Artykuł metodologiczny

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

DOI:

10.3791/51311

⸱

25 kwietnia 2014

 , 
1Department of Internal Medicine, University of Michigan Comprehensive Cancer Center, 2Department of Pathology, University of Michigan Comprehensive Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowa hodowla komórek nabłonka sutka na odtworzonej błonie podstawnej jest użyteczną metodą do podsumowania in vivo architektury łagodnej piersi i odróżnienia złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi. Co ważne, system ten może być stosowany do badania raków inwazyjnych w innych tkankach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inwazyjne raki piersi to grupa złośliwych nowotworów nabłonkowych charakteryzujących się inwazją sąsiednich tkanek i skłonnością do przerzutów. Wzajemne oddziaływanie sygnałów między komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem wywiera silny wpływ na wzrost raka piersi i zachowanie biologiczne1. Jednak większość tych sygnałów z macierzy zewnątrzkomórkowej jest tracona lub ich znaczenie jest niedostatecznie zbadane, gdy komórki są hodowane w kulturze dwuwymiarowej (2D) jako monowarstwa. W ostatnich latach trójwymiarowa (3D) hodowla na odtworzonej błonie podstawnej pojawiła się jako metoda z wyboru do rekapitulacji architektury tkankowej łagodnych i złośliwych komórek piersi. Komórki hodowane w 3D zachowują ważne sygnały z macierzy zewnątrzkomórkowej i zapewniają fizjologicznie istotny system ex vivo 2,3. Warto zauważyć, że istnieje coraz więcej dowodów sugerujących, że komórki zachowują się inaczej, gdy są hodowane w 3D w porównaniu z 2D4. Hodowla 3D może być skutecznie stosowana jako środek do odróżniania złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi oraz do wspierania zaangażowanej sygnalizacji komórkowej i molekularnej3. Jedną z cech wyróżniających łagodne komórki nabłonkowe jest to, że są one spolaryzowane tak, że cytoplazma wierzchołkowa jest skierowana w stronę światła, a cytoplazma podstawy spoczywa na błonie podstawnej. Ta cierpko-podstawowa polaryzacja jest tracona w inwazyjnych rakach piersi, które charakteryzują się dezorganizacją komórkową i tworzeniem się zespoleń i rozgałęzionych kanalików, które przypadkowo naciekają otaczający zrąb. Te histopatologiczne różnice między rakiem łagodnym a rakiem inwazyjnym można odtworzyć w 3D6,7. Korzystając z odpowiednich odczytów, takich jak kwantyfikacja pojedynczych okrągłych struktur groniastych lub różnicowa ekspresja zwalidowanych markerów molekularnych dla proliferacji, polarności i apoptozy komórek w połączeniu z innymi technikami biologii molekularnej i komórkowej, hodowla 3D może stanowić ważne narzędzie do lepszego zrozumienia zmian komórkowych podczas transformacji nowotworowej i do wyznaczenia odpowiedzialnej sygnalizacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowa hodowla (3D) komórek nabłonka piersi na odtworzonej błonie podstawnej jest ważnym systemem modelowym do badania złożonego fenotypu i związanej z nim sygnalizacji prawidłowego raka piersi2,3. Jednostką funkcjonalną piersi jest jednostka zrazikowa przewodu końcowego (TDLU), która składa się z małego przewodu, który rozgałęzia się na acini. Acini są wysoce zorganizowanymi strukturami, składającymi się z dwóch warstw komórkowych, komórek nabłonkowych i mioepitelialnych, które są otoczone błoną podstawną5. Najbardziej charakterystycznymi cechami normalnej acini są polaryzacja komórkowa, przywiązanie do leżącej poniżej błony podstawnej i wyspecjalizowane kontakty komórka-komórka. Ta skomplikowana organizacja jest zaburzona w rakach inwazyjnych. Szeroko stosowane hodowle 2D, w których komórki są hodowane jako monowarstwy, nie pozwalają na tworzenie się acini. W związku z tym kultura jednowarstwowa nie zapewnia systemu do uchwycenia skomplikowanego związku między komórkami nabłonka w normalnej piersi a ich deregulacją w raku piersi. W kilku laboratoriach opracowano funkcjonalne monotypowe kultury nabłonkowe komórek piersi2,3. Hodowla 3D polega na wzroście komórek piersi na Matrigel, który jest rozpuszczonym ekstraktem pochodzącym z komórek mięsaka myszy Engelbreth-Holm-Swarm i jest dostępny na rynku. Stosowane są również inne podłoża 3D, takie jak kolagen I. Komórki piersi mogą być hodowane w 3D za pomocą wbudowanego testu 3D, w którym komórki są hodowane w Matrigel2. Alternatywnie, komórki mogą być hodowane za pomocą testu 3D na górze, zwanego również testem nakładkowym 3D, który jest opłacalny, ponieważ wymaga mniejszej objętości Matrigelu i ułatwia monitorowanie tworzenia kolonii w czasie za pomocą obrazowania z kontrastem fazowym i jest idealny do obrazowania in situ 2-3. Test 3D na górze został wykorzystany do określenia korelacji między fenotypem ziarniastym a profilem ekspresji genów7.

