Artykuł metodologiczny

Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem: nowe podejście do mapowania i kwantyfikacji nanocząstek w tkance narządowej

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51353

⸱

18 czerwca 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ILM-FENNEC UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1, 2ILM-PUBLI UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1, 3ILM-SOPRANO UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1

W tym artykule

Podsumowanie

Laserowa spektroskopia rozpadu przeprowadzona na cienkich narządach i tkankach nowotworowych skutecznie wykryła naturalne pierwiastki i sztucznie wstrzyknięty gadolin (Gd), emitowany z nanocząstek opartych na Gd. Obrazy pierwiastków chemicznych osiągnęły rozdzielczość 100 μm i czułość ilościową poniżej mM. Kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej.

Streszczenie

Spektroskopia emisyjna plazmy indukowanej laserem została zastosowana do analizy pierwiastkowej próbek biologicznych. Spektroskopia rozpadu indukowanego laserem (LIBS) wykonywana na cienkich skrawkach tkanek gryzoni: nerek i guza, pozwala na wykrycie pierwiastków nieorganicznych, takich jak (i) Na, Ca, Cu, Mg, P i Fe, naturalnie występujących w organizmie oraz (ii) Si i Gd, wykrywanych po wstrzyknięciu nanocząstek na bazie gadolinu. Zwierzęta zostały poddane eutanazji od 1 do 24 godzin po dożylnym wstrzyknięciu cząstek. Dwuwymiarowy skan próbki, wykonany przy użyciu zmotoryzowanego mikrometrycznego stolika 3D, pozwolił wiązce lasera na podczerwień badać powierzchnię z rozdzielczością boczną mniejszą niż 100 μm. Ilościowe obrazy chemiczne pierwiastka Gd wewnątrz narządu uzyskano z czułością sub-mM. LIBS oferuje prostą i solidną metodę badania rozkładu materiałów nieorganicznych bez specjalnego etykietowania. Co więcej, kompatybilność zestawu ze standardową mikroskopią optyczną podkreśla jego potencjał do dostarczania wielu obrazów tej samej tkanki biologicznej z różnymi typami odpowiedzi: elementarną, molekularną lub komórkową.

Wprowadzenie

Szeroki rozwój nanocząsteczek do zastosowań biologicznych skłonił do równoległego doskonalenia technik analitycznych do ich kwantyfikacji i obrazowania w próbkach biologicznych. Zwykle wykrywanie i mapowanie nanocząstek w narządach odbywa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Niestety, metody te wymagają znakowania nanocząstek barwnikiem bliskiej podczerwieni, który może modyfikować biodystrybucję nanocząstek, szczególnie w przypadku bardzo małych nanocząstek ze względu na ich właściwości hydrofobowe. Wykrywanie znakowanych nanocząstek, a zwłaszcza bardzo małych nanocząstek (wielkość < 10 nm), może zatem zakłócać ich biodystrybucję w skali całego ciała, ale także na poziomie tkanek i komórek. Opracowanie nowych urządzeń zdolnych do wykrywania nanocząstek bez konieczności znakowania stwarza nowe możliwości badania ich zachowania i kinetyki. Co więcej, rola pierwiastków śladowych, takich jak żelazo i miedź, w chorobach mózgu i chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak Alzheimer1, Menkes2,3 lub Wilson4, sugeruje zainteresowanie badaniem i lokalizacją tych pierwiastków w tkankach.

Różne techniki zostały użyte do mapowania pierwiastków lub mikroanalizy różnych materiałów. W pracy przeglądowej opublikowanej w 2006 r. R. Łobinski i wsp. przedstawili przegląd dostępnych standardowych technik mikroanalizy pierwiastkowej w środowisku biologicznym, jednym z najtrudniejszych środowisk dla nauk analitycznych5. Mikrosonda elektronowa, która składa się z mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii w transmisyjnym mikroskopie elektronowym, może być stosowana w wielu badaniach, jeśli stężenie pierwiastka jest wystarczające (>100–1000 μg/g). Aby osiągnąć dolne granice wykrywalności, zastosowano następujące techniki:

