Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Podsumowanie

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Streszczenie

Oprócz tego, że jest fizycznym rusztowaniem do utrzymania morfologii tkanek, macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest aktywnie zaangażowana w regulację funkcji komórek i tkanek podczas rozwoju i homeostazy narządów. Odbywa się to poprzez działanie za pośrednictwem biochemicznych, biomechanicznych i biofizycznych szlaków sygnałowych, takich jak uwalnianie bioaktywnych fragmentów białka ECM, regulacja napięcia tkanek i zapewnianie ścieżek migracji komórek. Macierz zewnątrzkomórkowa mikrośrodowiska guza ulega znacznej przebudowie, charakteryzującej się degradacją, odkładaniem i organizacją białek macierzy fibrylarnej i niefibrylarnej. Usztywnienie zrębu mikrośrodowiska guza może sprzyjać wzrostowi i inwazji guza oraz powodować przebudowę naczyń krwionośnych i limfatycznych. Obrazowanie na żywo białek macierzy jednak do tej pory ograniczało się do kolagenów fibrylarnych, które można wykryć za pomocą generacji drugiej harmonicznej za pomocą mikroskopii wielofotonowej, pozostawiając większość składników matrycy w dużej mierze niewidoczną. Tutaj opisujemy procedury inokulacji guza w cienkiej skórze ucha grzbietowego, znakowanie immunologiczne białek macierzy zewnątrzkomórkowej i obrazowanie przyżyciowe odsłoniętej tkanki u żywych myszy przy użyciu epifluorescencji i mikroskopii dwufotonowej. Nasza metoda obrazowania przyżyciowego pozwala na bezpośrednie wykrycie zarówno fibrylarnych, jak i niefibrylarnych białek macierzy w kontekście rosnącego guza skórnego. Pokazujemy przykłady przebudowy naczyń spowodowanych miejscowym skurczem matrycy. Odkryliśmy również, że fibrylarna matryca guza wykryta za pomocą drugiej generacji harmonicznej różni się przestrzennie od nowo zdeponowanych składników matrycy, takich jak tenascyna C. Pokazaliśmy również długoterminowe (12 godzin) obrazowanie interakcji limfocytów T z komórkami nowotworowymi i migracji komórek nowotworowych wzdłuż kolagenu IV błony podstawnej. Podsumowując, metoda ta w unikalny sposób pozwala na jednoczesne wykrywanie komórek nowotworowych, ich fizycznego mikrośrodowiska i endogennej odpowiedzi immunologicznej tkanek w czasie, co może dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw progresji guza i ostatecznego sukcesu lub oporności na terapię.

Wprowadzenie

Intravital obrazowanie procesów zapalnych, przerzutowych i przebudowy macierzy było ważnym obszarem badań i zmotywowało do stworzenia licznych transgenicznych modeli myszy reporterowych, które wyrażają białka fluorescencyjne^1,2. Ze względu na nieostre sygnały fluorescencyjne, które obniżają jakość obrazu i ograniczają przenikanie światła przez tkankę, obrazowanie grubych tkanek jest możliwe tylko za pomocą konfokalnej lub wielofotonowej mikroskopii skaningowej³. Zastosowanie szybszej, tańszej i bardziej złożonej mikroskopii epifluorescencyjnej jest możliwe tylko w przypadku tkanek prawie dwuwymiarowych, takich jak błona kosmówkowo-omocznikowa kurczaka⁴ lub skóra właściwa ucha myszy⁵. Większość systemów obrazowania wykorzystuje transgeniczne myszy wykazujące ekspresję różnych białek fluorescencyjnych w sposób specyficzny dla typu komórki. Mimo że białka te oferują słabą fototoksyczność, indukują odpowiedź immunologiczną⁶. Ponadto trudno jest przełączać się między określonymi podtypami komórek lub oznaczać ich stan podstawowy lub aktywowany, ponieważ taka zmiana wymaga przygotowania nowego modelu genetycznego. Ponadto, ponieważ ekspresja białek fluorescencyjnych jest na ogół ograniczona do przedziału wewnątrzkomórkowego, zwykle nie jest możliwe obrazowanie struktur zewnątrzkomórkowych, takich jak białka błony podstawnej lub złogi chemokiny tkankowej⁷. Zamiast tego, pośrednie znakowanie przeciwciałami przeciwko antygenom zewnątrzkomórkowym zapewnia elastyczność dla praktycznie każdego typu komórki lub składnika specyficznego dla macierzy^8,9. Jednak główną wadą tego podejścia do znakowania jest immunotoksyczność, w której pośredniczą kompleksy immunologiczne antygen-przeciwciało, które mogą wywoływać zależną od układu dopełniacza toksyczność komórkową i fagocytozę komórek i struktur zewnątrzkomórkowych¹⁰.

