Artykuł metodologiczny

Trifosforany nukleozydów - od syntezy do charakterystyki biochemicznej

DOI:

10.3791/51385

⸱

3 kwietnia 2014

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany tutaj ma na celu wyjaśnienie i skrócenie licznych przeszkód na drodze skomplikowanej drogi prowadzącej do zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów. W związku z tym protokół ten ułatwia zarówno syntezę tych aktywowanych elementów budulcowych, jak i ich dostępność do praktycznych zastosowań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjna strategia wprowadzania funkcji chemicznych polega na wykorzystaniu syntezy w fazie stałej poprzez dołączanie odpowiednio zmodyfikowanych prekursorów fosforamidytu do powstającego łańcucha. Jednak warunki zastosowane podczas syntezy i ograniczenie do raczej krótkich sekwencji utrudniają zastosowanie tej metodologii. Z drugiej strony, zmodyfikowane trifosforany nukleozydów są aktywowanymi elementami budulcowymi, które zostały wykorzystane do łagodnego wprowadzenia wielu grup funkcyjnych do kwasów nukleinowych, strategii, która toruje drogę do wykorzystania zmodyfikowanych kwasów nukleinowych w szerokiej palecie praktycznych zastosowań, takich jak znakowanie funkcjonalne i generowanie rybozymów i DNAzymów. Jednym z głównych wyzwań jest zawiłość metodologii prowadzącej do izolacji i charakterystyki tych analogów nukleozydów.

W tym artykule wideo przedstawiamy szczegółowy protokół syntezy tych zmodyfikowanych analogów przy użyciu odczynników na bazie fosforu(III). Ponadto przedstawiono procedurę ich charakterystyki biochemicznej, ze szczególnym naciskiem na reakcje wydłużania starterów i polimeryzację ogonową TdT. Ten szczegółowy protokół będzie przydatny do tworzenia zmodyfikowanych dNTP i ich dalszego wykorzystania w biologii chemicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

5'-trifosforany nukleozydów ((d)NTP) reprezentują klasę ważnych biomolekuł, które biorą udział w niezliczonych procesach i funkcjach, począwszy od bycia uniwersalną walutą energii, a skończywszy na regulatorach metabolizmu komórkowego. Oprócz ich roli w tych fundamentalnych przemianach biologicznych, ich zmodyfikowane odpowiedniki rozwinęły się jako wszechstronna i łagodna platforma do wprowadzania grup funkcyjnych do oligonukleotydów, metodologia, która dobrze uzupełnia zautomatyzowaną syntezę w fazie stałej, która jest zwykle stosowana1,2. Rzeczywiście, pod warunkiem, że (d)NTP mogą działać jako substraty dla polimeraz RNA i DNA3, bogactwo grup funkcyjnych, w tym aminokwasy4-13, kwasy borowe14,15, nornbornen16, reszty diamentoidopodobne17, łańcuchy boczne do organokatalizy18, kwasy żółciowe19, a nawet oligonukleotydy20 mogą zostać wprowadzone do oligonukleotydów.

Poza tym, że stanowią wygodny wektor do funkcjonalizacji kwasów nukleinowych, zmodyfikowane dNTP mogą być wykorzystywane w SELEX i innych pokrewnych metodach kombinatorycznej selekcji in vitro do generowania zmodyfikowanych katalitycznych kwasów nukleinowych21-30 i aptamerów do różnych praktycznych zastosowań10,31-36. Uważa się, że dodatkowe łańcuchy boczne, które są wprowadzane przez polimeryzację zmodyfikowanych dNTP, zwiększają przestrzeń chemiczną, którą można zbadać podczas eksperymentu selekcyjnego i uzupełniają raczej ubogi funkcjonalny arsenał kwasów nukleinowych37. Jednak pomimo tych atrakcyjnych cech i niedawnego postępu poczynionego w rozwoju zarówno metod syntetycznych, jak i analitycznych, nie istnieje żadna uniwersalna i wysokowydajna procedura wytwarzania zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów2,38.

Celem tego obecnego protokołu jest rzucenie światła na (czasami) skomplikowane procedury prowadzące do syntezy i biochemicznej charakterystyki tych aktywowanych elementów budulcowych (Rysunek 1B). Szczególny nacisk zostanie położony na wszystkie syntetyczne szczegóły, które często są trudne do znalezienia lub są nieobecne w sekcjach eksperymentalnych, ale są kluczowe dla pomyślnego zakończenia ścieżki syntezy prowadzącej do izolacji czystych (d)NTP (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza modyfikowanych trifosforanów nukleozydów

Wybrane podejście syntetyczne jest zgodne z procedurą opracowaną przez Ludwiga i Ecksteina, ponieważ ta metoda jest ogólnie niezawodna i prowadzi do bardzo niewielu produktów ubocznych (Rysunek 1A)39.

