Artykuł metodologiczny

Test tworzenia komórek śródbłonka do badania angiogenezy in vitro

61.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51312

⸱

1 września 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, American University, 2Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute, NIH

W tym artykule

Podsumowanie

Test tworzenia probówek jest szybką, mierzalną metodą pomiaru angiogenezy in vitro. Komórki śródbłonka łączy się z kondycjonowanymi pożywkami i plateruje ekstraktem z błony podstawnej. Tworzenie się rurki następuje w ciągu kilku godzin, a nowo utworzone kanaliki można łatwo określić ilościowo.

Streszczenie

Angiogeneza jest procesem niezbędnym do prawidłowego rozwoju tkanek i gojenia się ran, ale jest również związana z różnymi stanami patologicznymi. Korzystając z tego protokołu, angiogenezę można mierzyć in vitro w szybki i wymierny sposób. Pierwotne lub unieśmiertelnione komórki śródbłonka miesza się z kondycjonowanym podłożem i plateruje na macierzy błony podstawnej. Komórki śródbłonka tworzą struktury przypominające naczynia włosowate w odpowiedzi na sygnały angiogenne znajdujące się w kondycjonowanych pożywkach. Tworzenie rurki następuje szybko, a komórki śródbłonka zaczynają się wyrównywać w ciągu 1 godziny, a kanaliki zawierające światło zaczynają pojawiać się w ciągu 2 godzin. Probówki można wizualizować za pomocą mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym lub komórki można leczyć kalceiną AM przed testem, a probówki wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Liczba miejsc/węzłów rozgałęzień, pętli/siatek lub liczba lub długość utworzonych rurek mogą być łatwo określone ilościowo jako miara angiogenezy in vitro. Podsumowując, test ten można wykorzystać do identyfikacji genów i szlaków, które są zaangażowane w promowanie lub hamowanie angiogenezy w szybki, powtarzalny i ilościowy sposób.

Wprowadzenie

Angiogeneza, rozwój nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń, jest niezbędna dla różnych procesów, w tym wzrostu narządów, rozwoju embrionalnego i gojenia się ran1-3. Nowo powstałe naczynia krwionośne, wyściełane komórkami śródbłonka, dostarczają tlen i składniki odżywcze do tkanek, wspomagają nadzór immunologiczny przez komórki krwiotwórcze i usuwają produkty przemiany materii2,4. Angiogeneza ma kluczowe znaczenie podczas rozwoju embrionalnego i płodowego. Jednak proces ten pozostaje uśpiony u osoby dorosłej, z wyjątkiem okresów gojenia się ran, wzrostu szkieletu, ciąży lub cyklu miesiączkowego1-3.

W ciągu ostatnich dwóch dekad zaczęły się wyłaniać kluczowe mechanizmy molekularne regulujące angiogenezę. Angiogeneza jest ściśle regulowanym zdarzeniem, równoważonym przez sygnały pro i antyangiogenne, w tym integryny, chemokiny, angiopoetyny, środki wykrywające tlen, cząsteczki łączące i endogenne inhibitory5. Po wywołaniu sygnałów proangiogennych, takich jak podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF), czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF), płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) i naskórkowy czynnik wzrostu (EGF), aktywują receptory komórek śródbłonka, komórki śródbłonka uwalniają proteazy w celu degradacji błony podstawnej. Komórki śródbłonka następnie namnażają się i migrują, tworząc kiełki w tempie kilku milimetrów dziennie6,7.

Angiogeneza jest związana z różnymi stanami patologicznymi, takimi jak rak, łuszczyca, retinopatia cukrzycowa, zapalenie stawów, astma, choroby autoimmunologiczne, choroby zakaźne i miażdżyca8-10. Ze względu na znaczenie angiogenezy w różnych chorobach, zrozumienie genów i szlaków, które regulują ten proces, ma kluczowe znaczenie dla projektowania lepszych terapii.