Macierz zewnątrzkomórkowa mikrośrodowiska guza, ale także normalnej tkanki podczas stanu zapalnego lub gojenia się ran, ulega znacznej przebudowie. Usztywnienie zrębu mikrośrodowiska guza może sprzyjać wzrostowi i inwazji guza z powodu mechanizmów sygnalizacyjnych wywołanych stresem i powodować przebudowę naczyń krwionośnych i limfatycznych¹¹. Jednak obrazowanie na żywo białek macierzy jest ograniczone do kolagenów fibrylarnych, które można wykryć za pomocą generacji drugiej harmonicznej za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Niedawno opublikowaliśmy nowatorską metodę obrazowania przyżyciowego, która minimalizuje ryzyko foto- i immunologicznego uszkodzenia obrazowanych komórek i struktur tkankowych⁵. W porównaniu z uznanymi technikami obrazowania, w których pojedyncza runda ciągłej wizualizacji przyżyciowej trwa od 30 minut do 2 godzin^12-17, nasza technika immunofluorescencji przyżyciowej (IF) pozwoliła na 12-godzinne (długoterminowe ⁸) obrazowanie. Należy zauważyć, że czas obrazowania jest ograniczony do 12 godzin ze względu na limity określone w naszym protokole dla zwierząt, ale nie ma technicznych przeciwwskazań, że nie można go przedłużyć, jeśli kontrolowane są krytyczne parametry zdrowotne zwierzęcia, takie jak ciśnienie krwi i tętno⁸. Ponadto, dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego stereomikroskopu fluorescencyjnego, byliśmy w stanie zebrać obrazy z wielu pól podczas jednego eksperymentu i zaobserwować rzadkie procesy immunologiczne i remodelingowe, które zachodziły w fizjologicznym kontekście skóry wspieranej przez funkcjonalne naczynia krwionośne i limfatyczne. Ze względu na to, że soczewka stereoskopowa ma stosunkowo dużą, bo 2 cm, odległość roboczą i w przeciwieństwie do optyki mikroskopu dwufotonowego nie wymaga zanurzenia w parującej wodzie, obrazowanie długoterminowe wykonano tylko pod stereoskopowym fluorescencyjnym mikroskopem. Intravital IF umożliwił znakowanie immunologiczne i wykrycie dowolnego składnika macierzy zewnątrzkomórkowej normalnej skóry. Konstrukcja tej techniki opiera się na innowacyjnej koncepcji stosowania barwienia immunologicznego dla żywych komórek i elementów macierzy tkankowej na chirurgicznie odsłoniętej skórze właściwej myszy bez powodowania szkodliwych skutków immunotoksycznych⁵. Sam zabieg chirurgiczny jest bezpieczny dla układu naczyniowego skóry właściwej, ponieważ polega wyłącznie na oddzieleniu dwóch warstw skóry w uchu, które są niezależnie unerwione, autonomicznie zasilane krwią i odprowadzane przez oddzielne krążenia limfatyczne. Nasza eksperymentalna konfiguracja umożliwia obrazowanie szeregu ważnych zdarzeń patofizjologicznych przez co najmniej 12 godzin, w tym transportu leukocytów między naczyniami krwionośnymi i limfatycznymi oraz procesów gojenia się ran. W pierwotnej publikacji porównaliśmy naszą technikę z najnowocześniejszymi standardami w różnych dziedzinach obrazowania przyżyciowego. W związku z tym zaobserwowaliśmy wynaczynienie naczyń krwionośnych i zdarzenia wewnątrznaczynienia limfatycznego przez różne typy leukocytów, w tym unikalną wizualizację komórek odpornościowych wchodzących do zbierania zamiast oczekiwanych początkowych naczyń limfatycznych¹⁵. Ponadto, uzupełniając obserwacje przeprowadzone przez inne grupy^9,18, stwierdziliśmy, że in vivo CCL21 jest zdolny do tworzenia silnych, nieciągłych złogów podczas pobierania, ale tylko rzadko na początkowych naczyniach limfatycznych.

Tutaj opisujemy zmodyfikowaną technikę IF przyżyciowej, która może być połączona z mikroskopią dwufotonową w celu wykrycia sieci kolagenów fibrylarnych za pomocą generacji drugiej harmonicznej (SHG). Pokazujemy, że metoda ta może być również stosowana do obrazowania inwazji komórek rakowych w kontekście dynamicznego mikrośrodowiska guza, które obejmuje cząsteczki macierzy, takie jak tenascyna C, które są w dużej mierze niezbadane przez obecne techniki obrazowania¹⁹. Stwierdziliśmy, że fibrylarna macierz guza, wykryta za pomocą drugiej generacji harmonicznej, zajmuje inne miejsca w mikrośrodowisku guza niż nowo zdeponowana matryca złożona z tenascyny C. Ponadto opisujemy przykłady przebudowy naczyń krwionośnych spowodowanych miejscowym skurczem macierzy, długoterminowe (12 godzin) obrazowanie interakcji komórek T z komórkami nowotworowymi oraz migrację komórek nowotworowych wzdłuż kolagenu IV błony podstawnej. Takie zdarzenia mogą być obrazowane przy jednoczesnym rejestrowaniu lokalnych parametrów fizjologicznych, takich jak przepuszczalność naczyń krwionośnych i drenaż limfatyczny.

Protokół

Wszystkie procedury wykonywane na zwierzętach były ściśle zgodne ze szwajcarską ustawą o ochronie zwierząt, rozporządzeniem o ochronie zwierząt i rozporządzeniem o eksperymentach na zwierzętach. Potwierdzamy, że nasz Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC), o nazwie Commission de Surveillance de l'État de Vaud (numer zezwolenia: 2687), specjalnie zatwierdził to badanie.

