Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych

Podsumowanie

Odpady przemysłowe mogą być zbierane i modyfikowane w celu analizy rozwoju mikroorganizmów. Techniki ekstrakcji lignocelulozy dostarczają składników do analizy określonej zdolności biodegradacji. Chromatografia gazowa ze spektrometrią mas identyfikuje produkty fermentacji mikroorganizmów wyhodowanych na odpadach z roztwarzania. Metody te określają zdolność metaboliczną mikroorganizmów do rozkładu odpadów z roztwarzania.

Streszczenie

Proces kraft jest stosowany do wiórów drzewnych w celu oddzielenia ligniny od polisacharydów w lignocelulozie na celulozę, która pozwoli uzyskać wysokiej jakości papier. Ług to odpad roztwarzania powstający w procesie krafta, który ma potencjał do dalszej biokonwersji. Jednak oporny charakter zasobów lignocelulozy, jej pochodnych chemicznych, które stanowią większość dostępnego węgla organicznego w ługu czarnym, oraz jego zasadowego pH stanowią wyzwanie dla mikrobiologicznej biodegradacji tego materiału odpadowego. Metody zbierania i modyfikacji ługu czarnego do wzrostu mikroorganizmów mają na celu wykorzystanie tych odpadów miazgi do przekształcenia ligniny, kwasów organicznych i produktów ubocznych degradacji polisacharydów w cenne chemikalia. Przedstawione techniki ekstrakcji lignocelulozy zapewniają powtarzalną metodę przygotowania substratów wzrostu lignocelulozy w celu zrozumienia zdolności metabolicznych hodowanych mikroorganizmów. Zastosowanie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas umożliwia identyfikację i ilościowe określenie produktów fermentacji powstałych w wyniku wzrostu mikroorganizmów na odpadach z roztwarzania. Metody te, gdy są stosowane razem, mogą ułatwić określenie aktywności metabolicznej mikroorganizmów o potencjale wytwarzania produktów fermentacji, które zapewniłyby większą wartość dla systemu roztwarzania i zmniejszyłyby ilość ścieków, zwiększając w ten sposób potencjalne zyski z mielenia papieru i oferując dodatkowe zastosowania ługu czarnego.

Wprowadzenie

Roztwarzanie drewna to chemicznie intensywny proces, który był optymalizowany przez wiele lat, aby stworzyć system z minimalną ilością odpadów. Jednak niektóre produkty tego procesu można wykorzystać do wytwarzania produktów o wyższej wartości. Jednym z takich przykładów jest trunek. Jest wytwarzany w procesie kraftowym, który jest dominującą chemiczną metodą roztwarzania, stanowiącą 85% światowej produkcji ligniny¹. Proces Krafta (rysunek 1) wykorzystuje temperaturę (160-200 °C), ciśnienie (120 psig) i substancje chemiczne zawarte w ługu białym (wodorotlenek sodu i siarczek sodu) do rozpuszczenia ligniny z włókien drzewnych^2,3. Ług zawiera ligninę, kwasy organiczne i produkty uboczne degradacji polisacharydów⁴. Jest on spalany w celu wytworzenia pary i odzyskania chemikaliów w kotle regeneracyjnym, który dostarcza energię cieplną do dalszych procesów produkcji papieru i roztwarzania. Objętość ługu czarnego wytwarzanego przez roztwarzanie może przekraczać ilość, którą kocioł regeneracyjny może skutecznie przetworzyć. Usuwanie czarnego ługu w postaci ścieków negatywnie wpływa na florę i faunę wodną, a zatem nie jest opcją. Zastosowanie organizmów mikrobiologicznych, które mogłyby wykorzystywać ług do wzrostu, byłoby korzystne z punktu widzenia zwiększenia odzysku chemicznego i wytwarzania produktów o wartości dodanej, które poprawiłyby ogólną analizę cyklu życia systemu roztwarzania. Chemiczna i biologiczna konwersja monomerów pochodzących z ligniny z powodzeniem wyprodukowała wanilinę i kwas cynamonowy do stosowania jako słodziki spożywcze i dodatki zapachowe, fenol stosowany do tworzyw sztucznych i żywic oraz cykloheksan, który może być stosowany jako paliwo⁵.