  • mikrosonda wiązki jonów wykorzystująca emisję promieniowania rentgenowskiego indukowaną cząstkami μ-PIXE (1–10 μg/g)6
  • mikroanaliza promieniowania synchrotronowego μ-SXRF (0,1–1 μg/g)7
  • spektrometria mas jonów wtórnych SIMS (0,1 μg/g)8
  • ablacja laserowa spektrometria mas sprzężona indukcyjnie LA-ICP-MS (do 0,01 μg/g)9,10

Wyżej wymienione techniki zapewniają rozdzielczość mikrometryczną, jak pokazano w Tabeli 1 zaczerpniętej od Lobinski et al.

3D rekonstrukcja seryjnych badań 2D może być również zaproponowana do rekonstrukcji głębszych tkanek11. Jednak wszystkie urządzenia i systemy wymagają zarówno wykwalifikowanych specjalistów, umiarkowanego i bardzo drogiego sprzętu, jak i długotrwałych eksperymentów (zwykle ponad 4 godziny w przypadku 100 μm x 100 μm w przypadku μ-SXRF i 10 mm x 10 mm w przypadku LA-ICP-MS)12. Łącznie wymagania te sprawiają, że mikroanaliza elementarna jest bardzo restrykcyjna i niekompatybilna z konwencjonalnymi systemami obrazowania optycznego, mikroskopią fluorescencyjną lub mikroskopią nieliniową. Kolejną kwestią, o której możemy tutaj wspomnieć, jest to, że możliwości pomiaru ilościowego są nadal dość ograniczone i zależą od dostępności wzorców laboratoryjnych dopasowanych do matrycy. Dalsze uogólnienie zastosowania mikroanalizy elementarnej w procesach przemysłowych, geologii, biologii i innych dziedzinach zastosowań zaowocuje znaczącymi przełomami koncepcyjnymi i technologicznymi.

Celem niniejszego manuskryptu jest zaproponowanie rozwiązań dla ilościowego mapowania pierwiastków (lub mikroanalizy pierwiastków) w tkankach biologicznych za pomocą oprzyrządowania w pełni kompatybilnego z konwencjonalną mikroskopią optyczną. Nasze podejście opiera się na spektroskopii rozpadu indukowanego laserem (technologia LIBS). W LIBS impuls laserowy jest skupiany na próbce będącej przedmiotem zainteresowania, aby wytworzyć rozpad i iskrę materiału. Promieniowanie atomowe emitowane w plazmie jest następnie analizowane przez spektrometr, a stężenia pierwiastków można uzyskać za pomocą pomiarów kalibracyjnych wykonanych wcześniej13,14. Do zalet LIBS należą: czułość (μg/g dla prawie wszystkich pierwiastków), kompaktowość, bardzo podstawowe przygotowanie próbki, brak kontaktu z próbką, natychmiastowa reakcja i precyzyjnie zlokalizowana (mikro) analiza powierzchni. Zastosowanie obrazowania chemicznego tkanek pozostaje jednak wyzwaniem, ponieważ ablacja laserowa tkanek musi być precyzyjnie kontrolowana, aby można było wykonywać mapy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej wraz z czułością w zakresie μg/g15,16.

Przy takim rozwiązaniu, nie jest potrzebne stosowanie znaczników lub środków etykietujących, co pozwala na wykrywanie pierwiastków nieorganicznych bezpośrednio w ich naturalnym środowisku w tkankach biologicznych. Opracowany w naszym laboratorium instrument LIBS oferuje rozdzielczość prądu niższą niż 100 μm przy szacowanej czułości dla Gd poniżej 35 μg/g, co odpowiada 0,1 mM 16, co pozwala na mapowanie dużych próbek (>1 cm2) w ciągu 30 minut. Ponadto domowe oprogramowanie ułatwia pozyskiwanie i wykorzystywanie danych. Przyrząd ten służy do wykrywania, mapowania i ilościowego określania rozkładu tkanek nanocząstek na bazie gadolinu (Gd)17-18 w nerkach i próbkach guza od małych zwierząt, od 1 do 24 godzin po dożylnym wstrzyknięciu cząstek (wielkość <5 nm). Pierwiastki nieorganiczne, które są nieodłącznie zawarte w tkance biologicznej, takie jak Fe, Ca, Na i P, również zostały wykryte i zobrazowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie próbki biologicznej

Wszystkie eksperymenty opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania CECCAPP (Lyon, Francja) (autoryzacja #LYONSUD_2012_004), a eksperymenty były przeprowadzane pod nadzorem upoważnionych osób (L. Sancey, autoryzacja DDPP #38 05 32).

