Artykuł metodologiczny

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

16.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51387

⸱

23 kwietnia 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

W tym artykule

Podsumowanie

Wieloskładnikowe kompleksy białkowe odgrywają kluczową rolę podczas funkcjonowania i rozwoju komórek. W tym miejscu opisujemy metodę stosowaną do izolowania natywnych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila po sieciowaniu in vivo, a następnie oczyszczeniu usieciowanych kompleksów w celu późniejszej analizy strukturalno-funkcjonalnej.

Streszczenie

Wiele procesów komórkowych jest kontrolowanych przez wielopodjednostkowe kompleksy białkowe. Często kompleksy te tworzą się przejściowo i wymagają natywnego środowiska do złożenia. Dlatego, aby zidentyfikować te funkcjonalne kompleksy białkowe, ważne jest, aby ustabilizować je in vivo przed lizą komórek i późniejszym oczyszczeniem. Tutaj opisujemy metodę stosowaną do izolowania dużych kompleksów białkowych w dobrej wierze z zarodków Drosophila. Metoda ta opiera się na przenikaniu zarodków i stabilizacji kompleksów wewnątrz zarodków poprzez sieciowanie in vivo przy użyciu niskiego stężenia formaldehydu, który może łatwo przenikać przez błonę komórkową. Następnie interesujący kompleks białkowy jest oczyszczany immunologicznie, a następnie oczyszczany żelem i analizowany za pomocą spektrometrii mas. Metodę tę ilustrujemy za pomocą oczyszczania kompleksu białek Tudorów, który jest niezbędny do rozwoju linii zarodkowej. Tudor to duże białko, które zawiera wiele domen Tudorów - małych modułów, które oddziałują z metylowanymi argininami lub lizynami docelowych białek. Metoda ta może być dostosowana do izolacji natywnych kompleksów białkowych z różnych organizmów i tkanek.

Wprowadzenie

Izolacja wielopodjednostkowych zespołów białkowych i kompleksów DNA- lub RNA-białkowych jest przeprowadzana w celu identyfikacji kompleksów białkowych, loci genomowych rozpoznawanych przez białka regulatorowe wiążące DNA lub cele RNA białek wiążących RNA. Różne metody umożliwiają identyfikację całego genomu miejsc DNA rozpoznawanych przez czynniki transkrypcyjne lub białka chromatyny (ChIP-seq)1 oraz cele RNA związane z danym białkiem wiążącym RNA (CLIP-seq)2. Biblioteki cDNA pochodzących z RNA lub celów DNA są następnie głęboko sekwencjonowane. Metody te wykorzystują sieciowanie chemiczne lub indukowane promieniowaniem UV w celu ustabilizowania kompleksów, a następnie immunoprecypitację (IP) przeciwciałem przeciwko składnikowi białkowemu badanego kompleksu.

Podczas rozwoju organizmu, wiele kompleksów białkowych tworzy się przejściowo. Dlatego tak ważne jest przeanalizowanie składu i funkcji tych kompleksów in vivo, aby zrozumieć mechanizmy molekularne kontrolujące rozwój. Taka analiza in vivo byłaby lepsza od podejścia in vitro, ponieważ praktycznie niemożliwe jest odtworzenie natywnych stężeń oddziałujących składników i komórkowego środowiska biochemicznego in vitro. W tym miejscu demonstrujemy podejście in vivo, które z powodzeniem stosujemy do izolowania dużych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila. W tej metodzie kompleksy białkowe w żywych zarodkach są sieciowane z niskim stężeniem formaldehydu, a następnie kompleksy białkowe będące przedmiotem zainteresowania są izolowane przez IP z przeciwciałem przeciwko znanemu składnikowi kompleksów, a następnie oczyszczane żelem kompleksów i analiza spektrometrii mas w celu identyfikacji nieznanych składników kompleksu. Ponieważ formaldehyd jest w stanie przenikać przez błonę komórkową i ma zakres sieciowania 2,3-2,7A3, kompleksy białkowe mogą być sieciowane in vivo, a składniki kompleksu prawdopodobnie znajdują się blisko siebie. W artykule opisujemy tę metodę na przykładzie izolacji kompleksu białkowego Tudor (Tud). Tud jest białkiem linii zarodkowej, które jest niezbędne do rozwoju linii zarodkowej4-7. Białko to zawiera 11 domen Tud, o których wiadomo, że oddziałują z metylowanymi argininami lub lizynami innych polipeptydów8-10.