Poprzednie prace nad biodegradacją tego odpadu z pulpy koncentrowały się na depolimeryzacji ligniny. Międzynarodowy Instytut Ligniny (ILI) podaje, że każdego roku (http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php) produkuje się od 40 do 50 milionów ton ligniny. Tylko 1,5% tej ligniny jest wykorzystywane w komercyjnych procesach przemysłowych⁶. Depolimeryzacja ligniny przez lakazę i enzymy peroksydazy wytwarzane przez grzyby białej zgnilizny z rodzajów Phanerochaete i Trametes została szczegółowo zbadana⁷. Wykazano również, że bakterie glebowe, o których wiadomo, że rozkładają związki aromatyczne, takie jak Nocardia i Rhodococcus⁸, Pseudomonas putida mt-2⁹ i Streptomyces viridosporus T7A¹⁰, są zdolne do degradacji ligniny. Degradacja bakteryjna odpadów z roztwarzania jest obiecująca, ponieważ niektóre bakterie mogą rozwijać się w warunkach zasolenia i zasadowości (pH 10-14), które charakteryzują ścieki z odpadów roztwarzania¹¹. Podczas gdy lignina jest głównym składnikiem ługu czarnego, mikroorganizmy mogą również rozkładać inne składniki składające się na ług. Techniki te nie identyfikują wyłącznie mikroorganizmów rozkładających ligninę, ale służą do identyfikacji mikroorganizmów, które można zastosować bezpośrednio do odpadów roztwarzania ługu czarnego zamiast do jego dalej przetworzonych składników.

ług został zebrany i zmodyfikowany do rozwoju mikroorganizmów poprzez neutralizację i filtr-sterylizację. Wymagania dotyczące wzrostu mikroorganizmów określono dla środowiskowego izolatu mikrobiologicznego poprzez eksperymenty z minimalnym wzrostem pożywek na składnikach lignocelulozowych wytwarzanych za pomocą nowego protokołu ekstrakcji lignocelulozy. Pożywki wzrostowe analizowano za pomocą chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) w celu określenia produktów przemiany materii środowiskowego izolatu mikrobiologicznego uprawianego na ługu czarnym jako jedynym źródle węgla. Połączenie tych technik stanowi narzędzie oceny pozwalające określić zdolność metaboliczną mikroorganizmu hodowanego na odpadach z celulozowni, takich jak ług. Zastosowanie takich technik daje również wgląd w wartość zastosowania określonych mikroorganizmów do odpadów celulozowni w celu wytworzenia produktów ubocznych.

Protokół

1. Zbieranie czarnego ługu i przygotowanie czarnego ługu do hodowli wzrostu

1. Pobrać próbkę ługu czarnego z zaworu wylotowego podłączonego do komory fermentacyjnej Kraft w sterylnej szklanej butelce i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed przystąpieniem do następujących kroków.
   zobojętnianie
2. Dodać 100 ml próbki ługu czarnego do zlewki o pojemności 500 ml wyposażonej w mieszadło.
3. Umieść zlewkę na mieszadle i ustaw prędkość na średnią.
4. Powoli dodawaj krople kwasu fosforowego, aż ług stanie się lepki (lepkość podobna do glicerolu).
5. Porcjować cały roztwór ługu czarnego, powoli rozlewając do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 9 300 x g przez 30 minut.
6. Umieścić supernatant w zlewce i zmierzyć pH za pomocą wstęg do badania pH. Osad wytrąconej ligniny można wyrzucić i potraktować jako inne niż niebezpieczne odpady stałe.
7. Kontynuować dodawanie kwasu fosforowego i odwirowywanie roztworu, aż paski pH wskażą neutralne pH supernatantu.
   sterylizacja
8. Przepuść roztwór przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających bakterii i umieść przefiltrowany roztwór w sterylnym pojemniku do przechowywania. Przechowywać w temperaturze pokojowej.