  1. Dodać 1 mlH2Odo 100 μmol nanocząstek na bazie gadolinu (Gd), odczekać 15 minut i dodać 20 μl HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, CaCl2 20 mM do 100 μlH2Oi 80 μl pierwotnego roztworu nanocząstek na bazie Gd, aby otrzymać 200 μl roztworu o stężeniu 40 mM gotowego do wstrzyknięcia (Miasto: Villeurbanne, w laboratorium).
  2. Wstrzyknąć dożylnie roztwór nanocząstek na bazie 200 μl Gd znieczulonym gryzoniom z nowotworem (Miasto: Lyon Sud (Oullins), 15 km od laboratorium).
  3. 1-24 godziny po wstrzyknięciu poświęć myszy i umieść próbki biologiczne w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C (Miasto: Lyon Sud (Oullins), 15 km od laboratorium).
  4. Pokrój próbkę na plasterki (Miasto: zwykle Grenoble, 100 km od laboratorium; Postaram się mieć dostęp w Lyonie Sud) w szkiełkach o grubości 100 μm i umieszczę szkiełka biologiczne na specjalnych plastikowych szalkach (szalka Petriego). Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    Uwaga: Plastikowe naczynia są w zasadzie bardzo czystą próbką polimeru. Stosuje się je w celu uniknięcia ingerencji w elementy zawarte w tkance.

2. Przygotowanie próbki do kalibracji

  1. Przygotować fiolki ze zwiększającymi się dawkami nanocząstek na bazie Gd do wody (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM, 100 μM, 500 μM, 1 mM i 5 mM).
  2. Umieścić 5 μl kropli każdego roztworu w regularnych odstępach co 3 mm na szalce Petriego.
  3. Suszyć w temperaturze pokojowej przez 20 min.

3. Eksperyment LIBS

  1. Inicjowanie konfiguracji biblioteki LIBS
    1. Ustawienia lasera. Po włączeniu przyrządów należy odczekać 10-20 minut na ustabilizowanie się energii impulsu laserowego i schłodzenie kamery ICCD do -20 °C. Dostosuj energię impulsu za pomocą tłumika.
      Uwaga: Optymalne parametry lasera do mapowania tkanek to czas trwania impulsu 5 ns, długość fali 1 064 nm i energia impulsu około 4 mJ. Laser wykorzystuje typowy laser nanosekundowy Nd:YAG.
    2. Ustawienia bibliotek LIBS. Ustaw pozycję ogniskowania lasera (w stosunku do powierzchni próbki), aby uzyskać mniejszą średnicę krateru (około 50 μm lub mniej).
      Uwaga: Odpowiada to ogniskowaniu impulsu laserowego 100 μm poniżej powierzchni próbki.
    3. Ustawienia spektrometru. Użyj spektrometru Czerny-Turnera w połączeniu z siatką 1,200 linii/mm i kamerą ICCD o wysokiej rozdzielczości czasowej. Steruj wszystkimi tymi urządzeniami za pomocą komputera. Ustaw wartość szczeliny wejściowej na 40 μm. Ustaw zakres widmowy dotyczący pierwiastka, który ma być analizowany. Użyj zakresu spektralnego obejmującego od 325 do 355 nm, aby wykryć Gd z wysoką czułością, a także Na, Cu i Ca. Ustaw parametry ICCD z opóźnieniem 300 nsec, bramką 2 μs i wzmocnieniem 200.
  2. Mapowanie pomiaru
    1. Umieść próbkę biologiczną na zmotoryzowanym uchwycie na próbkę LIBS.
    2. Dostosuj wysokość próbki zgodnie z pozycją ostrości lasera.
    3. Zrób zdjęcie próbki w wysokiej rozdzielczości.
    4. Ustaw moduł mapowania oprogramowania do akwizycji LIBS tak, aby wykonywał mapę z typowymi punktami pomiarowymi 100 x 100 rozmieszczonymi w rozdzielczości około 100 μm.
    5. Rozpocznij nabywanie. Od tego momentu zautomatyzuj wszystko; ruchoma sekwencja, a także nagrywanie i zapisywanie widma. Do odwzorowania 10 000 punktów potrzeba 40 minut (co odpowiada 1cm2 dla rozdzielczości 100 μm). Przegrupuj wszystkie zarejestrowane widma w ten sam plik.
    6. Po zakończeniu zrób drugie zdjęcie wycinka próbki
  3. Pomiar kalibracyjny