Test tworzenia probówek jest szybką i ilościową metodą określania genów lub szlaków zaangażowanych w angiogenezę. Po raz pierwszy opisany w 1988 roku, zasady leżące u podstaw tego testu polegają na tym, że komórki śródbłonka zachowują zdolność do szybkiego podziału i migracji w odpowiedzi na sygnały angiogenne11-13. Co więcej, komórki śródbłonka są indukowane do różnicowania się i tworzenia struktur przypominających rurki, gdy są hodowane na matrycy ekstraktu z błony podstawnej (BME). Rurki te zawierają światło otoczone komórkami śródbłonka połączonymi ze sobą kompleksami połączeniowymi. Tworzenie się rurki następuje szybko, przy czym większość probówek tworzy się w tym teście w ciągu 2-6 godzin, w zależności od ilości i rodzaju bodźców angiogennych.

Do tego testu można użyć kilku typów komórek śródbłonka, w tym zarówno komórek pierwotnych, jak i linii komórek unieśmiertelnionych14,15. Linia komórkowa użyta w tym artykule to mysia 3B-11, ale ta sama metodologia może być zastosowana do innych linii komórek śródbłonka, takich jak SVEC4-10 (mysz) lub pierwotnych komórek śródbłonka, takich jak HUVEC (ludzkie). W zależności od tego, która linia komórkowa jest używana i czy komórki śródbłonka są przekształcone, czy nie, konieczne będzie przeprowadzenie optymalizacji w celu określenia idealnego czasu potrzebnego do prawidłowego uformowania rurki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zbiór kondycjonowanych pożywek do badania potencjału angiogennego

  1. Hoduj pierwotne lub unieśmiertelnione komórki, które mają być testowane pod kątem potencjału angiogennego lub antyangiogennego w pożywce natywnej lub o niskiej surowicy i zbierz kondycjonowane podłoża.
    1. Alternatywnie należy natychmiast użyć kondycjonowanych pożywek lub podtrzymać je i przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Stosować niekondycjonowane pożywki natywne lub o niskiej surowicy jako kontrolę ujemną i używać niekondycjonowanych kompletnych pożywek wzrostowych (10% FBS lub odpowiednie stężenie) jako kontroli pozytywnej. Alternatywnie, aby przetestować potencjalne stymulatory angiogenezy, uzupełnij pożywki pozbawione węgla drzewnego pozbawione czynników wzrostu znanymi stężeniami określonych białek będących przedmiotem zainteresowania i porównaj je z samymi pożywkami wolnymi od czynników wzrostu.

2. Przygotowanie komórek śródbłonka przed testem

  1. Dwa dni przed testem należy przejść komórki 3B-11 do nowej kolby T-75. Ważna jest liczba komórek pasażowych. Ten test działa najlepiej, gdy komórki znajdują się między drugim a szóstym pasażem. Test nie będzie działał dobrze, jeśli komórki śródbłonka zostaną użyte przed drugim lub po dziesiątym pasażu.
  2. Hoduj komórki przez 24 godziny w DMEM uzupełnionym 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  3. Na dzień przed badaniem surowica głodze komórki 3B-11 w następujący sposób:
    1. Odessać pożywkę z komórek 3B-11.
    2. Dodaj zredukowaną pożywkę surowicy DMEM uzupełnioną 0,2% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
    3. Hoduj komórki przez dodatkowe 24 godziny.

3. Przygotowanie odczynników przed testem

UWAGA: Stężenia BME są bardzo zmienne w zależności od partii. BME nie działa dobrze, jeśli stężenie jest mniejsze niż 10 mg/ml, dlatego przed zakupem należy skontaktować się z producentem BME, aby zapewnić nabycie odpowiednio skoncentrowanej partii.

  1. Rozmrażaj zredukowany czynnik wzrostu BME w lodówce. BME krzepnie na ciepło, dlatego przed użyciem należy go przechowywać w niskiej temperaturze. BME może być przechowywany w lodówce przez kilka tygodni lub porcjowany i zamrażany w temperaturze -80 °C.
  2. BME o obniżonym współczynniku wzrostu jest preferowany w stosunku do tradycyjnego BME. Brak czynników angiogennych w BME ułatwi obserwację wpływu czynników z kondycjonowanych pożywek na tworzenie się rurek.
  3. Rozmrozić podłoże do przetestowania.