2. Ekstrakcja lignocelulozy

Separacja węglowodanów

1. Umieścić 5 g proso rózgowatego, sosny lub trawy bermudzkiej (zmielonej do wielkości cząstek 1 mm lub mniejszej) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml. Następnie dodać do kolby 200 ml wody destylowanej lub dejonizowanej, 7,5 g NaClO₂, 2,5 ml lodowatego kwasu octowego i mieszadło.
2. Umieścić kolbę w łaźni olejowej umieszczonej na płytce mieszającej w temperaturze 80 °C na 1 godzinę. Ustawić prędkość mieszadła na średnią.
3. Dodać dodatkowe 7,5 g NaClO₂ i 2,5 ml lodowatego kwasu octowego do kolby. Kontynuować mieszanie w temperaturze 80 °C w łaźni olejowej przez 30 minut.
4. Powtórzyć poprzedni krok 2x (Uwaga: do kolby zawierającej biomasę lignocelulozową dodaje się łącznie 30 g NaClO2 i 10 ml lodowatego kwasu octowego). Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.
5. Umieść arkusz bibuły filtracyjnej w lejku Büchnera. Umieść lejek na kolbie bocznej i podłącz ją do odkurzacza.
6. Powoli wlej roztwór do lejka.
7. Przemyć materiał stały 3x 100 ml wody destylowanej lub dejonizowanej. Wyrzucić filtrat po umyciu materiału stałego.
8. Zachowaj 1 g stałego materiału i umieść go na czystym arkuszu bibuły filtracyjnej.
9. Wysuszyć ten stały materiał przez noc w piekarniku o temperaturze 50 °C. Po wyjęciu próbki z pieca umieścić ją w fiolce do przechowywania oznaczonej jako "holoceluloza".
10. Dodać pozostałą substancję stałą do 250 ml 10% NaOH (v/v) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml. Zakryć kolbę korkiem.
11. Umieścić roztwór w inkubatorze w temperaturze 70 °C na 1 godzinę, wstrząsając z prędkością 250 obr./min.
12. Schłodzić roztwór przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
13. Usunąć materiał stały za pomocą bibuły filtracyjnej i lejka Büchnera przymocowanego do kolby bocznej.
14. Przenieść materiał stały na czystym arkuszu bibuły filtracyjnej do pieca o temperaturze 50 °C i pozostawić do wyschnięcia na noc.
15. Po wyschnięciu pozostałości umieścić je w fiolce do przechowywania i oznaczyć jako "celuloza".
16. Przenieść filtrat z etapu 2.13 do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml i dodać 30 ml kwasu octowego i 250 ml alkoholu izopropylowego. Zakryj kolbę i umieść roztwór na blacie stołu na co najmniej 8 godzin w temperaturze pokojowej.
17. Przenieść cały roztwór do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować roztwór o stężeniu 9 300 x g przez 30 minut. Ostrożnie odpipetować roztwór z probówki stożkowej i wyrzucić.
18. Zawiesić osad w 30 ml wody destylowanej lub dejonizowanej przez wirowanie.
19. Powtórz kroki 2.17-2.18 15x, aby dokładnie umyć granulkę.
20. Usunąć supernatant i zachować granulat do liofilizacji. Po liofilizacji pobrać próbkę i umieścić ją w fiolce z napisem "hemiceluloza".
    Separacja ligniny
    Protokół separacji ligniny oparty na Karaaslan i wsp. ¹²
21. Dodać 5 g proso rózgowatego, sosny lub trawy bermudzkiej (zmielonej na 1 mm lub mniejszy rozmiar cząstek) do 500 ml roztworu 0,25 M NaOH i 30% etanolu. Umieścić gnojowicę w inkubatorze w temperaturze 75 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 2 godziny.
22. Schłodzić roztwór do temperatury pokojowej.
23. Umieścić arkusz bibuły filtracyjnej w lejku Büchnera na górze kolby bocznej. Podłącz do odkurzacza i powoli wlej roztwór do lejka.
24. Wyrzuć materiał stały.
25. Dodać mieszadło do kolby zawierającej filtrat i umieścić kolbę na wierzchu płytki mieszającej ustawionej na średnią prędkość. Dodawać stężony kwas solny kroplami do roztworu, aż do uzyskania pH 2,0 (około 20 ml).
26. Pozostaw zakwaszony roztwór na noc w temperaturze pokojowej.
27. Odwirować roztwór o stężeniu 9 300 x g przez 30 minut w stożkowych probówkach. Ostrożnie odpipetować roztwór ze stożkowej rurki i wyrzucić.
28. Zawiesić osad w 30 ml wody destylowanej lub dejonizowanej przez wirowanie.
29. Powtórz kroki 2.27-2.28 15x, aby dokładnie umyć granulkę.
30. Po odwirowaniu usunąć supernatant i zachować granulat do liofilizacji. Po liofilizacji umieścić próbkę w fiolce z napisem "lignina".