3D hodowla może być skutecznie wykorzystana do odróżnienia normalnych i łagodnych komórek od raka inwazyjnego. Normalne i łagodne komórki piersi tworzą spolaryzowane struktury zatrzymane w porachunku z dobrze zdefiniowanym światłem w środku na Matrigel, podczas gdy komórki raka inwazyjnego rosną obficie i przypadkowo, bez oczyszczania światła. Unieśmiertelnione ludzkie komórki nabłonka sutka E6 / E7 i linia komórkowa MCF10A, która jest spontanicznie unieśmiertelnioną linią komórkową wyizolowaną od 36-letniej pacjentki ze zmianami włóknisto-torbielowatymi, zostały z powodzeniem wykorzystane do uchwycenia łagodnego fenotypu piersi w 3D3,8 i posłużyły jako system modelowy do badania onkogennej i supresorowej funkcji nowotworowej kilku cząsteczek8,9. Te łagodne komórki mogą być zmodyfikowane tak, aby manipulowały genami będącymi przedmiotem zainteresowania poprzez wprowadzenie lentiwirusa/retrowirusa. Jeśli interesujący gen (geny) jest supresorem guza, knockdown za pośrednictwem shRNA doprowadzi do złośliwej transformacji, podczas gdy jeśli gen będący przedmiotem zainteresowania jest onkogenem, nadekspresja w łagodnych komórkach powinna wykazywać złośliwy fenotyp. W obu przypadkach struktury groniaste utworzone w 3D mogą uchwycić złośliwą transformację.

Łagodne pojedyncze komórki pokryte 3D zaczynają się namnażać i tworzyć okrągłe kuliste struktury. Do 5-8 dnia ten kulisty agregat komórek zróżnicuje się w otaczającą spolaryzowaną warstwę komórek, która jest w kontakcie z Matrigelem, oraz wewnętrzną masę mniej spolaryzowanych komórek, które nie mają kontaktu z Matrigelem. W ciągu najbliższych 10-15 dni komórki wewnętrzne zaczną obumierać w wyniku apoptozy, tworząc przezroczyste światło. Złośliwe komórki będą rosły przypadkowo, tracąc swoją polarność. Wysoce złośliwe komórki zwykle tworzą rozgałęzione struktury. Te różnice w fenotypie można uchwycić za pomocą obrazowania z kontrastem w fazie poklatkowej oraz barwienia immunologicznego in situ za pomocą odpowiednich markerów molekularnych. Najczęściej stosowanymi markerami są alfa 6-integryna, podstawowy marker polarności, w połączeniu z markerem proliferacji fosfohistonem 3 i markerem apoptozy rozszczepionej kaspazy-3. To ostatnie jest ważne dla ustalenia, czy w środku acini tworzy się światło, co jest cechą normalnych i łagodnych komórek piersi. Inne markery polarności i kontaktu komórka-komórka to GM130, laminina, ERM, E-kadheryna. Alternatywnie, linie komórkowe raka piersi mogą być zmodyfikowane tak, aby manipulować genem, który jest przedmiotem zainteresowania. W takim przypadku powrót do bardziej zatrzymanego wzrostu łagodnego fenotypu może być wykorzystany jako odczyt w celu odróżnienia od fenotypu raka.