4. Przygotowanie komórek śródbłonka bezpośrednio przed badaniem

  1. Umyj komórki 3B-11 w DPBS.
    1. Jeśli pożądana jest wizualizacja za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej, przed przemyciem komórek 3B-11 dodaj kalceinę AM do komórek śródbłonka w pożywce w końcowym stężeniu 2 μg/ml. Umieść komórki znakowane kalceiną w ciemności w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed rozpoczęciem testu. Rozpuścić kalceinę podstawową AM w DMSO, a po rozcieńczeniu kalceiny w pożywce końcowe stężenie DMSO nie powinno przekraczać 0,1%. Po 30-45 minutach wypłucz kalceinę AM z komórek (krok 4.1 powyżej) i kontynuuj eksperyment.
  2. Trypsynizować komórki, dodając 1 ml trypsyny-EDTA do kolby T-75.
  3. Po zakończeniu trypsynizacji zneutralizuj trypsynę, ponownie zawieszając komórki do końcowej objętości 10 ml w DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  4. Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 100 μm, aby usunąć grudki.
  5. Policz komórki i ponownie zawieś komórki do końcowego stężenia 7,5 x 106 komórek/ml w DMEM, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.

5. Test tworzenia probówek

  1. Umieść 24-dołkową płytkę i końcówki o pojemności 1 ml w lodówce lub na lodzie na 20-30 minut przed załadowaniem płytki, aby BME nie zastygło przedwcześnie.
  2. Odmierzyć pipetę 250 μl zredukowanego czynnika wzrostu BME do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza, nie wciskając pipety do ostatniego oporu podczas dozowania. Uważaj, aby wystarczająca ilość BME pozostała w środku studni, gdy utworzy się łąkotka; Jeśli matryca jest zbyt cienka, komórki utworzą tylko monowarstwę.
  3. Inkubować 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut w celu zestalenia BME.
  4. Po związaniu BME wymieszaj około 300 μl kondycjonowanej pożywki z 10 μl zawieszonych komórek 3B-11 (około 75 000 komórek).
    1. Dostosuj objętość kondycjonowanej pożywki i liczbę posianych komórek w zależności od użytego typu komórek śródbłonka i przetestuj seryjne rozcieńczenia kondycjonowanej pożywki, aby wykazać aktywność. Porównując komórki hodowane w różnych warunkach, znormalizuj objętość kondycjonowanej pożywki do liczby komórek, które zostały użyte do kondycjonowania pożywki.
  5. Probówki zaczną się formować w ciągu 2-4 godzin. W zależności od stężenia czynnika angiogennego w kondycjonowanym pożywce, tworzenie się piku w probówce może nastąpić między 3 a 12 godzinami, a czas testu będzie musiał zostać zoptymalizowany. W przypadku pracy z pierwotnymi komórkami śródbłonka zamiast komórek unieśmiertelnionych, początkowe tworzenie rurki może być opóźnione o kilka godzin.
    1. Rurki często zaczynają się pogarszać w ciągu 18 godzin, a komórki śródbłonka ulegają apoptozie.
  6. W momencie tworzenia się rurki szczytowej należy ostrożnie zassać media ze studni, aby uniknąć zakłócenia sieci rur w BME.
    1. Umyj każdą studzienkę 1 ml DPBS, a następnie aspiruj.
      1. W celu natychmiastowej wizualizacji dodać 1 ml świeżego DPBS do każdej studzienki i zobrazować sieć probówek za pomocą mikroskopu odwróconego podłączonego do kamery cyfrowej lub mikroskopu fluorescencyjnego/konfokalnego, jeśli komórki były barwione kalceiną AM, jak w 4.1.1.
      2. Aby zamocować sieć probówek do późniejszej wizualizacji, dodaj 4% paraformaldehydu do każdej zasysanej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
        1. Usuń paraformaldehyd, przemyj dwukrotnie DPBS, a następnie dodaj 1 ml świeżego DPBS do każdej studzienki.
        2. Obraz mikroskopowy przed fiksacją, ponieważ podczas tej procedury może pęknąć kilka rurek.