3. Przygotowanie kultur wzrostu mikroorganizmów

Talerze agarowe

1. Dodaj 0,2% (w/v) sterylnych produktów ekstrakcji lignocelulozy do agaru M9 minimal^{media 13} przed nalaniem płytek.
2. Smugi zestalonych płytek z około 200 ul kultury bakteryjnej wyhodowanej w minimalnym podłożu M9 o średnicy zewnętrznej około 2,0.
3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i monitorować wzrost.
   Płynne kultury bakterii
4. Dodać 50 ml sterylnej pożywki Luria-Bertani (LB)¹³ lub M9 minimalnej pożywki¹³ do sterylnej kolby o pojemności 125 ml. Dodać ług w stężeniu 10% (v/v) lub 0,2% (w/v) produktów ekstrakcji lignocelulozy.
5. Zaszczepić pożywkę 0,1% (v/v) kultury bakteryjnej przy średnicy zewnętrznej około 2,0.
6. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min.
7. Oceniać wzrost co 6 godzin w okresie hodowli, mierząc gęstość optyczną (λ = 600 nm). Umieścić 1 ml porcji kultury w kuwecie. Określić gęstość optyczną kultury wyzerowanej na nieinokulowanych pożywkach.
8. Przenieś bakterie do butelki z surowicą beztlenową w połowie fazy logarytmicznej.
   1. Aby przygotować butelkę z surowicą beztlenową: zamknij butelkę z serum korkiem z gumy butylowej i aluminiową nakrętką zaciskaną w warunkach tlenowych i autoklaw. Nie należy modyfikować przestrzeni nad głową w butelce serum po sterylizacji.
   2. Przenieść całą 50 ml kultury z kolby o pojemności 125 ml do szczelnie zamkniętej sterylnej butelki z surowicą za pomocą strzykawki.
   3. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.

4. Przygotowanie próbki do GC-MS

Przygotuj próbki według Raja, Reddy'ego i Chandry¹⁴. Kontrola ujemna stosowana do porównania składa się z minimalnej pożywki M9 z 10% czarnym ługiem i jest również określana jako próbka nieinokulowana.

1. Odwirować nieinokulowane i zaszczepione kultury bakterii (50 ml) przy 9 300 x g przez 30 minut po 450 godzinach inkubacji.
2. Przenieść 10 ml supernatantu do szklanej probówki. (Uwaga: Plastik jest niekompatybilny z chemikaliami w poniższych krokach.)
3. Zakwasić supernatant stężonym HCl do pH 1-2.
4. Dodaj 3 objętości octanu etylu (30 ml), zakryj probówkę i wymieszaj, odwracając 4-6 razy.
5. Umieść niewielką ilość bezwodnego Na₂SO₄ (1-2 g) w czystej szklanej probówce.
6. Ostrożnie zebrać warstwę organiczną (górną) z roztworu octanu etylu, pipetując za pomocą jednorazowej, szklanej pipety Pasteura.
7. Umieść warstwę organiczną w probówce z bezwodnym Na₂SO₄.
8. Odwodnić warstwę organiczną na bezwodnym Na₂SO₄, delikatnie stukając w probówkę, aby wymieszać. Stopniowo dodawaj niewielkie ilości bezwodnego Na₂SO₄i mieszaj, aż nie będzie dużych grudek.
9. Umieścić arkusz bibuły filtracyjnej w lejku Büchnera na górze kolby z bocznym ramieniem podłączonej do próżni.
10. Wlej roztwór do lejka. Wyrzuć materiał stały.
11. Przenieść roztwór do kolby parownika i odparować filtrat za pomocą wyparki obrotowej.
12. Umieścić 3 mg pozostałości po ekstrakcji octanu etylu w 2 ml fiolki z chromatografią bursztynową.
13. Rozpuścić pozostałość z dodatkiem 100 μl 1,4-dioksanu i 10 μl pirydyny.
14. Dodać 50 μl N,O-bis(trimetylosililo) trifluoroacetamidu z trimetylocholorsilanem 99:1% (BSTFA). Następnie umieścić w inkubatorze w temperaturze 60 °C z wytrząsaniem przez 15 minut.
15. Przechowywać próbki w temperaturze 4 °C do czasu użycia.