1. Inokulacja guza ucha

1. Hodowla komórek czerniaka B16-F10-GFP na 10 cm szalce Petriego przy użyciu pożywki DMEM + 10% FBS.
2. Gdy komórki są w 80-90% zlewne, umyj je PBS i odłącz przez trypsynizację. Wirować kuwety w temperaturze 1 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić osad w 1 ml roztworu Ringera i przenieść go do probówki Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Odwiruj ponownie i usuń cały supernatant z wyjątkiem cienkiej warstwy podłoża, która pozostaje tuż nad osadem. Ponownie zawieś komórki, aby uzyskać gęstą zawiesinę komórek.
3. Znieczulić mysz mieszaniną ketaminy/dorbene [medetomidyny] (75 mg/kg-1mg/kg) i potwierdzić, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone, wykonując delikatne szczypanie palca. Stężenie izofluranu należy zwiększać stopniowo o 0,1% w przypadku zaobserwowania ruchów (np. wycofania łapy). Trzymaj mysz na poduszce grzewczej sterowanej termistorem doodbytniczym (37 °C) przez cały zabieg i chroń jej oczy odpowiednią maścią okulistyczną.
4. Przygotować strzykawkę Hamilton (igła 33 g, objętość strzykawki 10 ml). Zdejmij nasadkę końcówki z igłą i załaduj 20 μl zawiesiny komórkowej na wierzch komory końcówki. Odciągnąć tłok, aż 5 ml gnojowicy znajdzie się w strzykawce. Usuń nadmiar gnojowicy z komory końcówki i zamknij nasadkę końcówki.
5. Za pomocą taśmy klejącej przymocuj bliższą krawędź ucha do czubka palca wskazującego. Pod kątem 45° powoli wprowadzić igłę strzykawki Hamilton między grzbietową skórę właściwą a chrząstkę. Po wejściu do środka wniknij do ucha od bliższego do dystalnego na około 2-3 mm.
   Uwaga: Procedura wstrzykiwania komórek powinna być wykonywana przez przeszkolonego i certyfikowanego technika. Ponadto proces ten należy wykonywać powoli i w kolejności: najpierw igłę należy przyłożyć poziomo do skóry ucha i powoli wprowadzać do skóry właściwej ucha. Raz i tylko wtedy, gdy końcówka igły znajdzie się w skórze, należy nacisnąć tłok. Naciśnięcie tłoka zainicjuje inokulację komórek w skórze. W mało prawdopodobnym przypadku, gdy igła przechodzi przez dwie warstwy skóry właściwej ucha, warstwę chrząstki i dostanie się w skórę osoby przeprowadzającej eksperyment, ból zadawany palcowi eksperymentatora powinien być traktowany jako niepokojący sygnał i powodować natychmiastowe wycofanie igły ze skóry doświadczającego. W takim przypadku nie należy naciskać tłoka, a skórę należy sterylizować alkoholem. Alternatywnie do stabilizacji ucha można użyć przedmiotu nieożywionego zamiast palca.
6. Wstrzyknąć 3 μl zawiesiny komórkowej i powoli wycofać igłę z ucha. Pozwól komórkom nowotworowym utworzyć lity guz w ciągu 7-9 dni i śledź wzrost guza za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego.
7. Alternatywnie, aby śledzić wczesne etapy interakcji komórek nowotworowych z macierzą tkankową, nałóż 50 μl 100 000 komórek nowotworowych zawieszonych w roztworze Ringera na odsłoniętą i zabarwioną skórę właściwą ucha (po kroku 3.3).

2. Chirurgia ucha

1. Trzy dni przed eksperymentem ogol głowę myszy, wygładź włosy wokół głowy i ucha (10-15 sekund) i spłucz wodą.
2. Znieczulij mysz mieszaniną nawilżonego tlenu i izofluranu (3-4% indukcji, 1-2% konserwacji) i potwierdź, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone, wykonując delikatne szczypanie palca. Stężenie izofluranu należy zwiększać stopniowo o 0,1% w przypadku zaobserwowania ruchów (np. wycofania łapy). Trzymaj mysz na poduszce grzewczej sterowanej termistorem doodbytniczym (37 °C) przez cały zabieg i chroń jej oczy odpowiednią maścią okulistyczną.
3. Zbuduj platformę wykonaną z 8 szkiełek histologicznych ze szkła klejonego. Obróć mysz na plecy i delikatnie umieść ucho z guzem na stosie szklanych szkiełek. Użyj małych pasków taśmy klejącej, aby przymocować przednią i tylną krawędź ucha do stosu.
4. Przetnij brzuszną skórę ucha wzdłuż antyhelisy małżowiny usznej myszy za pomocą skalpela. Za pomocą zakrzywionej pęsety delikatnie oderwij brzuszną skórę właściwą i chrząstkę z grzbietowej skóry właściwej, w której zaszczepiono guz. Ściągnij brzuszną skórę i chrząstkę za pomocą zakrzywionych kleszczy, odsłaniając grzbietową skórę właściwą. UWAGA: Jeśli główne naczynia w uchu zostaną przecięte lub krążenie krwi nie powróci do normalnego przepływu w ciągu 15 minut, ucho nie może być używane do obrazowania. Zawsze utrzymuj otwartą skórę ucha mokrą, używając bufora Ringera i chroń wilgoć za pomocą szkiełka nakrywkowego.
5. W przypadku uporczywego krwawienia z naczyń nowotworowych, należy zatamować krwawienie, dodając 100 μl trombiny (5 U/ml) do buforu Ringera (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 28 mM mleczanu sodu) na górze ucha na 5 minut.
6. Umyj ucho dwukrotnie około 5 ml buforu Ringera i usuń nadmiar płynu sterylnymi chusteczkami. Natychmiast przejdź do następnego kroku (w żadnym momencie nie pozwól, aby otwarte ucho wyschło!).

3. Barwienie immunofluorescencyjne

Użyj buforu Ringera uzupełnionego ludzką surowicą (1:10), mysim poliklonalnym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko ludzkiej IgG (1:50) i 125 IU/ml (2,5 mg/ml) aprotyniną (bufor blokujący) dla wszystkich etapów barwienia. Aprotynina hamuje plazminę sprzyjającą krzepnięciu, aby ograniczyć początkowe krwawienie, które może wystąpić po operacji.

