Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Streszczenie

Teraz dobrze wiadomo, że mikrośrodowisko komórkowe i tkankowe są kluczowymi regulatorami wpływającymi na inicjację i progresję nowotworu. Ponadto wykazano, że macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest krytycznym regulatorem zachowania komórek w hodowli i homeostazy in vivo. Obecne podejście polegające na hodowli komórek na dwuwymiarowych (2D), plastikowych powierzchniach powoduje zakłócenie i utratę złożonych interakcji między komórkami a ich mikrośrodowiskiem. Dzięki zastosowaniu trójwymiarowych (3D) testów hodowli ustala się warunki interakcji komórka-mikrośrodowisko przypominające mikrośrodowisko in vivo. W artykule przedstawiono szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi w matrycy białkowej błony podstawnej 3D, ilustrując potencjał hodowli 3D w ocenie inwazji komórek do otaczającego środowiska. Ponadto omawiamy, w jaki sposób te testy 3D mogą potencjalnie badać utratę cząsteczek sygnałowych, które regulują morfologię nabłonka przez procedury barwienia immunologicznego. Badania te pomagają zidentyfikować ważne szczegóły mechanistyczne w procesach regulujących inwazję, niezbędną do rozprzestrzeniania się raka piersi.

Wprowadzenie

Migracja i inwazja pojedynczych lub zbiorowych komórek to dwie cechy charakterystyczne raka i są niezbędne do przerzutowego rozprzestrzeniania się komórek rakowych^1-4. Zdolność komórek nowotworowych do inicjowania przerzutów zależy od ich zdolności do migracji i inwazji do sąsiedniej tkanki za pomocą inwadopodiów w celu degradacji błony podstawnej komórek. Inwadopodia to dynamiczne, bogate w aktyny wypukłości degradacji macierzy, które umożliwiają degradację macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez uwalnianie proteaz degradujących macierz⁵. Inwazja komórek nowotworowych polega na degradacji macierzy, po której następuje migracja komórek nowotworowych, a towarzyszy temu reorganizacja trójwymiarowego (3D) środowiska macierzy². Tak więc, aby przeniknąć przez macierz, komórka musi przekształcić swój kształt i oddziaływać z macierzą zewnątrzkomórkową (ECM)².

Utrzymanie integralności tkanki piersi zależy od ściśle kontrolowanej architektury tkanki, ponieważ połączenia adhezyjne komórka-ECM i komórka-komórka wpływają na ekspresję genów, a zakłócenie polaryzacji nabłonka może prowadzić do wystąpienia raka^6-10. Jednak większość testów migracji i inwazji in vitro, takich jak testy w komorze transwellowej lub testy zadrapań rany, jest dwuwymiarowa (2D) i dlatego pomijają skomplikowane interakcje między komórkami i ich sąsiednim środowiskiem^3,6,8,11-14. Znaczne różnice morfologiczne i funkcjonalne, w tym różnice w morfologii komórek, różnicowaniu komórek, adhezjach macierzy komórkowej i wzorcach ekspresji genów, zostały wykryte przez hodowlę komórek w kulturach 3D, których powszechnie brakuje w testach 2D^2,6,8,11. W związku z tym zastosowania testów 3D są niezwykle korzystne w rekapitulacji bardziej fizjologicznych warunków in vivo, co prowadzi do lepszego przełożenia przełomowych wyników badań podstawowych na klinikę^6-10. Należy jednak zauważyć, że pomimo wielu zalet uzyskanych dzięki zastosowaniu kultur 3D, model ten nie jest w stanie uchwycić całej złożoności mikrośrodowiska guza in vivo, które obejmuje różne typy komórek. Możliwe jest jednak włączenie komórek zrębu do modeli 3D (na przykład fibroblastów, leukocytów i makrofagów) w celu zbadania wpływu interakcji guz-zręb na adhezję i inwazję komórek rakowych^15-17.