5. GC-MS

Wyposaż chromatograf gazowy (GC) sprzężony ze spektrometrem masowym (MS) z niepolarną kolumną kapilarną i helem jako gazem nośnym o prędkości przepływu 1 ml/min.

1. Po ustabilizowaniu się temperatury pieca na poziomie 50 °C, wstrzyknąć 1 μl próbki w stosunku 1/50.
2. Utrzymać kolumnę w temperaturze 50 °C przez 5 minut i zwiększyć do 280 °C przy 5 °C/min. Utrzymać temperaturę końcową 280 °C przez 20 minut.
3. Utrzymać linię przesyłową między chromatografem gazowym a spektrometrem masowym w temperaturze 300 °C.
4. Wybierz opóźnienie rozpuszczalnika wynoszące 15 minut.
5. Zapis widm masowych jonizacji elektronów w zakresie 10-500 (m/z) przy energii elektronów 70 eV.
6. Derywatyzacja i wzorzec chromatografu jak wyżej. Zidentyfikuj związki, porównując czasy przechowywania zakupionych wzorców lub danych w bazie danych widma mas National Institute of Standards and Technology (NIST).

Wyniki

Zbieranie i modyfikowanie czarnego ługu powstającego w procesie roztwarzania kraft (Rysunek 1) pozwoli na wykorzystanie tego odpadu do obcierania do określenia zdolności biodegradacji pojedynczego izolatu bakteryjnego lub mieszanej kultury. Rysunek 2 przedstawia wzrost tlenowy mierzony gęstością optyczną mikrobiologicznego izolatu środowiskowego hodowanego w samych pożywkach LB i pożywkach LB uzupełnionych 10% zneutralizowanym ługiem czarnym. Wyniki te wskazują, że bakteria ta rośnie w o...

Dyskusja

Protokół ten opisuje kombinację technik, które mają na celu identyfikację mikroorganizmów, które mogą rozkładać odpady z roztwarzania, źródeł węgla wykorzystywanych podczas wzrostu odpadów z roztwarzania oraz mikrobiologicznych produktów przemiany materii wytwarzanych podczas uprawy na odpadach z roztwarzania. Wykazaliśmy sukces tego protokołu w przypadku mikrobiologicznego izolatu środowiskowego: fakultatywnego beztlenowca, który może rosnąć na 10% ługu czarnym i wykorzystywać składniki ekstrakcji lignocelulozy jako jed...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,4-dioksan (certyfikowany ACS)	Fisher	D111	Łatwopalny, wstępnie utleniony chemiczny
ług	Zakład Biomateriałów Leśnych na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej	Nie	dotyczy pH 12,72, 13,67% ciał stałych
Etanol (klasa mikrobiologiczna)	Fisher	BP2818
Octan etylu (klasa odczynnika ACS)	EMD	EX0240-9	Łatwopalny
Lodowaty kwas octowy (certyfikowany ACS)	EMD	AX0073
Gwajakol	Sigma Aldrich	PHR1136	Szkodliwy po spożyciu,
Kolumna kapilarna HP-5	Agilent	19091J-577	60 m x 0,18 mm średnica wewnętrzna, 0,18 μ m grubości
Kwas solny (certyfikowany ACS)	EMD	HX0603P
N,O-bis(trimetylosililo)trifluoroacetamid z trimetylocholorylosilanem 99:1% (BSTFA)	Fluka	15238	Łatwopalny, powoduje oparzenia skóry i uszkodzenia oczu w kontakcie
Na2SO4 (klasa FCC)	VWR	BDH8026
NaClO2 (80%)	Sigma Aldrich	244155	Łatwopalny, toksyczny
NaOH (certyfikowany ACS)	EMD	1.06498.1000
wstążki do badania pH kwasów zasadowych	Kwas	A979
(certyfikowany ACS)	Spektrometr	A242
Polaris Q	Thermo Electron Corporation
Pirydyna (99%)	Alfa Aesar	A12005	Łatwopalny, toksyczny w kontakcie ze skórą
Switchgrass	Cherry Research Farm Goldsboro, Karolina Północna	Nie dotyczy	Zebrane w sierpniu 2011 r
Chromatograf gazowy śladowy Thermo Finnigan	Bibuła
filtracyjna Whatman nr 1	Whatman	1001-150