1. Złóż część ucha z otwartą skórą właściwą do małżowin usznych i osusz zewnętrzną, nieotwartą skórę właściwą ucha sterylnymi chusteczkami. Unieruchomić ucho na stosie szkiełka podstawowego, nakładając 0,5 μl kleju chirurgicznego na przednią i tylną krawędź grzbietową. Następnie delikatnie spłaszcz grzbietową skórę właściwą ucha na szkle.
2. Do odsłoniętego ucha należy zastosować przeciwciała pierwszorzędowe skierowane przeciwko cząsteczkom macierzy zewnątrzkomórkowej o stężeniu 10 μg/ml w całkowitej objętości 100 μl buforu blokującego. Zakryj ucho szkiełkiem nakrywkowym, aby zapobiec wyschnięciu roztworu barwiącego na krawędziach uszu. Inkubować przez 15 minut. Przemyć ucho dwukrotnie około 5 ml buforu Ringera.
3. Zastosować odpowiednie przeciwciała drugorzędowe lub koniugaty streptawidyny (fluorofory o wysokiej długości fali wzbudzenia, takie jak 594 nm lub 647 nm, są korzystne dla obrazowania przyżyciowego) w stężeniu 10 μg/ml w całkowitej objętości 100 μl buforu blokującego do odsłoniętego ucha. Przykryj ucho szkiełkiem nakrywkowym i inkubuj przez 15 minut. Przemyć ucho dwukrotnie około 5 ml buforu Ringera.

4. Interakcja krwiopochodnych aktywowanych splenocytów z komórkami nowotworowymi in situ

1. 7 dni po zaszczepieniu czerniaka GFP-B16-F10 na tylnej skórze myszy kongenicznej, należy poddać zwierzę eutanazji i pobrać śledzionę. Wyizoluj splenocyty z mechanicznym rozerwaniem śledziony przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.
2. Oznaczyć splenocyty przez 8 minut w temperaturze 37 °C czerwonym barwnikiem cytoplazmy komórek CMTPX (1 μM w PBS), przemyć 4 razy w 15 ml w temperaturze 4 °C i natychmiast wstrzyknąć 200 μl wolnej pożywki surowicy do żyły ogonowej myszy, której uszy zostały zaszczepione B16-F10-GFP 7 dni wcześniej.

5. Obrazowanie przyżyciowe za pomocą mikroskopu stereoskopowego

1. W przypadku obrazowania krótkotrwałego (do 2 godzin) na unieruchomione ucho dodać świeżo przygotowany sterylny bufor askorbinianowo-Ringera zawierający 140 mM askorbinianu sodu, 10 mM HEPES, 4 mM KCl i 5 mM CaCl₂, przy pH 7,5 (końcowa osmolarność buforu askorbinianu-Ringera 320 mOsM). Zakryj ucho szkiełkiem nakrywkowym i rozpocznij obrazowanie za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego z soczewką 2X.
2. W przypadku długotrwałego obrazowania (ponad 2 godziny) należy umieścić wylot igły (podłączonej do zbiornika zawierającego bufor Ascorbine-Ringer) pod szkiełkiem nakrywkowym, w odległości około 0,5 cm od ucha. Użyć pompy perystaltycznej o prędkości 1 μl/min, aby stale dostarczać bufor askorbinianowo-Ringera do komory pod szkiełkiem nakrywkowym.
3. Zmień obiektyw 1X (odległość robocza 6 cm) na obiektyw 2X (odległość robocza 2 cm). Otwórz oprogramowanie do akwizycji i skonfiguruj ustawienia stereoskopu fluorescencyjnego. W ustawieniach aparatu wybierz 12 bitów jako głębię kolorów obrazu i dostosuj zakres wartości skali szarości kamery od 0% (minimum) do 5,1% (maksimum) i ustaw korekcję gamma na 2.
   1. Ustaw wzmocnienie akwizycji na 1 (minimum), intensywność fluorescencji na 1,000 (maksimum), powiększenie ustawione na 280X-320X i dostosuj czas ekspozycji, unikając prześwietlenia lub niedoświetlenia (czas ekspozycji powinien być krótszy niż 1 sekunda). W zależności od liczby pól obrazowania (zwykle od 10 do 20) odstęp czasu dla cyklu akwizycji powinien wynosić od 1 do 2 minut. Skrócenie czasu może powodować bielenie i fototoksyczność.
4. Wybierz kilka pól, które zawierają komórki nowotworowe, a także barwione białka ECM (takie jak na rysunku 3). Korzystając ze zmotoryzowanego stolika, uzyskuj obrazy odpowiednich kanałów fluorescencyjnych (takich jak GFP i fluorofor 647 na rysunku 3) w czasie (np. co 2 minuty).
5. Po eksperymencie poddaj mysz eutanazji zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dla zwierząt. W takim przypadku, pod koniec eksperymentu, należy poddać znieczuloną mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, a następnie wykrwawienie (perfuzja wewnątrzsercowa).

6. Obrazowanie przyżyciowe za pomocą mikroskopu wielofotonowego

1. Za pomocą smaru silikonowego zbuduj wokół ucha okrągłą ściankę o średnicy około 2 cm i wysokości 2-3 mm, zaczynając od podstawy ucha. Upewnij się, że nie ma żadnych nieszczelności. Wypełnij okrąg buforem askorbinianowo-Ringera.
2. Umieść mysz na scenie i podłącz poduszkę grzewczą (37 °C).
3. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i skonfiguruj ustawienia mikroskopu wielofotonowego.
4. Wybierz maksymalnie cztery różne pola, które zawierają komórki nowotworowe i barwione białka ECM (takie jak na rysunku 3). W tym przykładzie dostrój laser Ti-Saphire do 850 nm dla sygnału GFP, a następnie pojedynczego fotonu 647 do barwienia fluoroforem 647 i wizualizuj fibrylarne kolageny za pomocą SHG. Uzyskanie obrazów odpowiednich kanałów fluorescencyjnych (takich jak GFP i fluorofor 647 na rysunku 3) oraz generowania drugiej harmonicznej w czasie, np. co 2 minuty, przy zanurzeniu w wodzie HCX APO 20X z soczewką 1,00 NA i odległością roboczą 2 mm.
5. Po eksperymencie należy poddać znieczuloną mysz eutanazji ze zwichnięciem szyjki macicy, a następnie wykrwawieniu (perfuzja wewnątrzsercowa).