Komórki nabłonka piersi w hodowli rosną najefektywniej, gdy obecne są białka ECM, takie jak laminina i kolagen. Mając to na uwadze, dostępna na rynku mieszanina macierzy została uzyskana z mysiego guza Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) i jest znana jako macierz błony podstawnej Matrigel^2,8. Ustalono szereg technik hodowli komórek nabłonkowych jako kolonii 3D w macierzy błony podstawnej^2,8. Model macierzy błony podstawnej 3D jest skuteczny w ustalaniu zarówno złośliwego, jak i niezłośliwego wzrostu komórek piersi, przypominając to, co dzieje się w środowisku in vivo ^18,19. Komórki MCF10A to niezłośliwe komórki nabłonka sutka. Hodowane w macierzy błony podstawnej komórki te wykazują in vivo cechy normalnych komórek piersi i podlegają kontrolowanej proliferacji komórek, polaryzacji komórek i apoptozie w celu ustalenia przestrzeni światła^8,12,20. Co więcej, wygląd jąder komórkowych komórek MCF10A tworzących acini w hodowlach 3D bardziej przypomina wygląd komórek nabłonka sutka w tkance niż tych hodowanych w monowarstwie²¹. Badania Bissella i współpracowników były pierwszymi, które ujawniły, że złośliwe komórki piersi można odróżnić od niezłośliwych komórek piersi, gdy są hodowane w otoczeniu bogatym w lamininę, ponieważ komórki nowotworowe wykazują wysoce zdezorganizowany fenotyp, zwiększoną proliferację, zmniejszoną adhezję komórkową, zwiększoną ekspresję markerów mezenchymalnych i wzrost liczby utworzonych struktur inwazyjnych^3,6,22.

Nieprawidłowości środowiska komórkowego mogą wpływać na powstawanie nowotworów²⁰. Metoda hodowli 3D może być wykorzystana do skutecznego badania komunikacji zachodzącej między komórkami nowotworowymi a otaczającym je środowiskiem oraz określenia, w jaki sposób ekspresja białek wpływa na taką komunikację^14,20,21,23. W artykule przedstawiono szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi MDA-MB-231 w kulturach 3D w celu analizy inwazyjności oraz badania utraty morfologii nabłonka przy użyciu markera nabłonkowego lamininy, składnika błony podstawnej komórki^18,19,24,25. Szczegółowe procedury zapewniają możliwość dokładnego i powtarzalnego ilościowego określenia tworzenia struktury gwiaździstej (inwazyjnej) przez dowolną inwazyjną komórkę nowotworową i nie ograniczają się do powszechnych linii komórkowych raka piersi (takich jak MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7 lub T47D). W związku z tym test ten może służyć jako platforma do oceny, w jaki sposób ekspresja białek w komórkach lub leczenie związkami pro- lub przeciwinwazyjnymi regulują degradację macierzy zewnątrzkomórkowej przez jedną lub wiele komórek.