Poprzednio wygenerowaliśmy transgeniczną linię Drosophila, która wyraża oznaczoną HA funkcjonalną Tud5 i dlatego specyficzne przeciwciało anty-HA jest używane do ściągania kompleksu Tud po usieciowaniu.

Oprócz wiązań białkowo-białkowych, formaldehyd może generować wiązania krzyżowe kwas-białko nukleinowy i jest używany w eksperymentach ChIP-seq. Co więcej, u Drosophila sieciowanie in vivo formaldehydem umożliwiło identyfikację celu RNA białka helikazyVasa RNA 11.

Chociaż w tym artykule opisujemy metodę sieciowania in vivo i oczyszczania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila, ta metoda może być dostosowana do innych organizmów i tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie dużych talerzy z sokiem jabłkowym

  1. Aby przygotować 4 płytki, dodać 375 ml H2O, 11,25 g agaru muchowego i mieszadło do kolby o pojemności 1 000 ml. To jest Mix A. Autoklaw Mix A z luźno zakręconą pokrywą kolby w jednym 30-minutowym cyklu sterylizacji dla produktów płynnych.
  2. Do zlewki o pojemności 500 ml dodaj 125 ml soku jabłkowego, 12,5 g cukru stołowego i tabliczkę mieszanki. To jest Mix B. Podgrzej Mix B na podgrzewanej platformie, mieszając i utrzymuj temperaturę na poziomie około 70 °C, aż do zakończenia autoklawowania Mix A.
  3. Po zakończeniu autoklawowania Mix A przenieś Mix B do Mix A. Delikatnie mieszaj połączoną mieszaninę i pozwól jej ostygnąć przez 15 minut. Unikaj nadmiernego chłodzenia i wynikającego z tego zestalenia agaru przed dodaniem środka konserwującego.
  4. Przygotować 10% (wagowo/objętościowo) roztwór 4-hydroksybenzoesanu metylu w etanolu. To będzie działać jako środek konserwujący. Dodać 3,75 ml roztworu do powyższej mieszanki soku jabłkowego i agaru. Mieszaj przez kolejne 5 minut.
  5. Wlej 125 ml mieszanki soku jabłkowego i agaru ze środkiem konserwującym do każdej 300 cm2 plastikowej lub styropianowej płyty. Pozwól mu ostygnąć do RT i zestalić się. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas nalewania.
    nuta: Talerze z agarem z sokiem jabłkowym są natychmiast gotowe do użycia. Niewykorzystane talerze przykryć przezroczystymi foliami i przechowywać w temperaturze 4°C przez okres do tygodnia.