Wyniki

Do tej pory barwienia immunocytochemicznego w żywej tkance zazwyczaj nie stosowano ze względu na tworzenie kompleksów immunologicznych, co prowadziło do wysokiego tła barwienia oraz immunotoksyczności²⁰. Problem ten rozwiązano poprzez wstępne blokowanie receptorów Fcγ na makrofagach tkankowych, co „uśpiło” te komórki w obliczu następującego po tym silnego pośredniego barwienia immunocytochemicznego. Ponieważ znakowanie odbywało się zewnątrzkomórkowo, fototoksyczność i blaknięcie fluoroforu można było kontrolować poprzez zanurzenie tkanki w naturalnym antyoksydacyjnym buforze izosmotycznym z kwasem askorbinowym (Ryc. 1A). Od czasu naszego pierwotnego opisu tej metody⁵ udoskonaliliśmy technikę przeciwdziałania blaknięciu i fototoksyczności w taki sposób, że fotoblaknięcie można obecnie nie tylko hamować, ale całkowicie zapobiegać mu (Ryc. 1B). Osiąga się to poprzez zanurzenie ucha w dużej objętości antyoksydantu (100 μl) wewnątrz komory, w której ucho jest unieruchomione. Należy zauważyć, że 300 sekund stałego czasu obrazowania odpowiada 10 godzinom obrazowania, gdy zdjęcia są zbierane przez 500 msec w każdej minucie (średnie ustawienia obrazowania).

Rysunek 1. Fotoblaknięcie i fototoksyczność zostały zatrzymane poprzez zastąpienie chlorków askorbinianem w buforze Ringera i zanurzenie eksponowanego ucha w 100 μl tej substancji. (A) Tkankę barwiono najpierw biotynilowanym przeciwciałem przeciwko kolagenowi IV, składnikowi błony podstawnej. Barwienie wykryto następnie za pomocą streptawidyny-647 (czerwony), a następnie obrazowano w sposób ciągły przez 300 sekund w normalnym buforze Ringera (panel górny) lub buforze Ringera z askorbinianem (panel dolny). Należy zauważyć, że 300 sekund ciągłego obrazowania odpowiada 10 godzinom obrazowania w przypadku gromadzenia obrazów przez 500 msec w każdej minucie (standardowe ustawienia obrazowania). 25% najjaśniejszych wartości intensywności pikseli zaznaczono kolorem zielonym. (B) Ilościowe określenie spadku immunofluorescencji (50% w buforze Ringera vs. 0% w buforze Ringera z askorbinianem). Wartości znormalizowano do początkowej fluorescencji. Obrazy wykonane za pomocą stereomikroskopu immunofluorescencyjnego. Pasek skali w A, 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Badanie interakcji między przerzutowymi komórkami nowotworu a zrębem guza jest kluczowe dla zrozumienia procesu migracji komórek nowotworowych i odporności przeciwnowotworowej. Wynika to z faktu, że zrąb związany z nowotworem stanowi do 90% masy guza i aktywnie reguluje jego wzrost oraz rozprzestrzenianie się przerzutów²¹. Brakuje jednak mechanistycznego wglądu w to, w jaki sposób macierz kieruje migracją komórek nowotworowych w stronę naczyń limfatycznych lub krwionośnych ²². Jest to częściowo spowodowane tym, że obrazowanie intravitalne białek macierzy ogranicza się do wizualizacji dojrzałych włókien kolagenów włóknistych przy użyciu generowania drugiej harmoniki w mikroskopii dwufotonowej²³. Dlatego dostosowaliśmy naszą metodę wizualizacji mikrośrodowiska tkankowego, obejmującą naczynia krwionośne i limfatyczne, perycyty, nerwy, mięśnie i adipocyty, aby umożliwić bezpośrednią wizualizację składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Wiele struktur można odróżnić na podstawie ich morfologii po immunobarwieniu na składniki błony podstawnej, takie jak kolagen IV lub perlekan (Rys. 2A), jednak bezpośrednie barwienie na specyficzne markery powierzchni komórkowych, np. Lyve1 (Rys. 2B i C) i podoplaninę (Rys. 2C), pozwala dodatkowo odróżnić wczesne naczynia limfatyczne kapilarne (Lyve1⁺) od naczyń limfatycznych zbiorczych (Lyve1^-). Barwienie na związany z macierzą CCL21 w skórze ujawniło złogi tej chemokiny na błonie podstawnej naczyń limfatycznych zbiorczych, zidentyfikowanych za pomocą barwienia na perlekan, proteoglikan siarczanu heparanu (Rys. 2D).

Rysunek 2. Przykłady barwienia żywych tkanek w normalnych uszach myszy. (A) Barwienie na perlekan, składnik błony podstawnej, obrazuje wszystkie naczynia krwionośne i limfatyczne, nerwy, włókna mięśniowe oraz adipocyty. (B) Barwienie Lyve1 znakuje początkową sieć naczyń włosowatych limfatycznych. (C) Podwójne barwienie na Lyve1 i podoplaninę, pan-marker limfatyczny, obrazuje sieci naczyń limfatycznych początkowych i zbiorczych. Grzbietowa skóra właściwa ucha może być obrazowana za pomocą klasycznej mikroskopii epifluorescencyjnej (bez sekcjonowania optycznego), ponieważ skóra właściwa ucha zawiera niewielką liczbę adipocytów, które w przeciwnym razie przesłoniłyby pole obrazowania. (D) Barwienie CCL21 (zielone) na błonie podstawnej naczyń limfatycznych barwionej na perlekan (czerwone). Obrazy zebrane przy użyciu stereomikroskopu immunofluorescencyjnego. Paski skali na A i B, 1 mm; na C, 100 μm oraz na D, 50 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Co najważniejsze, można zwizualizować białka strukturalne, których zazwyczaj nie da się wykryć za pomocą SHG, klasycznej metody detekcji macierzy²³. Na przykład stwierdzono, że tenascyna C (Rys. 3A), białko macierzy ekspresowane podczas tumorigenzy, gojenia ran i stanu zapalnego¹⁹, jest osadzana w innych obszarach zrębu guza niż kolageny włókniste (Rys. 3B). Ta heterogenność macierzy może wpływać na rozmieszczenie komórek nowotworowych oraz przerzutowanie (Rys. 3C).

