Wychwytywanie glikopeptydu w proteomice powierzchni komórki

Summary

Białka powierzchniowe komórek są biologicznie ważne i szeroko glikozylowane. Przedstawiamy tutaj podejście do wychwytywania glikopeptydów w celu rozpuszczania, wzbogacania i deglikozylowania tych białek w celu łatwego analizowania proteomicznego opartego na LC-MS.

Abstract

Białka powierzchniowe komórek, w tym białka macierzy zewnątrzkomórkowej, uczestniczą we wszystkich głównych procesach i funkcjach komórkowych, takich jak wzrost, różnicowanie i proliferacja. Kompleksowa charakterystyka tych białek dostarcza bogatych informacji do odkrywania biomarkerów, identyfikacji typu komórki i wyboru celu leku, a także pomaga pogłębić naszą wiedzę na temat biologii i fizjologii komórek. Białka powierzchniowe stanowią jednak poważne wyzwanie analityczne ze względu na ich z natury niską liczebność, wysoką hydrofobowość i silne modyfikacje potranslacyjne. Wykorzystując dominującą glikozylację białek powierzchniowych, wprowadzamy tutaj wysokoprzepustowe podejście do wychwytywania glikopeptydów, które integruje zalety kilku istniejących środków N-glikoproteomicznych. Nasza metoda może wzbogacić glikopeptydy pochodzące z białek powierzchniowych i usunąć ich glikany w celu ułatwienia proteomiki za pomocą LC-MS. Rozwiązany N-glikoproteom zawiera informacje o tożsamości i ilości białek, a także o miejscach ich glikozylacji. Metoda ta została zastosowana w serii badań w obszarach takich jak rak, komórki macierzyste i toksyczność leków. Ograniczenie metody polega na niskiej obfitości białek błony powierzchniowej, tak że do tej analizy wymagana jest stosunkowo duża ilość próbek w porównaniu z badaniami skoncentrowanymi na białkach cytozolowych.

Introduction

Białka powierzchniowe komórki oddziałują ze środowiskiem zewnątrzkomórkowym i przekazują sygnały z zewnątrz do wnętrza komórki. Tak więc białka te, w tym białka macierzy zewnątrzkomórkowej, odgrywają kluczową rolę we wszystkich aspektach biologii i fizjologii komórkowej, począwszy od proliferacji, wzrostu, migracji, różnicowania po starzenie się i tak dalej. Białka powierzchniowe funkcjonują poprzez interakcję z innymi komórkami, białkami i małymi cząsteczkami^1-3. Charakterystyka molekularna białek na powierzchni komórki jest bardzo interesująca nie tylko dla biologów, ale także dla firm farmaceutycznych, ponieważ ponad 60% leków jest ukierunkowanych na białka na powierzchni komórki⁴.

Tandemowa spektrometria mas (MS), ze swoją doskonałą czułością, dokładnością i przepustowością do identyfikacji białek i peptydów, stała się potężnym narzędziem do globalnych badań proteomicznych^5,6. Jednak białka powierzchniowe stanowią poważne wyzwanie dla proteomiki opartej na stwardnieniu rozsianym, ponieważ większość białek powierzchniowych występuje w małych ilościach i z silnymi modyfikacjami. Regiony obejmujące błonę białek powierzchniowych sprawiają, że są one hydrofobowe; Dotyczy to zwłaszcza wieloprzebiegowych białek transbłonowych. W związku z tym trudno jest rozpuścić białka błonowe w roztworach wodnych bez pomocy detergentu; jednakże stosowanie detergentów na ogół hamuje działanie HPLC i MS^1,7,8 w identyfikacji białek. W związku z tym białka błonowe zostały słabo scharakteryzowane w bezpośredniej proteomice opartej na LC-MS.

Glikozylacja jest jedną z najważniejszych i najliczniejszych modyfikacji potranslacyjnych zachodzących w białkach powierzchniowych komórek⁹. Ogromna złożoność i niejednorodność glikanów utrudnia peptydom sygnał MS¹⁰. Niemniej jednak kilka metod proteomicznych wykorzystało tę unikalną modyfikację do wzbogacenia białek powierzchniowych i usunięcia ugrupowań cukrowych z białek przed analizą LC-MS. Metody te obejmują wychwyt powinowactwa na podstawie lektyny¹¹ oraz wychwyt chemiczny na bazie hydrazydów lub kwasu borowego¹², a także rozdzielanie metodą chromatografii hydrofilowej^8,13. Usunięcie glikanów przekształca białka błonowe w zwykłe białka i drastycznie upraszcza charakterystykę MS. Ponieważ glikozylacja zachodzi również w wydzielanych białkach, które mają wysoką rozpuszczalność w przeciwieństwie do białek błonowych, wiele metod glikoproteomicznych jest zoptymalizowanych pod kątem białek rozpuszczalnych i ma tendencję do niższej selektywności i wrażliwości glikopeptydów, gdy są stosowane do białek błonowych^8,14. Istnieją również inne metody wzbogacania, w szczególności, białek powierzchniowych komórek, takie jak metody wykorzystujące ultrawirowanie¹⁵ i strategie znakowania¹⁶. Szczegółowe porównanie naszej metody z innymi istniejącymi metodami charakteryzowania białek błonowych zostało przeprowadzone niedawno¹⁷, a wyniki wskazały, że nasza metoda może działać równie dobrze, jeśli nie lepiej, niż wszystkie porównywane metody proteomiki błonowej, ale z większą prostotą.