2. Pobieranie zarodków Drosophila i leczenie przed sieciowaniem

  1. Załaduj klatkę populacyjną około 40 000 do 50 000 much, z których zostaną pobrane zarodki.
  2. Przygotuj dwie płytki, z których każda zawiera 125 ml standardowej mąki kukurydzianej i melasy12 i posyp każdy talerz około 4 g suszonych drożdży piekarskich. Umieścić te płytki w klatce populacyjnej w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 48 godzin w celu tuczenia muszek.
  3. Podgrzej 2 talerze z sokiem jabłkowym i agarem do temperatury 25 °C. Posyp każdy talerz około 1 g suszonych drożdży piekarskich. Umieść 2 płytki w klatce populacyjnej, aby rozpocząć zbieranie zarodków w wieku 0-1 godziny.
  4. Wyjmij talerze pod koniec 1-godzinnej zbiórki. Wymień na 2 nowe talerze, jeśli potrzebna jest kolejna runda zbierania.
  5. Dodaj tyle wody, aby przykryć płytki i delikatnie zawieś zarodki za pomocą cienkiego pędzla. Przelej zawieszone zarodki przez dwuwarstwowe sito wykonane z siatki drucianej ze stali nierdzewnej.
    nuta: Wierzchnia warstwa wykonana jest z siatki o średniej wielkości porów (850 μm), która zbiera duże części muchy, przepuszczając zarodki. Dolna warstwa wykonana jest z drobnej siatki (75 μm), która zbiera zarodki, przepuszczając drożdże i wodę.
  6. Za pomocą cienkiego pędzla przenieś zebrane zarodki do kosza do pobierania wykonanego z probówki o pojemności 50 ml i drobnej nylonowej siatki. Krótko opłucz zarodki wodą, a następnie osusz siatkę na ręcznikach papierowych do wyschnięcia.
  7. Zanurz zarodki w 50% wybielaczu, delikatnie mieszając na 3 minuty. Dokładnie spłucz wodą, aby usunąć resztki wybielacza. Osusz siatkę na ręcznikach papierowych do wyschnięcia.
  8. Zanurz zdekorionowane zarodki w izopropanolu z delikatnym mieszaniem na 15 sekund lub do momentu rozpadu grudek wielozarodkowych (nie powinno to trwać dłużej niż 30 sekund). Osusz siatkę na ręcznikach papierowych, aby dokładnie wyschły.
  9. Zanurz zarodki w heptanie na 5 minut, używając pipety, aby rozprowadzić heptan po zarodkach, aby utrzymać je w zawieszeniu. Osusz siatkę na ręcznikach papierowych do wyschnięcia.
  10. Płukać zarodki strumieniami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, pH 7,4 (PBS) zawierającej 0,1% Triton X-100 (PBST) przez 3 min.
  11. Zdemontować kosz do pobierania i przenieść zarodki wraz z siatką do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml PBST. Delikatnie odwróć rurkę, aby zmyć zarodki z siatki.
  12. Usuń siatkę z tuby. Ustaw probówkę w pozycji pionowej i pozwól zarodkom opaść na dno rurki grawitacyjnie.
    nuta: Oczekuje się, że około 100 - 300 μl zarodków zostanie pobranych w ciągu 1 godziny z jednej klatki.
  13. Usuń PBST i natychmiast kontynuuj sieciowanie.

3. Sieciowanie in vivo pobranych zarodków

  1. Przygotować 0,2% formaldehydu w PBST bezpośrednio przed użyciem. Dodać 10 ml utrwalacza formaldehydu do zarodków i inkubować w temperaturze 25 °C, delikatnie mieszając na wytrząsarce obrotowej przez 10 minut. Wyrzuć niewykorzystany utrwalacz do końca dnia.
  2. Ugasić reakcję sieciowania
    1. Pod koniec sieciowania pozwól zarodkom opaść na dno probówki.
    2. Usuń roztwór formaldehydu. Natychmiast dodać 10 ml 0,25 M glicyny do PBST, aby wygasić reakcję sieciowania. Inkubować w temperaturze 25 °C z delikatnym mieszaniem na wytrząsarce obrotowej przez 5 minut.
    3. Pozwól zarodkom opaść na dno probówki. Usunąć roztwór hartowniczy. Umyj zarodki trzykrotnie 10 ml PBST.
    4. Całkowicie usunąć roztwór płuczący PBST za pomocą pipety. Przechowywać zarodki w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

4. Przygotowanie próbki białka i immunoprecypitacja

  1. Homogenizować 500 μl usieciowanych zarodków za pomocą homogenizatora Dounce w 2 ml buforu do lizy (0,5 M mocznika, 0,01% SDS, 2% Triton-X 100, 2 mM fluorku fenylometanosulfonylu [PMSF] i koktajl inhibitorów proteazy w PBS).
    nuta: Wykonaj te i następne kroki w RT, chyba że określono inaczej.
  2. Przenieś lizat do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i delikatnie kołysz się na obrotowej platformie przez 15 minut, aby zapewnić dokładną lizę. Odwirować lizat przy 16 000 x g przez 5 minut, aby osadzać resztki komórkowe. Przechowywać supernatant w czystej probówce o pojemności 15 ml.
  3. Dodać 40 μl zawiesiny z kulek agarozy anty-HA do supernatantu i inkubować na platformie obrotowej przez 2,5 godziny.
    4. Granulki osadzać
  4. przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant, ale pozostawić około 250 μl w probówce. Zawiesić kulki w pozostałym supernatantze i przenieść do kolumny wirowej o pojemności 1,5 ml z filtrem porowym 10 μm.
  5. Odwirować kolumnę wirową o stężeniu 12 000 x g przez 10 sekund i odrzucić przepływ.
  6. Przemyć kulki, dodając 200 μl buforu do przemywania (0,1 M glicyny, 1 M NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0,1% Tween-20, w PBS). Odwirować kolumnę o stężeniu 12 000 x g przez 10 sekund i wyrzucić płukanie. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
  7. Dodać 40 μl buforu elucyjnego (2 mg/ml peptydu HA w PBS) do kulek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, delikatnie mieszając co 5 minut. Odwirować kolumnę o stężeniu 12 000 x g przez 10 sekund i zebrać eluat.
  8. Potwierdzić elucję kompleksu za pomocą analizy western-blot przy użyciu przeciwciała anty-HA13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Skuteczność sieciowania oraz pomyślną puryfikację sieciowanego kompleksu białkowego Tud przeanalizowano za pomocą SDS-PAGE na żelu gradientowym 3% - 7% (przedstawionym na Rysunku 1), a następnie za pomocą western blot (Rysunek 2).