Rysunek 3. Obrazowanie na żywo skóry grzbietowej ucha za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Pojedyncze pole widzenia guza B16-F10. Stroma guza została oznakowana przeciwciałem przeciwko tenascynie C, a barwienie wykryto za pomocą przeciwciała osiołkowego anty-koziego-594. Immunofluorescencję sieci tenascyny C (czerwony) pokazano w A, a kolageny włókniste wykryte za pomocą generacji drugiej harmonicznej (SGH) w B. Te dwie sieci są nałożone na komórki nowotworowe (cyjan) w C (merged). Nowa macierz guza oznakowana tenascyną C nie pokrywa się z kolagenami włóknistymi wykrytymi za pomocą SHG (zielony). Obraz z 44-krotnie uśrednionymi przekrojami z (z-sections) z krokiem z 1.0 μm został pozyskany w trybie 16-bitowej głębi kolorów. Obrazy zebrano za pomocą mikroskopu dwufotonowego. Pasek skali, 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Po immunoznakowaniu różnych składników macierzy nowotworowej (np. tenascyny C i kolagenu IV) zidentyfikowano ograniczone i gwałtowne zdarzenia kierunkowego przebudowywania macierzy nowotworowej (Wideo 1). Siły powstające w mikrośrodowisku nowotworu mogą prowadzić do ekspansji lub kurczenia się macierzy nowotworowej, a w konsekwencji do przebudowy i wydłużania naczyń krwionośnych guza w stopniu podobnym do tego, który wykazaliśmy wcześniej w przypadku gojących się ran^11,24.

Wideo 1. Ekspansja macierzy guza znakowanej kolagenem IV (czerwony) i tenascyną C (cyjan) wydłuża naczynia krwionośne (strzałka) i pasywnie przemieszcza trzy komórki nowotworowe (zielone). Zlokalizowany skurcz macierzy guza bogatej w tenascynę C przemieszcza naczynie krwionośne (struktura o orientacji poziomej, czerwona) o około 100 μm podczas 12 godzin obrazowania. Obrazy zarejestrowane za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo.

Stosowanie mikroskopii wielofotonowej z etykietowaniem fluoroforami jest problematyczne, ponieważ strumień fotonów wykorzystywany w tych eksperymentach szybko powoduje blaknięcie barwników fluorescencyjnych, które nie są chronione przed utlenianiem²⁵. Tutaj wykazujemy, że możemy przeprowadzić dwufotonową mikroskopię time-lapse, jednocześnie obrazując immunoznakowaną macierz tenascyny C przy minimalnym fotoblaknięciu fluoroforów, nawet w dwufotonowej mikroskopii o wysokiej gęstości fotonów (Film 2).

Wideo 2. Niskopoziomowe fotoblaknięcie immunofluorescencji tenascyny C (czerwień) podczas mikroskopii dwufotonowej. Komórki nowotworowe B16-F10-GFP (cyjan) obrazowano w otwartym grzbiecie ucha 9 dni po inokulacji. Sygnał fluorescencyjny zabezpieczono poprzez aplikację buforu Ringer’a z askorbinianem na obrazowaną tkankę. Generacja drugiej harmonicznej (zieleń) nie nakłada się na nową macierz reprezentowaną przez tenascynę C. Przez 15 min pozyskiwano obraz o 16-bitowej głębi koloru, składający się z 11 czterokrotnie uśrednionych przekrojów z w osi z z krokiem 1,9 μm. Obrazy zbierano co 1 minutę i 5 sekund w 6 wybranych płaszczyznach z. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo.

Obrazowano również interakcje komórek odpornościowych z przerzutowymi komórkami nowotworowymi. Splenocyty znakowane CMTPX pochodzące z myszy z nowotworem przeniknęły przez naczynia krwionośne związane z guzem 8 godzin po transfuzji dożylnej, zainfekowały macierz nowotworową i aktywnie oddziaływały z komórkami nowotworowymi, tworząc trwałe kontakty międzykomórkowe (Video 2). Struktury kolagenu IV znakowane fluoroforem 647 były odporne na fotowybielanie podczas 12 godzin obrazowania.

Wideo 3. Interakcja splenocytów znakowanych CMTPX z myszy z nowotworem (B16-F10) z pojedynczymi komórkami nowotworowymi (GFP-B16-F10). Splenocyty przetoczono dożylnie po barwieniu tkanki na kolagen IV. Kolagen IV – zielony (647), splenocyty – czerwone (CMTPX), B16-F10 – cyjan (GFP). Obrazy zarejestrowano za pomocą stereomikroskopu immunofluorescencyjnego. Czas trwania wideo 12 godzin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić wideo.

Świeżo wyizolowane komórki nowotworowe nałożono na odsłoniętą skórę właściwą ucha, uprzednio zabarwioną na kolagen IV. Zaobserwowano, że po adhezji do tkanki niektóre grupy komórek rozpoczęły migrację zbiorową wzdłuż błony podstawnej naczyń krwionośnych i adipocytów.