3D kultura może być również ostrożnie wykorzystana do wyznaczenia szlaków sygnałowych zaangażowanych w złośliwą transformację10-11. Korzystając z wyżej wymienionych odczytów, można zastosować inhibitory farmakologiczne, przeciwciała blokujące lub białka rekombinowane, aby precyzyjnie określić sygnalizację molekularną, prowadząc do transformacji złośliwej. Dzięki ciągłym wysiłkom różnych laboratoriów możliwe jest wyekstrahowanie komórek z 3D w celu wyizolowania RNA, a także przygotowania lizatów do immunoblottingu i immunoprecypitacji. Strategie te są opisane w protokole w sposób stopniowy i szczegółowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów i pożywek hodowlanych

  1. Rozmrażanie o zredukowanym współczynniku wzrostu (GFR) Matrigel w temperaturze 4 °C O/N.
  2. Rozgrzej kompletną pożywkę dla wymaganej linii komórkowej w temperaturze 37 °C. Pożywka określona przez MCF10A- ATCC; HME- Pożywka F-12 firmy Ham's uzupełniona 5% płodową surowicą bydlęcą, 1 μg/ml hydrokortyzonu, 5 μg/ml insuliny, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu i 100 ng/ml toksyny; SUM149- Pożywka F-12 firmy Ham's uzupełniona o 5% FBS, 2 μg/ml hydrokortyzonu i 5 μg/ml insuliny; oraz MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
  3. Wstępnie schłodzić szkiełko z 8-dołkową komorą na lodzie.
  4. Przygotuj kaptur do hodowli tkankowych i materiały.

2. Hodowla trójwymiarowa w 8-dołkowym szkiełku komorowym

  1. Pokryj każdą studzienkę szkiełka 8-dołkowego 40 μl GFR Matrigel. Dodaj Matrigel na środku szkiełka, a następnie rozprowadź za pomocą końcówki do pipety P200. Staraj się rozprowadzać tak równomiernie, jak to możliwe, unikając pęcherzyków i nadmiernego rozprowadzania, które mogą prowadzić do powstania łąkotki.
  2. Inkubować szkiełka w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 . Podczas krzepnięcia Matrigel trypsynizuj komórki, zbieraj i wiruj w tempie 150 x g w wirówce do hodowli tkankowych przez 4 minuty.
  3. Policz komórki i rozcieńcz do 12 500 komórek/ml w kompletnej pożywce odpowiedniej linii komórkowej. Dodać GFR Matrigel do 2% i dodać 400 μl do każdego dołka wstępnie powlekanego szkiełka komorowego Matrigel.
  4. Inkubować szkiełka w inkubatorzeCO2. Podawaj świeże, kompletne zmiany podłoża co 4dni do 15 dni.
  5. Leczenie inhibitorami farmakologicznymi: W przypadku badań nad inhibitorami należy dodać inhibitory małocząsteczkowe do kompletnej pożywki w czasie posiewu, a następnie nowe zmiany pożywki uzupełniane inhibitorami co trzy dni podczas hodowli komórek na GFR Matrigel.
  6. Leczenie oczyszczonym białkiem:
    1. Umieść komórki na płytkach, wykonując czynności 2.1-2.3. Pozwól kulturom rosnąć przez 4 dni, a następnie głodz surowicy przez 16 godzin.
    2. W 5 dniu należy potraktować komórki odpowiednim stężeniem oczyszczonego białka w 0,1% pożywce uzupełnionej FBS do komórek wygłodzonych w surowicy. Po 2 dniach należy podać świeżą pożywkę z oczyszczonym białkiem.
    3. W 10 dniu wymień kondycjonowane media na kompletne media HME. Pozwól kulturom rosnąć przez kolejne 5 dni.
  7. Barwienie immunofluorescencyjne struktur groniastych wyhodowanych na Matrigelu:
    1. Przygotuj 2% paraformaldehydu, 0,5% Triton X-100 i 100 mM glicyny w 1x PBS, pH 7,4. Przygotuj bufor immunofluorescencyjny (bufor IF), który składa się z 1x PBS zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej, 0,2% trytonu X-100, 0,05% Tween-20.
    2. Użyj końcówki do pipety P200, aby ostrożnie zassać kondycjonowane media.
    3. Utrwalić struktury ziarniaste za pomocą 2% świeżo przygotowanego paraformaldehydu w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
    4. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,5% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Umyj kultury trzy razy 100 mM glicyny, 10-15 minut na każde pranie.
    6. Zablokuj komórki 10% surowicą kozią w buforze IF, zwanym blokiem pierwotnym, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Inkubować kultury z 20 μg/ml koziego fragmentu F(ab')2 przeciwko mysi w pierwotnym buforze blokowym przez 30 minut. Ten krok jest ważny, aby zablokować immunoreaktywne gatunki mysich IgG w Matrigelu.
    8. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w drugim roztworze blokującym (blok pierwszorzędowy + 20 μg/ml kozi fragment F(ab')2 kozy) O/N w temperaturze 4 °C.
    9. Przemyć trzykrotnie buforem IF przez 10-15 minut każdy z delikatnym kołysaniem.
    10. Inkubować z fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami drugorzędowymi w buforze IF przez 45 minut.
    11. Myć 3x po 10 min buforem IF z delikatnym kołysaniem.
    12. Zamontuj szkiełka za pomocą odczynnika zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI, aby uwidocznić jądra.
    13. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia O/N w temperaturze pokojowej.
    14. Akwizycja obrazu: Uzyskaj obrazy konfokalne w środkowej części kolonii komórek wyhodowanych na wierzchu Matrigel. Aby uzyskać więcej informacji, uzyskaj szereg przekrojów optycznych na całej długości struktury ziarniastej za pomocą układania w stos Z.