Celem zastosowania żelu stopniowanego 3% - 7% jest efektywna separacja sieciowanego kompleksu białka Tud od pozostałego niesieciowanego białka Tud oraz zagęszczenie kompleksu. W zastosowanych powyżej warunkach sieciowania in vivo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Formaldehyd jest powszechnie stosowany jako odczynnik sieciujący do identyfikacji interakcji białko-białko i białko-kwas nukleinowy. Jego dobra rozpuszczalność i przepuszczalność błony komórkowej, wraz z kompatybilnością z dalszymi procedurami spektrometrii mas, sprawiają, że formaldehyd jest idealnym kandydatem do zastosowań wewnątrzkomórkowych3,15-17. W szczególności z powodzeniem wykorzystano go do identyfikacji mRNA związanych z Vasa, krytyczną helikazą RNA komórki rozrodczej u Drosophila11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Jordanowi Davisowi, Yanyanowi Linowi, Ericowi Schadlerowi i Jimiao Zhengowi za ich pomoc techniczną w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez grant NSF CAREER MCB-1054962 dla A.L.A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drosophila agarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1Nie sterylizuj w autoklawie mieszanki wody i agaru przez dłuższy czas, ponieważ spowoduje to, że płytki soku jabłkowego staną się kruche
4-hydroksybenzoesan metyluSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501Inna nazwa: TEGOSEPT
Klatka populacyjnaFlystuff ( http://www.flystuff.com/)59-104
Drobna siatka nylonowaFlystuff (http://www.flystuff.com/)57-102Podczas wykonywania kosza zbiorczego należy przyciąć siatkę nieco większą niż otwór nasadki rurki sokoła, aby zapewnić szczelne uszczelnienie
Homogenizator DounceSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETPrzed użyciem schłodzić homogenizator na lodzie i wstępnie spłukać zimnym buforem do lizy, aby zapobiec degradacji białek
Koktajl inhibitorów proteazy Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS może być stosowany do przygotowania stężonego roztworu podstawowego inhibitora proteazy
Anty-HA kulki agarozoweMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8W skład zestawu wchodzi również peptyd HA oraz kolumny spinowe HA-peptide
MBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Przygotować do dawki 2 mg/ml z PBS 
Kolumna wirującaMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8Kolumny wirujące są częścią zestawu
IsopropanolFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)
Triton X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP151-500
HeptanFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625Rozcieńczyć od 10X do 1X wodą nanoczystą przed użyciem
FormaldehydFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
GlicynaBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
MocznikBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
Fluorek fenylometanosulfonyluSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1GPrzygotować 200 mM roztwór podstawowy w izopropanolu, a następnie rozcieńczyć do stężenia roboczego 2 mM w buforze do lizy
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
15-ml probówkiUSA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
WybielaczmarkiRozcieńczyć równą objętością wody nanoczystej, aby uzyskać 50% wybielacz
50-ml probówkiBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
Sito wierzchniej warstwyFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
Sito dolnej warstwyFisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
BP26324 Clorox

Bibliografia

  1. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
  2. Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
  3. Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
  4. Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
  5. Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
  6. Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
  7. Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
  8. Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
  9. Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
  10. Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
  11. Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
  12. Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  14. Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
  15. Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
  16. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
  17. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  18. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694(2006).
  19. Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kompleks w bia kowychsieciowanie formaldehydemimmunoprecypitacjaanaliza Western blotspektrometria maspermeabilizacja embrion woczyszczanie w elukompleks bia ek Tudor

Powiązane artykuły