Aby pomóc badaczom w korzystaniu z tej metody, szczegółowo opisujemy tutaj ogólny protokół. Metoda ta łączy w sobie kilka zalet istniejących strategii glikoproteomicznych i została opracowana specjalnie dla glikoprotein błonowych, ale metoda działa równie dobrze w przypadku wydzielanych białek. Cechy charakterystyczne tej metody obejmują: 1) całkowitą rozpuszczalność białek błonowych, 2) wzbogacenie glikopeptydów zamiast glikoprotein w celu wyeliminowania potencjalnej przeszkody sterycznej przy użyciu stałego substratu wychwytującego, 3) zastosowanie chemii hydrazydów do tworzenia wiązań kowalencyjnych między glikopeptydami a substratem wychwytującym, tak aby związane glikopeptydy mogły tolerować rygorystyczne płukanie w celu uzyskania wysokiej glikoselektywności, oraz 4) możliwość przeprowadzenia całej procedury wychwytywania w jednej probówce w celu zmniejszenia utraty próbki i skrócenia czasu trwania procedury. Po zastosowaniu tej metody do badania różnych próbek biologicznych, w tym komórek i tkanek, zaobserwowaliśmy wysoką selektywność (> 90%) w stosunku do glikoprotein^8,17,18.

Protocol

1. Membrany żniwne

1. Dodać hipotoniczny bufor (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, pH 8,0) z koktajlem inhibitorów proteazy na osad komórkowy (~10⁸ komórek) i inkubować przez 15-30 minut na lodzie. Poddać komórki lizie, przepuszczając próbkę przez igły strzykawki (5-10 przejść) lub homogenizując próbkę za pomocą homogenizatora Dounce (15-30 uderzeń). Użyj hemocytometru i barwienia na niebiesko trypanem, aby sprawdzić skuteczność lizy.
2. Otrzymać frakcję mikrosomalną przez różnicowe odwirowanie lizatu w czasie 3 000 g x 15 min, a następnie po 100 000 g x 2 h. W pierwszym wirowaniu uzyskuje się osad, który jest frakcją jądrową, a późniejsze odwirowanie supernatantu generuje drugi osad, który jest frakcją mikrosomalną, która zawiera błonę plazmatyczną, a także organelle związane z błoną⁸. Ostatnim supernatantem jest frakcja cytozolowa. Frakcje mikrosomalne należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C do dalszej analizy, jak wskazano poniżej.

2. Rozpuszczanie, denaturacja i trawienie białek błonowych

1. Rozpuścić frakcję mikrosomalną w buforze denaturacyjnym (40 mM Tris, 10 mM EDTA, 10 mM TCEP, 0,5% Rapigest, pH 8), a następnie inkubować roztwór w temperaturze 100 °C przez 10 minut.
2. Schłodzić podgrzany roztwór do temperatury pokojowej, dodać do roztworu proszek mocznikowy o bardzo wysokiej czystości do końcowego stężenia 8 M i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
3. Dodać roztwór podstawowy jodoacetamidu do próbki do końcowego stężenia 15 mM i inkubować roztwór w ciemności przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu alkilowania wolnych tioli w próbce. Dodać roztwór podstawowy DTT do próbki do końcowego stężenia 10 mM i inkubować roztwór przez kolejne 10 minut w temperaturze pokojowej w celu stłumienia nadmiaru jodoacetamidu.
4. Otrzymany roztwór rozcieńczyć 10x 40 mM buforem Tris o pH 8, a następnie dodać trypsynę do próbki w stosunku 1:20 trypsyny do białka całkowitego. Utrzymuj reakcję trawienia w piecu o temperaturze 37 °C przez noc, aby upewnić się, że reakcja została zakończona.
5. Zakończyć trawienie, zakwaszając roztwór próbki do pH 1 za pomocą HCl, co jest stanem, który również rozkłada detergent, tj. Rapigest. Rozkładać Rapigest w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i usuwać powstałe osady przez odwirowanie.
6. Oczyścić supernatant zawierający peptydy próbki za pomocą wkładu do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) C-18 i wysuszyć otrzymaną próbkę za pomocą speedvac.
7. Wykonaj analizę SDS-PAGE próbek przed i po trawieniu trypsyny, aby potwierdzić skuteczność trawienia.