Protokół

1. Trójwymiarowa hodowla komórek raka piersi w macierzy błony podstawnej (technika osadzania)

1. Postępowanie z matrycą membrany podstawnej Matrigel: Rozmrozić na lodzie przez noc w temperaturze 4 °C. Matryca membrany podstawnej jest płynna w niskiej temperaturze, ale krzepnie w temperaturze pokojowej. Utrzymuj matrycę błony podstawnej na lodzie (rysunki 1A-B).
2. Przykryj naczynie ze szklanym dnem konfokalnym nr 1 50 μl matrycy membrany podstawnej, rozprowadzając matrycę za pomocą końcówki Pipetmana P-200 w spiralny wzór (rysunek 1C). Zachowaj ostrożność podczas rozprowadzania matrycy membrany podstawnej, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Podobnie, unikaj rozprowadzania matrycy tak blisko granic naczynia ze szklanym dnem, aby zapobiec tworzeniu się menisku. Jeśli nie masz doświadczenia w obchodzeniu się z matrycą membrany podstawnej, a następnie wstępnie schłodził naczynie, P-200 Pipetman i pipety mogą znajdować się na lodzie (alternatywnie pozostawić na noc w lodówce w temperaturze 4 °C). Ten etap daje dodatkowy czas na rozprowadzenie matrycy błony podstawnej przed zestaleniem. Umieścić szalkę (naczynia) w inkubatorze do hodowli komórkowych (w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 )} na co najmniej 30 minut, aby umożliwić zestalenie się matrycy błony podstawnej (rysunek 1D).
3. Podczas krzepnięcia matrycy trypsynizuj 70-80% zlewającą się 100-milimetrową płytkę komórek. Gdy komórki zaczną odrywać się od płytki, zawieś je ponownie w 10 ml pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby dezaktywować trypsynę (ryc. 1E). Następnie przenieś zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (ryc. 1F).
4. Wirować komórki (znajdujące się w stożkowej probówce) w proporcji 100 x g przez 3 minuty w dedykowanej wirówce do hodowli komórkowych (ryc. 1G-H).
5. Podczas wirowania komórek należy wsypać 50 μl matrycy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1 ml (uwaga: każde naczynie ze szklanym dnem ma przypisaną jedną probówkę do mikrowirówki; stąd, jeśli eksperyment wymaga 3 szalek, to wynika z tego, że potrzebne są również 3 probówki do mikrowirówek), a następnie umieścić probówkę na lodzie (ryc. 1B).
6. Odessać pożywkę z rurki stożkowej z kroku 1.4, pozostawiając osad w spokoju (Rysunek 1I). Ponownie zawiesić komórki (które zostały odwirowane) w 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej FBS (ryc. 1J).
7. Po zliczeniu komórek za pomocą hemocytometru (rysunek 1K) lub licznika cząstek komórkowych podwielokrotność^2,5 x 10 4 komórki do probówki mikrowirówkowej i uzupełnić ją za pomocą odpowiednich pożywek, tak aby uzyskać całkowitą objętość 50 μl (rysunek 1L).
8. Wymieszaj komórki z kroku 1.7 (25 000 komórek w 50 μl) z probówką mikrowirówkową zawierającą matrycę z kroku 1.5 w stosunku 1:1; końcowa objętość wyniesie 100 μl (ryc. 1M).
9. Delikatnie nałożyć 100 μl mieszaniny matryca-komórka z kroku 1.8 na zestaloną miskę pokrytą matrycą błony podstawnej z kroku 1.2 (rysunek 1N). Pozwala to na osadzenie komórek w macierzy błony podstawnej.
10. Przenieść szalkę (naczynia) do inkubatora do hodowli komórkowych (w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ ) i pozostawić mieszaninę matryca:komórka do zestalenia się przez co najmniej 30 minut.
11. Po zestaleniu się mieszaniny matryca-komórka dodaj 2 ml pożywki RPMI uzupełnionej FBS do naczynia (ryc. 1O) i zabierz naczynie z powrotem do inkubatora, gdzie będzie przechowywane do końca eksperymentu (ryc. 1P).
12. Zmieniaj pożywkę codziennie przez okres 5 dni (lub zgodnie z wymaganiami testu; czas trwania testu dla komórek MDA-MB-231 wynosi 5 dni).
13. Za pomocą mikroskopu świetlnego wykonaj obrazy kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) kolonii MDA-MB-231 zawieszonych w matrycy błony podstawnej (ryc. 3A). Zobrazuj 20 reprezentatywnych obszarów przy obiektywie 10X raz dziennie przez pięć dni, aby określić morfogenezę kolonii (ryc. 3C).
14. Analizuj obrazy na ślepo, aby określić tworzenie się gwiaździstych kolonii komórek (ryc. 3B). Kolonię uważa się za gwiaździstą, jeśli dostrzeżona zostanie jedna lub więcej wypustek ze sferoidy komórek. Aby określić procent inwazyjnych kolonii gwiaździstych, podziel liczbę kolonii gwiaździstych przez całkowitą liczbę kolonii komórek na uzyskany obraz, a następnie uśrednij procent kolonii gwiaździstych z 20 obrazów dla każdego dnia.

Rysunek 1. Trójwymiarowa hodowla komórek raka piersi MDA-MB-231 w macierzy błony podstawnej (technika osadzania). A-B) Schemat układu doświadczalnego (wykonanego w dygestorium). C) Studzienka naczynia ze szklanym dnem pokryta 50 μl macierzystej matrycy membranowej. D) Szalkę (naczynia) umieszczoną w inkubatorze do hodowli komórkowych (w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 )} w celu umożliwienia zestalenia się matrycy przez co najmniej 30 minut. E) Komórki poddano trypsynizacji. F) Komórki zawieszono ponownie w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. G-H) Komórki (znajdujące się w stożkowej probówce) odwirowywano w tempie 100 x g przez 3 minuty w wirówce do hodowli tkankowych. I) Osad komórkowy. J) Komórki (które zostały odwirowane) zawieszono ponownie w 1 ml pożywki RPMI uzupełnionej FBS. K) Komórki policzono za pomocą hemocytometru. L) 2,5 x 10⁴ komórki przetaczane do probówki mikrowirówki i uzupełniane odpowiednimi pożywkami w celu uzyskania całkowitej objętości 50 μl. M) Wymieszać komórki z etapu 1.7 (25 000 komórek w 50 μl) z probówką mikrowirówkową zawierającą matrycę z kroku 1.5 w stosunku 1:1; Ostateczna objętość wyniesie 100 μl. N) Delikatnie rozłożyć 100 μl mieszaniny komórek matrycy z etapu 8 na zestaloną płytkę pokrytą matrycą od kroku 1.2. O) Po zestaleniu się mieszaniny matryca-komórka dodaj do naczynia 2 ml pożywki RPMI uzupełnionej FBS. P) Umieść naczynie w inkubatorze, gdzie będzie przechowywane do końca eksperymentu.