  1. Odpowiednio odparowany nukleozyd chroniony przed 3'-OAc (zwykle 0,1 mmol) należy dwukrotnie odparować bezwodną pirydyną (2 ml), a następnie wysuszyć w próżni przez noc. W tym samym czasie wysuszyć pirofosforan tributyloamonu (0,13 mmol) w próżni przez noc.
  2. Rozpuścić nukleozyd w minimalnej ilości suchej pirydyny (0,2 ml) i dodać suchy dioksan (0,4 ml) jako współrozpuszczalnik. Na koniec dodać 2-chloro-1,3,2-benzodioksafosforin-4-on (0,11 mmol) i pozostawić do reakcji w temperaturze pokojowej przez 45 min.
    Uwaga: Warto zauważyć, że szczególną ostrożność należy zachować w przypadku odczynnika 2-chloro-1,3,2-benzodioksafosforyno-4-onu. Rzeczywiście, nawet przechowywanie tego odczynnika w atmosferze gazu obojętnego nie wystarczy, aby zapobiec jego rozkładowi. Tak więc białe ciało stałe, które powstaje w tym rozkładzie może i powinno zostać zeskrobane przed użyciem.
  3. Przygotować roztwór pirofosforanu tributyloamonu w suchym DMF (0,17 ml) i świeżo destylowanej tributyloaminy (58 μl; nigdy nie dodawać sit molekularnych). Powstały roztwór dodać do mieszaniny reakcyjnej (pojawia się biały osad, ale szybko znika) i pozostawić do reakcji w temperaturze pokojowej na 45 minut.
  4. Przygotować roztwór jodu (0,16 mmol) w pirydynie (0,98 ml) iH2O(20 μl) i dodać do mieszaniny reakcyjnej w celu utlenienia centrum Pα(III). Pozostaw powstały ciemny roztwór do mieszania w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Użyj 10% wodnego roztworu NaS2O3 do ugaszenia nadmiaru I2. Usunąć rozpuszczalnik w próżni (temperatura łaźni wodnej wyparki obrotowej musi być utrzymywana poniżej 30 °C). DodaćH2O(5 ml) i pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na 30 minut w celu hydrolizy cyklicznego ugrupowania trifosforanowego.
  6. Na tym etapie zwykle usuwane są grupy ochronne (tj. 3'-OAc i grupy na łańcuchach bocznych zasady nukleotydowej). W związku z tym dodać NH4OH (30% w H2O, 10 ml) do ropy naftowej i mieszać przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej i usunąć rozpuszczalnik w próżni.
  7. Dodać 2 mlH2Oi podzielić na 2 probówki. Dodać 12 ml 2% roztworu NaClO4 w acetonie i wirować (1 000 x g) przez 30 minut. Ta procedura jest powtarzana po raz kolejny. Wytrącanie to pozwala na oddzielenie rozpuszczalników i odczynników użytych do syntezy od trifosforanu (który spowoduje wytrącenie), upraszczając w ten sposób następujące po tym oczyszczanie RP-HPLC.
  8. Po wysuszeniu na powietrzu oleistej pozostałości należy zanotować widmo 31P-NMR surowca (zgodnie ze standardowymi procedurami, patrz również wykaz materiałów i rysunek 3) i rozpuścić w 4 ml H2O.
    Uwaga: Ta procedura syntezy koncentruje się głównie na wytwarzaniu zmodyfikowanych trifosforanów deoksynukleozydów, ale bardzo podobną procedurę można zastosować do ich odpowiedników RNA (po prostu przy użyciu prekursorów 2',3'-bis-O-acetylowanych).