3. Trójwymiarowa hodowla w 2-dołkowych szkiełkach komórkowych do immunoblottingu

  1. Wstępnie schłodzić szkiełko z 2-dołkową komorą na lodzie. Postępuj zgodnie z krokami 2.1-2.4, zwiększając ilość odczynników do szkiełka 2-dołkowego, np. pokryj 160 μl Matrigel i dodaj 1,6 ml mieszanki komórek/Matrigelu do każdego dołka szkiełka 2-dołkowego.
  2. Zbierz struktury groniaste z Matrigelu za pomocą dostępnego na rynku zestawu do pobierania komórek hodowlanych 3D, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Rozcieńczyć do przemywania i zbierania komórek do 1x i wstępnie schłodzić do 4 °C. Mycie i usuwanie Matrigelu powinno odbywać się na lodzie.
  4. Przemyć struktury groniaste 3x za pomocą buforu do przemywania komórek.
  5. Zebrać acini do 15 ml probówek wirówkowych za pomocą buforu do pobierania komórek, a następnie przeprowadzić 30-minutową inkubację na kołysku w temperaturze 4 °C. Dobrze wymieszać zawiesinę za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Spowoduje to rozbicie Matrigelu na małe kawałki i uwolnienie większości komórek w buforze do zbierania komórek.
  6. Granulować komórki w proporcji 200 x g w wirówce hodowlanej. Usuń pływającą warstwę hydrożelu z granulowanych komórek za pomocą końcówki pipety P200.
  7. Ponownie zawiesić lizaty w buforze próbki SDS dostarczonym z zestawem. Można również zastosować bufor do lizy RIPA.