Wideo 4. Komórki nowotworowe migrują wzdłuż błon podstawnych. Normalna skóra ucha barwiona na kolagen IV (647, czerwony) została pokryta świeżo pasażowanymi komórkami B16-F10-GFP i obrazowano przez 5 godzin. Niektóre komórki nowotworowe, które przylgnęły do tkanki, rozpoczęły migrację zbiorową wzdłuż błony podstawnej naczyń krwionośnych i adipocytów. Obrazy zarejestrowano za pomocą stereomikroskopu immunofluorescencyjnego. Czas trwania wideo: 5 godzin. Kliknij tutaj, aby obejrzeć wideo.

Ponadto, ponieważ skóra ucha jest praktycznie dwuwymiarowa, mogliśmy z łatwością zebrać duże ilości danych, wykorzystując szybką stereomikroskopię fluorescencyjną zamiast wolniejszej i droższej mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej. Możliwe jest jednak zastosowanie dowolnej z wymienionych metod mikroskopii skanującej w naszych preparatach IF in vivo (Ryc. 3, Video 1).

Dyskusja

Znaczenie

W tym artykule przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii przyżyciowej, które umożliwia wysoką rozdzielczość i dynamiczną wizualizację różnych składników mikrośrodowiska tkankowego, w tym białek fibrylarnych i białek macierzy przypominających siatkę. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z obecnymi technikami obrazowania przyżyciowego: (i) Obrazowanie fluorescencyjne przyżyciowe było stosowane w badaniach mikrokrążenia, np. do śledzenia wycieku substancji rozpuszczonej z krwi lub do układu limfatycznego, ale nie było łączone z barwieniem immunologicznym. (ii) Wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych myszy reporterowych pozwala na obrazowanie określonych typów komórek, ale wymaga ich dostępności (lub znacznego wysiłku w celu stworzenia nowych) i ogranicza liczbę oddziałujących typów komórek, które można badać. (iii) Macierz zewnątrzkomórkowa może być obrazowana in vivo przy użyciu generacji drugiej harmonicznej, ale ta technika może wykryć tylko kolageny włókniste, pozostawiając dużą liczbę ważnych składników zewnątrzkomórkowych, takich jak błony podstawne, fibronektyny, tenascyny, czynniki wzrostu, chemokiny i glikozaminoglikany tkankowe poza zasięgiem obecnych badań. Nasza metoda przezwycięża te ograniczenia i pozwala na włączenie standardowych technik obrazowania i dalsze łączenie ich z barwieniem immunologicznym dla innych typów komórek, struktur tkankowych, złogów czynników wzrostu wiążących siarczan heparyny (np. VEGF²⁶) i chemokin (CCL21^5,18i ryc. 2D) lub białek macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnym śledzeniu przepływów krwi i/lub limfy.

Ograniczenia

Obrazowanie epifluorescencyjne przyżyciowego IF ogranicza się do cienkich płatów skórnych, pozbawionych grubej tkanki podskórnej (tkanki tłuszczowej). Chociaż stwierdziliśmy, że skóra właściwa ucha grzbietowego jest optymalna do stosunkowo nieszkodliwego chirurgicznego odsłaniania skóry ucha, epifluorescencja z techniką IF przyżyteczną nie ogranicza się do skóry właściwej ucha i może być potencjalnie stosowana np . do odsłoniętej skóry palców u nóg lub skóry grzbietu nowonarodzonej myszy. Szybkie barwienie przeciwciał (15 minut) w immunofluorescencji IF nie jest zależne od biernej dyfuzji, ale wymaga funkcjonalnego drenażu limfatycznego i przepływu płynu śródmiąższowego, stąd nie można zaobserwować barwienia, jeśli naczynia limfatyczne są niedrożne²⁷. W związku z tym naczynia limfatyczne barwią się silniej niż nieszczelne naczynia krwionośne (uszkodzone naczynia, tętniczki)⁵. Rozdzielenie płatów skórnych ucha grzbietowego i brzusznego jest łagodnym zabiegiem chirurgicznym, ale powoduje uszkodzenie niektórych naczyń włosowatych i śmierć komórek różnych komórek tkankowych. Może to stanowić problem, gdy trzeba zbadać całkowicie nienaruszoną tkankę, np . patrząc na łagodny wpływ leków na przeżycie komórek. Również stosowanie antyoksydantu, który służy ochronie skóry przed fototoksycznością i fotowybielaniem, wyklucza stosowanie techniki immunofluorescencji przyżyciowej do badania np . stresu oksydacyjnego tkanek lub biologii tlenku azotu.

Wreszcie, zaślepienie makrofagów rezydujących w tkankach kompleksami immunologicznymi może aktywować te komórki i wpływać np . na badanie odpowiedzi immunologicznej tkanek i aktywacji komórek dendrytycznych.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Aby zbadać stres oksydacyjny tkanek lub biologię tlenku azotu, askorbinian musi zostać zastąpiony innymi pożywkami kompatybilnymi z tkankami, które nie zakłócają wyników eksperymentu. Podobnie, należy unikać blokowania receptorów Fc na komórkach odpornościowych skóry, jeśli celem badania jest funkcja i aktywacja odpowiedzi immunologicznej tkanek oraz aktywacja i migracja komórek dendrytycznych. Można to osiągnąć za pomocą przeciwciała drugorzędowego z rozszczepionym fragmentem Fc (fragmenty przeciwciała F(ab)2) lub za pomocą przeciwciała biotynylowanego i fluorescencyjnej streptawidyny jako odczynników wykrywających.