2. Oczyszczanie HPLC zmodyfikowanych trifosforanów nukleozydów

  1. Przygotowanie 1 M roztworu podstawowego wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB):40
    1. Przygotować roztwór 1 mola trietyloaminy (139 ml) w ≈ 600 ml destylowanego i przefiltrowanegoH2O.
    2. Wprowadzić CO2 (za pomocą suchego lodu i bełkotki gazowej) do roztworu przy energicznym mieszaniu, aż do osiągnięcia pH 7,6 (zajmie to co najmniej 10 godzin). Ten roztwór podstawowy można przechowywać w lodówce przez okres do jednego miesiąca.
  2. oczyszczanie:
    1. Przygotować dwa roztwory buforowe z 1 M zapasu: 2 l 50 mM TEAB w wodzie ultraczystej (eluent A) i 1 l 50 mM TEAB w 50% MeCN (eluent B). Odgazowuje oba eluenty w próżni i mieszając przez 20 minut (należy zachować szczególną ostrożność, aby nie zmienić pH poprzez usunięcie CO2 podczas odgazowywania).
    2. Przygotować próbkę analityczną, rozpuszczając 10 μl surowego trifosforanu w 300 μl destylowanegoH2Oi wstrzyknąć do systemu HPLC wyposażonego w półpreparatywną kolumnę RP (C18) i stosując gradient w zakresie od 0 do 100% B w ciągu 40 minut (rysunek 4). Dostosować program HPLC zgodnie z Rt trifosforanu (który jest zwykle głównym pikiem na chromatogramie) i difosforanu (który ma nieco niższą Rt). Oczyścić surową mieszaninę w tych warunkach i usuwając wczesne frakcje, które mogą zawierać pewną ilość difosforanu.
    3. Połączyć wszystkie frakcje zawierające produkt i liofilizować (co jest preferowane niż parowanie na wyparce obrotowej w celu zminimalizowania hydrolizy do niepożądanego difosforanu). Kilkakrotnie odparować ultraczystą wodą (w celu usunięcia pozostałości trietyloaminy z eluentów). Ocenić czystość trifosforanu za pomocą NMR (zarówno 1H, jak i 31P NMR) i MALDI-TOF, stosując standardowe protokoły (patrz rysunek 5). Typowe plony uzyskiwane przy zastosowaniu tego protokołu mieszczą się zazwyczaj w przedziale 30-70%, w zależności od podłoża.

3. Reakcje przedłużania startera i polimeryzacja TdT

  1. Etykietowanie 5' końca podkładu
    1. Zmieszać 30 pmol odpowiedniego startera (np. P1, Wykaz materiałów) z 4 μl 10x buforu kinazy polinukleotydowej (PNK), 3 μl γ-[32P]-ATP, 1 μl PNK i ddH2O (dla całkowitej objętości reakcji 40 μl). Inkubować mieszaninę reakcyjną w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie dezaktywować kinazę termicznie (10 minut w temperaturze 70 °C).
    2. Podczas reakcji etykietowania należy przygotować kolumnę G10 Sephadex, zatykając końcówkę pipety o pojemności 1 ml silanizowaną watą szklaną i napełniając końcówkę roztworem G10 (10% w ddH2O, w autoklawie). Odwirować i przemyć trzykrotnie 500 μl ddH2O i jedno ostatnie płukanie 50 μl ddH2O. Przepuścić mieszaninę reakcyjną przez G10 (w celu usunięcia wolnej etykiety radioaktywnej).
    3. Żel oczyścić (STRONA 20%) znakowany radioizotopem starter i odzyskać przez zastosowanie metody zgniatania i namaczania (tj. elucja za pomocą 500 μl roztworu wodnego zawierającego 1% LiClO4 i 1 mMNEt 3 (pH 8) w temperaturze 72 °C przez 15 min). Osad etanolu i G10 odsalają eluowany oligonukleotyd.
  2. Reakcja przedłużania podkładu
    1. Wyżarzać 1 pmol znakowanego radioaktywnie startera P1, 10 pmol startera P1 i 10 pmol matrycy T1 (wykaz materiałów) w 10-krotnym buforze reakcyjnym (dostarczonym przez dostawcę polimerazy, która ma być użyta) poprzez umieszczenie probówki w gorącej (90-95 °C) wodzie i pozostawienie do stopniowego schładzania do temperatury pokojowej (przez 45 min).
    2. Umieścić probówkę na lodzie i dodać (kolejno) koktajl dNTP (zawierający zarówno zmodyfikowane, jak i naturalne trifosforany, końcowe stężenie 100 μM) oraz 1 U polimerazy DNA (Vent (egzo-), Klenow, Pwo lub 9°Nm) i uzupełnić wodą (dla całkowitej objętości reakcji 20 μl). Inkubować w optymalnej temperaturze roboczej enzymu (np. 60 °C przez 30 minut, gdy używany jest Vent (egzo-)).
    3. Dodać 20 μl roztworu zatrzymującego (formamid (70%), kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA; 50 mM), błękit bromofenolowy (0,1%), cyjanol ksylenowy (0,1 %)), podgrzać próbki (95 °C, 5 min), schłodzić (0 °C) i rozpuścić przez elektroforezę w żelu poliakrylamidowym. Wizualizacja za pomocą phosphorimager.
  3. Polimeryzacja TdT
    1. Rozcieńczyć 7 pmol jednoniciowego, nieznakowanego startera P2 (wykaz materiałów), 1 pmol startera znakowanego radioaktywnie w 1 μl buforu TdT 10x.
    2. Umieścić probówkę na lodzie i dodać (kolejno) koktajl dNTP (o odpowiednim stężeniu między 10 a 200 μM) oraz polimerazę TdT (4 j.). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Dodać 10 μl roztworu zatrzymującego, podgrzać próbki (95 °C, 5 min), schłodzić (0 °C) i rozpuścić przez denaturację w żelu poliakryloamidowym metodą elektroforezy (STRONA 15%). Wizualizacja za pomocą phosphorimager.