4. Kwantyfikacja złośliwego i łagodnego fenotypu piersi

  1. Hodować komórki w trzech egzemplarzach dla każdego zestawu poddanego zabiegowi, wykonując kroki 2.1-2.4.
  2. Wykonaj obrazy kontrastu fazowego struktur zrazikowych z każdej studzienki w rozdzielczości 5X lub 10X za pomocą mikroskopu kontrastu fazowego podłączonego do przesuwnika i komputera. Rób zdjęcia, przesuwając szkiełko z jednej klatki do drugiej, zakrywając w ten sposób całą studzienkę szkiełka komorowego.
  3. Policz całkowitą liczbę struktur ziarniastych, liczbę pojedynczych okrągłych płaskich acini i liczbę struktur wieloakarnych lub przypadkowo rosnących struktur pozbawionych organizacji i z emanującymi z nich rozgałęzionymi procesami.
  4. Oblicz procent pojedynczych okrągłych płaskich struktur groniastych w porównaniu ze strukturami złośliwymi i wykreśl jako wykres kolumnowy. Oblicz istotność za pomocą testu t-Studenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D hodowla może być skutecznie wykorzystana do odróżnienia złośliwego fenotypu ludzkich komórek nabłonka piersi od łagodnej piersi. Pojedyncze łagodne komórki pokryte Matrigelem rosną jako zorganizowane kuliste struktury, które można łatwo zobrazować jako pojedyncze okrągłe płaskie acini w jednej płaszczyźnie za pomocą obrazowania z kontrastem fazowym. Pojedyncze komórki nowotworowe pokryte Matrigelem rosną przypadkowo, wykazują bardzo wysoki współczynnik załamania światła i są trudne do zobrazowania w jednej płaszczyźni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy tutaj trójwymiarową hodowlę komórek nabłonka piersi na odtworzonej błonie podstawnej oraz przydatność tego systemu do różnicowania złośliwego i łagodnego fenotypu piersi. System ten może być również używany do hodowli różnych typów komórek z innych tkanek gruczołowych i doniesiono, że jest z powodzeniem stosowany do hodowli komórek nabłonka prostaty, nabłonka oskrzeli i komórek nabłonka tarczycy, by wymienić tylko kilka12-14. Znaczenie kultury 3D polega na tym, że jest to model fizjologicznie istotn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty NIH R01 CA107469, R01 CA125577 i U01CA154224 dla C.G. Kleer, University of Michigan's Cancer Center Support.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obniżony czynnik wzrostu MatrigelBD Biosciences354230Unikaj powtórnego zamrażania
Szkiełka szklane Lab-Tek 8-dołkoweThermo Fisher Scientific177402Precool na lodzie 
Szkiełka szklane Lab-Tek 2-dołkowe Thermo Fisher Scientific177380Wstępne chłodzenie na lodzie 
Koza anty mysz F(ab´)2 fragmentJackson Immunoresearch115-006-006
Normalna surowica koziaJackson Immunoresearch005-000-121
Fluorescencyjne sprzężone przeciwciała AlexaSondy molekularneZajrzyj na stronę internetową sond molekularnych
Przedłuż złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu za pomocąsond molekularnychDAPI P36935
Komórka hodowlana 3D Zestaw do zbioruTrevigen3448-020-k
Anty-Apha-6-integrynaFisher Scientific MAB1378Rozcieńczenie 1:100 dla IF
Anti-GM130BD Biosciences610822Rozcieńczenie 1:100 dla IF
Anty-fosfohiston 3 (Ser10)FITC SprzężonyFisher Scientific16-2221:100 rozcieńczenie dla
IF Anty-rozszczepiona kaspaza 3 (Asp 175)Komórka Sygnalizacja9661srozcieńczenie 1:50 dla IF
Anty-E-kadherynaBD Biosciences610181rozcieńczenie 1:200 dla IF

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  3. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-365 (2007).
  4. Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-828 (2010).
  5. Rosen, P. P. Rosen's breast pathology. Rosen, P. , 3rd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia, PA. (2008).
  6. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem. Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  7. Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
  8. Pal, A., Huang, W., Li, X., Toy, K. A., Nikolovska-Coleska, Z., Kleer, C. G. CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1/p38 pathway, acting to suppress metastasis of breast cancer. Cancer Res. 15, 4818-4828 (2012).
  9. Pal, A., Huang, W., Toy, K. A., Kleer, C. G. CCN6 knockdown disrupts acinar organization of breast cells in three-dimensional cultures through up-regulation of type III TGF-β receptor. Neoplasia. 14, 1067-1074 (2012).
  10. Wang, F., et al. Phenotypic reversion or death of cancer cells by altering signaling pathways in three-dimensional contexts. J. Natl. Cancer Inst. 94, 1494-1503 (2002).
  11. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  12. Wang, R., et al. Three-dimensional co-culture models to study prostate cancer growth, progression, and metastasis to bone. Semin. Cancer Biol. 15, 353-364 (2005).
  13. Vaughan, M. B., Ramirez, R. D., Wright, W. E., Minna, J. D., Shay, J. W. A three-dimensional model of differentiation of immortalized human bronchial epithelial cells. Differentiation. 74, 141-148 (2006).
  14. Fata, J. E., Werb, Z., Bissell, M. J. Regulation of mammary gland branching morphogenesis by the extracellular matrix and its remodeling enzymes. Breast Cancer Res. 6, 1-11 (2004).
  15. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8, 1-11 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hodowla tr jwymiarowafenotyp kom rek piersizatapianie w Matrigeluobrazowanie w kontra cie fazowymbarwienie immunofluorescencyjnemikroskopia konfokalnaanaliza struktury acynarnejocena polarno ci kom rekintegralno b ony podstawnej

Powiązane artykuły