2. Badanie cech morfogenicznych kultur 3D z immunofluorescencją

1. Ustawić tackę na lód, zimny roztwór buforowany fosforanem (PBS), 20% aceton: 80% metanol (roztwór utrwalający) i 3% albuminę surowicy bydlęcej (BSA; roztwór blokujący) przed wyjęciem szalki (naczyń) z inkubatora.
2. Umieść naczynie (naczynia) na tacce na lód i odessaj pożywkę, a następnie umyj 3x 2 ml zimnego PBS (Rysunek 2B).
3. Po odessaniu ostatniego płukania PBS dodać 2 ml 20% roztworu acetonu: 80% metanolu do naczynia (ryc.) (ryc. 2C), aby utrwalić komórki na 20 minut w temperaturze 4 °C (na lodzie lub w lodówce) (rysunek 2D).
4. Po zakończeniu 20-minutowej fiksacji przynieś naczynia z powrotem do temperatury pokojowej, odessaj utrwalacz, a następnie umyj 3x PBS. Po odessaniu końcowego płukania PBS dodaj 2 ml 3% BSA do naczynia (naczyń), aby blokować przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej (rysunek 2E).
5. W okresie blokady przygotować rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych (laminina V 1:100) i drugorzędowych (w odpowiednim rozcieńczeniu) rozpuszczonych w 3% buforze blokującym albuminę surowicy bydlęcej (BSA). Należy pamiętać, że 400-500 μl roztworu "BSA + przeciwciało pierwszorzędowe" należy dodać bezpośrednio do mieszaniny matryca: komórka.
6. Po upływie 30 minut blokowania dodać przeciwciała pierwszorzędowe i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej (ryc. 2F). Należy pamiętać, że po upływie 30-minutowego okresu blokady nie należy wykonywać żadnych myć PBS.
7. Po wykonaniu kroku 2.6 usunąć roztwór "BSA + przeciwciało pierwszorzędowe" i przemyć 3x PBS.
8. Dodać przeciwciało drugorzędowe rozpuszczone w 3% BSA (w odpowiednim rozcieńczeniu) bezpośrednio na matrycę: mieszaninę komórek, przykryć szalki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (ryc. 2G).
9. Usunąć roztwór "BSA + przeciwciało drugorzędowe" i przemyć 3x PBS.
10. Dodać 2 ml Hoechst 33258 (1:10 000) rozpuszczonego w PBS do barwienia jąder i inkubować przez 5 minut pod folią aluminiową (lub przykryć nieprzezroczystym pojemnikiem, aby ograniczyć fotowybielanie) (Rysunek 2H).
11. Po upływie 5 minut inkubacji z Hoechst 33258t, umyć naczynia 5x PBS.
12. Dodać pożywkę montażową bezpośrednio na mieszaninę matryca: komórki w naczyniu konfokalnym i ostrożnie przykryć szklanym szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec zakłóceniom integralności kolonii w mieszaninie matrycy błony podstawnej: komórki (ryc. 2I).
13. Pozostaw naczynie (naczynia) do wyschnięcia przez noc (lub 24 godziny) w temperaturze pokojowej (Rysunek 2I). Po wyschnięciu naczynie (naczynia) można przechowywać w temperaturze -20 °C, ale zdecydowanie zaleca się ich jak najszybsze zobrazowanie.
14. Uzyskanie obrazów za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednimi długościami fal laserowych zastosowanych przeciwciał (ryc. 3D-E).

Rysunek 2. Badanie kultur 3D metodą immunofluorescencji. A) Schemat konfiguracji eksperymentalnej. B) Naczynia umieszczone na tacce na lód i zasysane z podłoża; następnie komórki przemyto trzykrotnie 2 ml zimnego PBS. C) 2 ml 20% acetonu: 80% roztwór metanolu dodany do naczynia (naczyń). D) Utrwalić komórki na 20 minut w temperaturze 4 °C (na lodzie lub w lodówce). E) 2 ml 3% BSA dodać do naczynia (naczyń) w celu zablokowania na co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. F) Po upływie 30 minut blokowania dodać przeciwciała pierwszorzędowe i inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej. G) Przeciwciała drugorzędowe rozpuszczone w 3% BSA (w odpowiednim rozcieńczeniu) dodano bezpośrednio do mieszaniny macierz błony podstawnej: komórka; Następnie naczynia przykryte i inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. H) 2 ml Hoechst (1:10 000; rozpuszczony w PBS) dodane do błony (pęcherzy) i komórek inkubowanych przez 5 minut pod folią aluminiową. I) Pożywka montażowa dodana bezpośrednio na matrycę: mieszanina komórek w naczyniu konfokalnym i naczynie pokryte jest szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Naczynia pozostawić do wyschnięcia na noc (lub 24 godziny) w temperaturze pokojowej.