Z tymi samymi parametrami eksperymentalnymi, zmierz próbki kalibracyjne (szczegóły dotyczące przygotowania, patrz sekcja 2). Wykonaj mapę lub zapisz 25 widm (uzyskanych z miejsc pomiarowych w środkowej części kropli) w każdej z kropli kalibracyjnych.

4. Analiza widma LIBS: Konstruowanie obrazów chemicznych

  1. Zapisz wszystkie widma LIBS z mapowania tkanek i załaduj je do analizy oprogramowania LIBS. Odejmij linię bazową dla każdego widma i skonstruuj obrazy chemiczne ze skalą intensywności względnej, używając fałszywego koloru.
    Uwaga: Algorytm pobiera określone intensywności linii, takie jak Gd, Cu, Na lub Ca.
  2. Wykonaj tę samą operację na widmach zmierzonych ze skalibrowanej próbki, aby umożliwić obliczenie krzywych kalibracyjnych (zależność między intensywnością a stężeniem) i zbuduj mapę ilościową lub obraz dla Gd (lub innego elementu będącego przedmiotem zainteresowania).
  3. Zastosuj odpowiednie zabiegi do obrazów chemicznych, takie jak interpolacja lub wygładzenie. Zapisz mapy intensywności lub koncentracji w formacie obrazu (bitmapa).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jak pokazano na Rysunku 1, wiązka lasera Nd:YAG o podstawowej długości fali 1 064 nm była ogniskowana pionowo w dół na plaster tkanki za pomocą soczewki kwarcowej o ogniskowej 50 mm. Energia impulsu wynosiła 4 mJ, a częstotliwość repetycji 10 Hz. Aby uniknąć generowania plazmy w powietrzu, wiązkę laserową ogniskowano około 100 µm poniżej powierzchni próbki. W tych warunkach nie zaobserwowano plazmy powietrznej. Podczas eksperymentów próbka była przesuwana za pomocą silnika krokowego, aby wygenerować jedn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technika ta, zastosowana do próbki biologicznej, umożliwia obrazowanie chemiczne, tj. mapowanie i kwantyfikację Gd i Si z wstrzykniętych nanocząstek na bazie Gd do różnych narządów. Z głównych ustawień krytycznych, kontrola właściwości lasera (długość fali, energia impulsu, ogniskowanie i stabilność) ma kluczowe znaczenie dla precyzyjnej i precyzyjnej ablacji tkanek (tj. rozdzielczości mapowania), a także dla czułości. Praca przy dużej energii zapewnia lepszą czułość, ale niestety generuje pogorszoną ro...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Labex-Imust.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Laser nanosekundowy Nd:YAGQuantelBrillant5 nsec szerokość impulsu, długość fali 1,064 nm
SpektrometrAndor TechnologyShamrock 303z 1,200 liniami / mm palony na siatce 300 nm
Detektor ICCDAndor TechnologyIstar2 nsec rozdzielczość czasowa
LIBS JednostkaILMDomowe oprzyrządowanie
oparte na Gd nanocząstkiNano-Hcząstki
HEPESSigma-AldrichH4034do rozcieńczania cząstek
CaCl2Sigma-Aldrich21108do rozcieńczania cząstek
NaClSigma-AldrichS5886do rozcieńczania cząstek
MyszyCharles Riverw zależności od hodowli
IsofluraneCoveto / Virbacdo znieczulenia - Isofluranum
IsopentaneSigma-Aldrich59060do zamrażania próbki  powoli
Ciekły azotAir Liquidedo schładzania izopentanu
KriostatLeicaCM-3050Sdo przesuwania
próbek Szalki PetriegoDutscher353004do przyklejenia próbka
zwierząt