3. Wychwyt glikopeptydu

1. Rozpuścić oczyszczone peptydy w buforze sprzęgającym (100 mM octan sodu, pH 5,5). Dodaj periodynian sodu do roztworu peptydu o końcowym stężeniu 10 mM przez 30 minut w ciemności, w temperaturze pokojowej. Spowoduje to utlenienie grup cis-diolowych w glikanach do aldehydów, które pozwolą glikanom połączyć się z żywicą poprzez chemię hydrazydów. Nadmiar periodatu należy stłumić siarczynem sodu o końcowym stężeniu 20 mM i pH 5 przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Wprowadzić żywicę derywatyzowaną hydrazydem do roztworu peptydu w stosunku 1:4 (żywica do roztworu), aby połączyć glikopeptydy z żywicą. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 1-2 dni z rotacją od końca do końca w celu całkowitego sprzężenia.
3. Usunąć niezwiązane peptydy, przemywając żywicę dwukrotnie 1 ml każdego z poniższych: wody demineralizowanej, 1,5 M NaCl, metanolu i 80% acetonitrylu. Na koniec przemyj żywicę 3x 1 ml 100 mM NH₄HCO₃ o pH 8, aby wymienić bufor systemu na 100 mM NH₄HCO₃.
   1. Zebrać supernatant i popłuczyny do analizy niezwiązanych peptydów (fakultatywnie).
4. Uwolnić N-glikopeptydy z żywicy za pomocą PNGazy F w inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C z rotacją od końca do końca. Zbierz uwolnione peptydy przez odwirowanie i przepłukanie 80% acetonitrylem. Wysuszyć otrzymany roztwór w speedvac do analizy LC-MS.

4. Dalsza frakcjonowanie (opcjonalnie)

Aby jeszcze bardziej uprościć złożoność próbki, należy frakcjonować otrzymane N-glikopeptydy. Na przykład ponownie rozpuść wysuszone peptydy w 10 mM mrówczanu amoniaku, pH 3 z 20% acetonitrylem i użyj chromatografii silnej kationowymienności (SCX) do frakcjonowania peptydów. Otrzymany eluent wysuszyć, a następnie przeanalizować otrzymane frakcje peptydowe za pomocą LC-MS^8,17,18 z odwróconą fazą.

5. Czyszczenie uwolnionych N-glikopeptydów (opcjonalnie)

Jeśli pojawią się obawy co do potencjalnego zanieczyszczenia peptydów, ponownie rozpuść wysuszone peptydy w 0,1% kwasie mrówkowym i użyj kolumny MCX SPE do dalszego oczyszczenia peptydów przed analizą LC-MS w odwrotnej fazie.

Uwaga: Parametry przeszukiwania bazy danych.

Podczas selektywnego oddzielania N-glikopeptydów od żywicy, PNGaza F przekształca asparaginę połączoną z N-glikanem w kwas asparaginowy. W związku z tym następuje przesunięcie masy uwolnionych N-glikopeptydów o 0,9840 Da. Aby dokładnie zidentyfikować te peptydy, modyfikacja ta musi zostać dodana do parametrów wyszukiwania wraz z powszechnymi modyfikacjami, takimi jak karbamidomemetylacja cysteiny i utlenianie metioniny.

Results

Reprezentatywny schemat procedury eksperymentalnej jest podsumowany na rysunku 1. Etykietowanie i dalsze etapy frakcjonowania są opcjonalne, a szczegółowe informacje opisano w niedawnej publikacji¹⁸. Inną opcją jest analiza niezmodyfikowanych peptydów, które nie reagują z żywicą. Zalety analizy niezmodyfikowanych peptydów obejmują potencjalną identyfikację nieglikozylowanych peptydów i białek, takich jak klaudyny w ścisłych połączeniach; Dodatkowym atutem jest dokładniejsza ocena ilościowa. Op...

Discussion

W tym miejscu przedstawiamy strategię wychwytywania glikopeptydu do profilowania białek na powierzchni komórki. Metoda może być stosowana do badania wydzielanych białek, takich jak te znajdujące się we krwi, a także w innych płynach ustrojowych lub w pożywkach do hodowli komórkowych.

Powodzenie metody zależy od całkowitego roztrawienia próbek; w związku z tym konieczna jest charakterystyka wydajności mineralizacji za pomocą SDS-PAGE, szczególnie w przypadku pierwszej analizy próbki. Całkowite ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DTT	Sigma	646563
TCEP	Sigma 646547
Jodoacetamid	Sigma	A3221
Rapigest SF	Waters	186001860
Periodate sodu	Sigma	311448
PNGase F	New England Biolabs	P0704S
Affi-Gel Żel hydrazydowy Hz	Bio-Rad	153-6047
Trypsyna	Worthington Biomedical	LS02115
Sep-Pak C-18 wkład	Waters	WAT054955
Oasis MCX	Woda	186000252
Koktajl inhibitora proteazy	Sigma	P8340
Mocznik	Amersco	568
Siarczyn sodu	Caledon	8360-1
Invertaza	Sigma	I0408
α-1 trypsyna	Sigma	F2006
Rybonaza B	Sigma	R7884
Avidin	Sigma	A9275
Albumina jaja kurzego	Sigma	A5503
Conalbumina	Sigma	C0755