peptydy znacznikowe21st Century Biochemicalsna zamówienie Peptydy
testowe (1-4 mg, czystość 85%)GenscriptNa zamówienie
Oczyszczone monomery HLA-DRB1 (niebiotynylowane)Instytut Badawczy Benaroya*Zamówienie
384-dołkowa biała płytka EIA/RIAThermo460372
Polipropylenowa płytka 384-dołkowaCostar3656
Folia, AxySeal, 80 i mikro; m, Aplikator ELISA Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ WaterN/A/A
Epimotion Liquid Handler (lub podobny)Eppendorf5075
Select TS Plate Washer (lub podobny)BioTek405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (lub podobny)Urządzenia molekularneN/A
*Rekombinowane ludzkie cząsteczki MHC II można uzyskać w laboratorium Benaroya Tetramer Core Laboratory.  Odesłanie: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory
testowy niestandardowe N

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al. Different modes of peptide interaction enable HLA-DQ and HLA-DR molecules to bind diverse peptide repertoires. J. Immunol. 159, 703-711 (1997).
  3. Osipovitch, D. C., et al. Design and analysis of immune-evading enzymes for ADEPT therapy. Protein Eng. Design. 25, 613-623 (2012).
  4. Moise, L., et al. In silico-accelerated identification of conserved and immunogenic variola/vaccinia T-cell epitopes. Vaccine. 27, 6471-6479 (2009).
  5. Moise, L., et al. Effect of HLA DR epitope de-immunization of Factor VIII in vitro and in vivo. Clin. Immunol. 142, 320-331 (2012).
  6. Aggarwal, S. R. What's fueling the biotech engine-2011 to 2012. Nat. Biotechnol. 30, 1191-1197 (2012).
  7. Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Ann. Rev. Immunol. 23, 975-1028 (2005).
  8. Warmerdam, P. A. M., et al. Elimination of a human T-cell region in staphylokinase by T-cell screening and computer modeling. Thrombosis Haemostasis. 87, 666-673 (2002).
  9. Jones, T. D., et al. Identification and removal of a promiscuous CD4+T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J. Thrombosis Haemostasis. 3, 991-1000 (2005).
  10. Harding, F. A., et al. A beta-lactamase with reduced immunogenicity for the targeted delivery of chemotherapeutics using antibody-directed enzyme prodrug therapy. Mol. Cancer. 4, 1791-1800 (2005).
  11. Mazor, R., et al. Identification and elimination of an immunodominant T-cell epitope in recombinant immunotoxins based on Pseudomonas exotoxin A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E3597-E3603 (2012).
  12. Cantor, J. R., et al. Therapeutic enzyme deimmunization by combinatorial T-cell epitope removal using neutral drift. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1272-1277 (2011).
  13. Kern, F., LiPira, G., Gratama, J. W., Manca, F., Roederer, M. Measuring Ag-specific immune responses: understanding immunopathogenesis and improving diagnostics in infectious disease, autoimmunity and cancer. Trends Immunol. 26, 477-484 (2005).
  14. Li Pira, G., Ivaldi, F., Moretti, P., Manca, F. High throughput T epitope mapping and vaccine development. J. Biomed. Biotechnol. 2010, 325720(2010).
  15. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  16. Singh, H., Raghava, G. P. ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17, 1236-1237 (2001).
  17. Guan, P., Doytchinova, I. A., Zygouri, C., Flower, D. R. MHCPred: bringing a quantitative dimension to the online prediction of MHC binding. Appl. Bioinformatics. 2, 63-66 (2003).
  18. Wan, J., et al. SVRMHC prediction server for MHC-binding peptides. BMC Bioinformatics. 7, 463(2006).
  19. Bui, H. H., et al. Automated generation and evaluation of specific MHC binding predictive tools: ARB matrix applications. Immunogenetics. 57, 304-314 (2005).
  20. Nielsen, M., Lundegaard, C., Lund, O. Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align, a novel stabilization matrix alignment method. BMC Bioinformatics. 8, 238(2007).
  21. Nielsen, M., Justesen, S., Lund, O., Lundegaard, C., Buus, S. NetMHCIIpan-2.0 - Improved pan-specific HLA-DR predictions using a novel concurrent alignment and weight optimization training procedure. Immun. Res. 6, 9(2010).
  22. De Groot, A. S., Knopp, P. M., Martin, W. De-immunization of therapeutic proteins by T-cell epitope modification. Dev. Biol. 122, 171-194 (2005).
  23. Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-based redesign of proteins for minimal T-cell epitope content. J. Comput. Chem. 34, 879-891 (2013).
  24. Parker, A. S., Choi, Y., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Structure-guided deimmunization of therapeutic proteins. J. Comput. Biol. 20, 152-165 (2013).
  25. Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions. J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).
  26. Parker, A. S., Zheng, W., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. Optimization algorithms for functional deimmunization of therapeutic proteins. BMC Bioinformatics. 11, 180(2010).
  27. De Groot, A. S., Martin, W. Reducing risk, improving outcomes: Bioengineering less immunogenic protein therapeutics. Clin. Immunol. 131, 189-201 (2009).
  28. Wang, P., et al. A systematic assessment of MHC class II peptide binding predictions and evaluation of a consensus approach. PLoS Comput. Biol. 4, e1000048(2008).
  29. Sette, A., Rappuoli, R. Reverse vaccinology: developing vaccines in the era of genomics. Immunity. 33, 530-541 (2010).
  30. Moise, L., Cousens, L., Fueyo, J., De Groot, A. S. Harnessing the power of genomics and immunoinformatics to produce improved vaccines. Expert Opin. Drug Discov. 6, 9-15 (2011).
  31. Sturniolo, T., et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17, 555-561 (1999).
  32. Biologic drugs set to top 2012 sales. Nat. Med. 18, 636(2012).
  33. Seib, K. L., Zhao, X., Rappuoli, R. Developing vaccines in the era of genomics: a decade of reverse vaccinology. Clin. Microbiol. Infect. 18, 109-116 (2012).
  34. Jiang, W., Boder, E. T. High-throughput engineering and analysis of peptide binding to class II MHC. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 13258-13263 (2010).
  35. Justesen, S., Harndahl, M., Lamberth, K., Nielsen, L. -L. B., Buus, S. Functional recombinant MHC class II molecules and high-throughput peptide-binding assays. Immun. 5, 1-20 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

Tagi

Peptide Epitope AnalysisHigh Throughput ELISASolution Phase CompetitionTime Resolved FluorometryPeptide MHC II ComplexImmunogenic Epitope IdentificationProtein DeimmunizationVaccine DesignLiquid Handling Robot

Powiązane artykuły