Bibliografia

  1. Smith, M. A., Harris, P. L., Sayre, L. M., Perry, G. Iron accumulation in Alzheimer disease is a source of redox-generated free radicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 9866-9868 (1997).
  2. Wang, Y., Zhu, S., Weisman, G. A., Gitlin, J. D., Petris, M. J. Conditional knockout of the Menkes disease copper transporter demonstrates its critical role in embryogenesis. PloS one. 7, (2012).
  3. Reske-Nielson, E., Lou, H. O., Andersen, P., Vagn-Hansen, P. Brain-copper concentration in Menkes' disease. Lancet. 1, 613 (1973).
  4. Hayashi, H., et al. Various copper and iron overload patterns in the livers of patients with Wilson disease and idiopathic copper toxicosis. Medical molecular morphology. 46, (2013).
  5. Lobinski, R., Moulin, C., Ortega, R. Imaging and speciation of trace elements in biological environment. Biochimie. 88, 1591-1604 (2006).
  6. Devès, G., Bouhacina, T., Ortega, R. STIM mass measurements for quantitative trace element analysis within biological samples and validation using AFM thickness measurements. Spectrochimica Acta B. 59, 1733-1738 (2004).
  7. Twining, B. S., et al. Quantifying trace elements in individual aquatic protist cells with a synchrotron X-ray fluorescence microprobe. Analytical chemistry. 75, 3806-3816 (2003).
  8. Guerquin-Kern, J. L., Wu, T. D., Quintana, C., Croisy, A. Progress in analytical imaging of the cell by dynamic secondary ion mass spectrometry (SIMS microscopy). Biochimica et biophysica acta. 1724, 228-238 (2005).
  9. Binet, M. R., Ma, R., McLeod, C. W., Poole, R. K. Detection and characterization of zinc- and cadmium-binding proteins in Escherichia coli by gel electrophoresis and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Analytical biochemistry. 318, 30-38 (2003).
  10. Becker, J., Gorbunoff, A., Zoriy, M., Izmer, A., Kayser, M. Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometre scale for elemental and isotopic analysis on gels and biological samples. J. Anal. Atom. Spectrom. 21, 19-25 (2006).
  11. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D imaging by mass spectrometry: a new frontier. Analytical chemistry. 84, 2105-2110 (2012).
  12. Pornwilard, M. -M., Weiskirchen, R., Gassler, N., Bosserhoff, A. K., Becker, J. S. Novel bioimaging techniques of metals by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry for diagnosis of fibrotic and cirrhotic liver disorders. PloS one. 8, (2013).
  13. Cremers, D. A., Radziemski, L. J. Handbook of laser-induced breakdown spectroscopy. , Wiley. (2006).
  14. Miziolek, A. W., Palleschi, V. Laser-Induced Breakdown Spectroscopy: Fundamentals and Applications. , (2006).
  15. Motto-Ros, V., et al. Mapping nanoparticles injected into a biological tissue using laser-induced breakdown spectroscopy. Spectrochimica Acta Part B. , (2013).
  16. Motto-Ros, V., et al. Mapping of native inorganic elements and injected nanoparticles in a biological organ with laser-induced plasma. Applied Physics Letters. 101, (2012).
  17. Mignot, A., et al. A top-down synthesis route to ultrasmall multifunctional Gd-based silica nanoparticles for theranostic applications. Chemistry. 19, 6122-6136 (2013).
  18. Lux, F., et al. Ultrasmall rigid particles as multimodal probes for medical applications. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 12299-12303 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza pierwiastkowamapowanie nanocz steksekcjonowanie tkanekdetekcja gadolinuzmotoryzowany st mikrometrycznypodczerwona wi zka laserowaobrazowanie chemicznepomiary kalibracyjneemisja plazmy

Powiązane artykuły