Wyniki

Przykład komórek MDA-MB-231 atakujących matrycę 3D jest zilustrowany na rysunku 3C. Komórki są osadzone w macierzy (dzień 1) i zaczynają tworzyć struktury inwazyjne (gwiaździste) do 3 dnia i całkowicie atakują w macierz do dnia 5 (figura 3C). Liczba utworzonych kolonii gwiaździstych jest liczona i wyrażana jako procent całkowitej liczby kolonii na talerzu (inwazyjne i nieinwazyjne). Dodatkowo, ponieważ pomiary są wykonywane codziennie przez pięć dni, można również ocenić szybkość inwazji...

Dyskusja

Rozwój technik hodowli komórkowych 3D pozwolił naukowcom zbadać transformację komórek nabłonka piersi, co pozwoliło nam zobrazować dramatyczne zmiany morfologiczne. Oprócz analizy inwazji komórek, jedno- lub wielokomórkowe sferoidy nabłonka sutka można wykorzystać do oceny zmian w adhezji komórkowej, proliferacji, wielkości i polarności podstawno-wierzchołkowej. W przeciwieństwie do wcześniej zgłoszonych metodologii, w których komórki są nakładane na ECM⁸, nasza metoda osadza komórki w ECM^18,19,24, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki 1,5 ml	VWR	CA10011-700	Sterylne, jednorazowe
naczynie hodowlane 100 mm BD353003	VWR	CABD353003	Sterylne, jednorazowe
15 ml Probówka Falcon	VWR	CA21008-918	Sterylne,
jednorazowe końcówki z filtrem 1 ml	VWR	10011-350	Sterylne, jednorazowe
200 μ l końcówki z filtrem	VWR	22234-016	Sterylne, jednorazowe
20 μ l końcówki z filtrem	VWR	22234-008	Sterylne, jednorazowe
35-milimetrowe naczynia do hodowli konfokalnych nr 1 ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Wstępnie schłodzony przed użyciem
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	BioShop	ALB003.100	Stosowany w stężeniu 3% dla IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Przeciwciało, wysoce adsorbowane	krzyżowo Life Technologies	A11029	1:250 dla IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Anti-Rabbit Life Technologies	A11011	1:1,200 dla
IF Anti-Beta-Catenin	Laboratoria Transdukcji BD	610153	Mysz monoklonalna; Stosowany w 1:100 dla IF
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma	F1051	Stosowany w 10% (v/v)
Hoechst 33258, Pentahydrat (bis-benzimid) - 10 mg⁄ ml Roztwór w Water	Life Technologies	H3569	Stosowany w stężeniu 0,1% (rozcieńczenie 1:10 000)
Zestaw analizatorów InVivo	Cybernetyka		stosowana do obrazowania kultur 3D (obrazy DIC przy 10x i 40x)
Kisspeptin-10 (KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	stosowana przy 100 nM
Anty-Laminina	Cedarlane	AB19012(CH)	Królik poliklonalny człowieka o pełnej długości; Używany w skali 1:100 do
laserowego mikroskopu skaningowego IF LSM-510 META	Zeiss		Używany w obiektywie 63X; soczewki olejowe
Matrigel bez czerwieni fenolowej (BD356237)	VWR	CACB356237	Nr działki 2180819; Mikroskop Olympus IX-81 10,4 mg/ml
	Olympus		Używany do obrazowania hodowli 3D (obrazy DIC przy 10-krotnym i 40-krotnym
Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Antybiotyk (dodawany do pożywki; stosowany w stężeniu 0,01%)Pipeta
10 ml	VWR	CA53300-523	Sterylny, jednorazowy
RPMI 1640 Podłoże z glutaminą	Life Technologies	11875-119	Używane do hodowli komórek
MDA-MB-2310,25% Trypsyna-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200-072	Służy do trypsynizacji komórek MDA-MB-231
MEGM (zestaw pocisków): MEBM (CC3151) + pojedyncze cytaty (CC4136)	Lonza	CC-3150	Służy do hodowli komórek MCF10A