6. Kwantyfikacja sieci rur

  1. Określ ilościowo sieć rur na kilka różnych sposobów, w zależności od preferencji badacza, a kilka programów komputerowych ma możliwość pomiaru następujących parametrów: liczba rurek, liczba pętli/oczek, liczba miejsc rozgałęzień/węzłów, długość rur.
  2. Użyj reprezentatywnego programu komputerowego, takiego jak Image J z wtyczką Angiogenesis Analyzer16 do ilościowego oznaczania sieci lamp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mysie komórki śródbłonka 3B-11 wysiano na zestalone BME o zredukowanej zawartości czynników wzrostu – w tym badaniu wykorzystano produkt Matrigel – a następnie obserwowano je w czasie. Jak pokazano na Rysunku 1, czynniki angiogenne wydzielane przez mysie keratynocyty lub fibroblasty są w stanie indukować tworzenie rurek w czasie. Komórki śródbłonka migrują i zaczynają tworzyć małe odgałęzienia w ciągu 1-2 hr od wysiania. Maksymalne tworzenie rurek osiągnięto po 4-6 hr przy użyciu pożywek kondycjonowanych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Angiogeneza bierze udział zarówno w procesach fizjologicznych, jak i patologicznych. Badanie mechanizmów związanych z angiogenezą wymaga użycia testów, które podsumowują główne etapy angiogenezy. Test tworzenia komórek śródbłonka ma kilka zalet w porównaniu z innymi testami. Jest łatwy w konfiguracji, jest stosunkowo niedrogi, wytwarza kanaliki w ciągu kilku godzin i jest wymierny. Co więcej, można go wykonać na płytkach 24- lub 96-dołkowych, a tym samym może być stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych w cel...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program National Cancer Institute at the National Institutes of Health, oraz przez granty NCI UA5CA152907.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Costar 24-dołkowa płytka poddana kulturze tkankowejCorning3524
BD Matrigel matryca błony podstawnej, obniżony czynnik wzrostuBD Biosciences354230
Gibco 0,05% trypsyna-EDTALife Technologies25300-054
Gibco L-glutamina 200 mM (100x)Life Technologies25030-081
Paciorkowiec Gibco pen paciorkowiecLife Technologie15140-122
Gibco DMEM (1x)Life Technologies11965-092
Gibco DPBS (1x)Life Technologies14190-144
Surowica bydlęca płoduAtlas BiologicalsF-0500-A
Calcein AMLife TechnologiesC3100MP
DMSOATCC4-X

Bibliografia

  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438, 932-936 (1038).
  2. Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473, 298-307 (2011).
  3. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, 873-887 (2011).
  4. Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438, 937-945 (2005).
  5. Bouis, D., Kusumanto, Y., Meijer, C., Mulder, N. H., Hospers, G. A. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological research : the official journal of the Italian Pharmacological Society. 53, 89-103 (2006).
  6. Ausprunk, D. H., Folkman, J. Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvascular research. 14, 53-65 (1977).
  7. Chung, A. S., Lee, J., Ferrara, N. Targeting the tumour vasculature: insights from physiological angiogenesis. Nature reviews. Cancer. 10, 505-514 (2010).
  8. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annual review of cell and developmental biology. 27, 563-584 (2011).
  9. Kerbel, R. S. Tumor angiogenesis. The New England journal of medicine. 358, 2039-2049 (2008).
  10. Folkman, J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications. The New England journal of medicine. 285, 1182-1186 (1056).
  11. Kubota, Y., Kleinman, H. K., Martin, G. R., Lawley, T. J. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures. The Journal of cell biology. 107, 1589-1598 (1988).
  12. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, 267-274 (2009).
  13. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature protocols. 5, 628-635 (2010).
  14. Walter-Yohrling, J., et al. Murine endothelial cell lines as models of tumor endothelial cells. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 10, 2179-2189 (2004).
  15. Connell, K. A., Edidin, M. A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 144-521 (1950).
  16. Carpentier, G. ImageJ contribution: Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Angiogeneza in vitromacierz b ony podstawnejpo ywka warunkowanamikroskopia fluorescencyjnamikroskopia konfokalnabarwienie kalcein AMilo ciowe oznaczanie sieci naczyczynniki angiogenneoptymalizacja pasa owania kom rek

Powiązane artykuły