Przyszłe zastosowania

Przedstawiamy nowatorską i unikalną technikę przyżyciowego IF do obrazowania niefibrylarnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej w przeszczepialnych nowotworach skóry w połączeniu z wykrywanymi przez SHG fibrylarnymi i dojrzałymi kolagenami przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Jedną z zalet stosowania mikroskopii wielofotonowej (lub konfokalnej) w porównaniu z obrazowaniem epifluorescencyjnym jest możliwość z-stackingu, a co za tym idzie przestrzennej kolokalizacji zdarzeń zachodzących w obrębie macierzy zewnątrzkomórkowej, np. wewnątrznaczynienia guza do naczynia limfatycznego lub krwionośnego, co w przypadku standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej można wywnioskować jedynie ze zmian morfologicznych inwazyjnej komórki. Ta technika ma znacznie szerszy potencjał. Na przykład użyliśmy przyżyciowego IF do zbadania mechanizmu niedrożności limfy za pomocą limfatycznej terapii fotodynamicznej²⁷. Dodatkowe potencjalne zastosowania tej metody obejmują m.in. badanie odporności skóry podczas stanu zapalnego, mechanizmu odrzucania przeszczepu czy metod wzrostu krwi i naczyń limfatycznych w okresie nowotworzenia.

Krytyczne etapy procedury

Najważniejszym krokiem, który ma kluczowe implikacje dla utrzymania fizjologicznego środowiska tkankowego, jest chirurgiczne oddzielenie brzusznej skóry i chrząstki od grzbietowej skóry właściwej. Przecięcie lub zamknięcie głównej tętnicy lub żyły doprowadzi do nadmiernego krwawienia i miejscowego niedotlenienia tkanek, co wpłynie na odpowiedź komórkową na leczenie i ruch komórek⁸. Unieruchomienie ucha za pomocą kleju chirurgicznego powinno być wykonywane ostrożnie, ponieważ rozlanie kleju na odsłoniętą tkankę spowoduje trwałe uszkodzenie tkanki poprzez niedrożność naczyń krwionośnych. Temperatura myszy musi być kontrolowana i utrzymywana na poziomie 37 °C. Dodatkowo do znieczulenia izofluranem należy użyć nawilżonego tlenu, aby oczy i płuca pozostały odpowiednio nawilżone podczas eksperymentu. Ponadto askorbinian sodu musi być przygotowany na świeżo, a jego pH sprawdzone przed użyciem.

Podsumowując, ta immunofluorescencja przyżyciowa łączy lokalne, w czasie rzeczywistym pomiary funkcji fizjologicznych z obrazowaniem molekularnym złożonych zdarzeń komórkowych w skórze myszy. Co więcej, metoda ta ma ogromny potencjał, ponieważ może być łatwo zastosowana np . do badania porozwojowych mechanizmów angiogenezy krwi i limfy lub do wizualizacji wczesnych faz infekcji skóry różnymi czynnikami chorobotwórczymi. Dzięki swojej elastyczności i wysokiemu potencjałowi przepustowości, ta technika przyżyciowe może znacząco przyczynić się do rozwoju wielu dziedzin biologii.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy Szczep
BALB/C myszy (8-12 tygodni) Charles	River		, Francja
Myszy C57 / Bl6 (8-12 tygodni)	Harlan		Carshalton
UK Cell Line
B16 F10 Czerniak wykazujący ekspresję OVA-GFP
Utrzymanie znieczulenia
Izofluoran	Minrad Inc.	2222	Minrad Inc., Buffalo, Nowy Jork
Nawilżany system dostarczania	Rothhacher GmBH		Berne, Szwajcaria
System kontroli temperatury DC	FHC Inc		Bowdoin, MA
Mikroskop stereoskopowy
Stereoskop fluorescencyjny z zmotoryzowanym stolikiem.	M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Niemcy
Obiektyw 1X (powiększenie systemu liniowego od 7,5X do 160X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Niemcy
Obiektyw 2X (powiększenie systemu liniowego od 15,6X do 320X)	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Niemcy
Kamera DFC 350 FX sterowana przez oprogramowanie LAS AF	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Niemcy
Mikroskopia wielofotonowa
LEICA SP5, dwufotonowy mnożnik, zmotoryzowany stolik	Leica Microsystems CMS GmbH		Wetzlar, Niemcy
HCX APO 20X/1.2 immersyjny olejek
Kameleon Ultra Laser
Bufor Ringera (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM mleczan sodu)	B. Braun Medical AG	445968	Sempach, Niemcy
Aprotynina	Elastyna	AP92	Owensville, MO
Trombina	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	Taufkirchen, Niemcy
Askorbinian sodu	Sigma-Aldrich	11140-50G	Taufkirchen, Niemcy
Mysia surowica podniesiona przeciwko ludzkim IgG	Abcam	ab34834	Cambridge, Wielka Brytania
Kolagen IV	Abcam	AB6581	Cambridge, Wielka Brytania
Perlacan	RnD	ab79465	Minneapolis, MN
Tenascin C	RnD	AF3358	Minneapolis, MN
Podoplanin	RnD	AF3244	Minneapolis, MN
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	Wolfenbü ttel, Niemcy
CCL21	RnD	AF457	Minneapolis, MN
Streptawidyna Błękit Pacyficzny	Invitrogen	S11222	Grand Island, Nowy Jork
Streptavidin Alexa 647	Invitrogen	S21374	Grand Island, Nowy Jork
Streptavidin Alexa 488	Invitrogen	S11223	Grand Island, Nowy Jork
Osioł Anti Goat 594	Invitrogen	A21113	Grand Island, Nowy Jork
Osioł Anti Rabbit 594	Invitrogen	A21207	Grand Island, Nowy Jork
CMTPX CellTracker	Lifetechnologies	C34552	Carlsbad, Kalifornia
Histokryl (klej chirurgiczny)	Braun Aesculap	1050060	Tuttlingen, Niemcy
Odczynniki do hodowli komórkowych
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM	Gibco Invitrogen	E15-843	Grand Island, NY
Płodowa surowica bydlęca (FBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, NY
Trypsin	Gibco Invitrogen	25300062	Grand Island, NY
PBS	Gibco Invitrogen		Grand Island, Nowy Jork