4. PCR ze zmodyfikowanymi trifosforanami nukleozydów

  1. Zmieszać 8 pmol zarówno starterów do przodu, jak i do tyłu z 0,5 pmol matrycy, która ma być amplifikowana. Dodać 10x bufor reakcyjny i koktajl dNTP (dla końcowego stężenia 200 μM) i umieścić probówkę na lodzie. Dodać 1 j. polimerazy DNA i uzupełnićH2O, aby osiągnąć końcową objętość 20 μl. Przenieść mieszaninę do fiolki PCR i przeprowadzić 30 cykli PCR.
  2. Rozcieńczyć 6 μl 6 μl 2x buforu ładującego sacharozę i rozpuścić w elektroforezie agarozy 2% (barwionej bromkiem etydyny). Wizualizacja za pomocą phosphorimager.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmodyfikowane trifosforany nukleozydów są kuszącymi syntetycznymi celami, ponieważ pozwalają na łatwe wprowadzenie szerokiego wachlarza grup funkcyjnych do kwasów nukleinowych41. Jednak izolacja i charakterystyka tych aktywowanych elementów budulcowych często okazuje się żmudna. W związku z tym uważa się, że wyniki przedstawione w niniejszym dokumencie stanowią pomocną dłoń w śledzeniu różnych etapów w ramach wyżej wymienionych procedur syntetycznych i biochemicznych (ryc. 1B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Włączenie modyfikacji do kwasów nukleinowych jest interesujące dla wielu zastosowań praktycznych, w tym rozwoju agentów antysensownych i antygenowych42,43, znakowania i funkcjonalnego znakowania oligonukleotydów41 oraz w wysiłkach na rzecz rozszerzenia alfabetu genetycznego44-46. Zmiany chemiczne i grupy funkcyjne są zwykle wprowadzane do kwasów nukleinowych poprzez zastosowanie standardowych i zautomatyzowanych protokołów syntezy w fazie stałej. Jednak bloki budulcowe fosforoamidytu musz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (granty nr PZ00P2_126430/1 i PZ00P2_144595). Prof. C. Leumann jest wdzięczny za udostępnienie przestrzeni laboratoryjnej i sprzętu, a także za jego ciągłe wsparcie. Pani Sue Knecht jest wdzięczna za owocne dyskusje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pirofosforan tributyloamonu Sigma AldrichP8533Higroskopijne ciało stałe, przechowywać w Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioksafosforyno-4-onu Sigma Aldrich324124Wrażliwy
na wilgoć PirydynaSigma Aldrich82704Pod sitami molekularnymi
DioksanSigma Aldrich296309Pod sitami molekularnymi
Dimetyloformamid (DMF)Sigma Aldrich40248Pod sitami molekularnymi
Acetonitryl Fisher ScientificHPLC klasa
TrietyloaminaSigma Aldrich90342
TributyloaminaSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qdejonizowana i oczyszczona woda, autoklawizowana w obecności dietylopirowęglanu (DEPC)
Dwupirowęglan dietylu (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
γ-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) Polimeraza DNANEBM0257S
Polimeraza DNA I, duży (Klenow) fragmentNEBMO210S
9° Nm Polimeraza DNANEBMO260S
Końcowa deoksynukleotydylotransferaza (TdT)PromegaM828A
Polimeraza DNA PwoPeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Akrylamid/bisakryloamid (19:1, 40%)Serva10679.01
AgarozaApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
MocznikApollo ScientificBIU4110
Półpreparatywna kolumna Jupiter RP-HPLC (5μ C18 300 & Aring ;)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
Fiolki do PCRBioconcept3220-00
System HPLCAmersham Pharmacia BiotechÄ kta basic 10/100
Wszystkie oligonukleotydy zostały zakupione od Microsynth i oczyszczone przez PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
Więcej informacji na temat procedur i sprzętu eksperymentalnego można znaleźć w następujących artykułach:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Modyfikowane nukleotydyodczynniki fosforoweHPLC w fazie odwr conejreakcje wyd u ania starterapolimeryzacja TdTcharakterystyka NMRanaliza MALDIelektroforeza elowachemia biologiczna

Powiązane artykuły