Jednoczesny pomiar pH w przedziałach endocytarnych i cytozolowych w żywych komórkach przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Podsumowanie

Dostępnych jest kilka metod pomiaru pH wewnątrzkomórkowego, ale bardzo niewiele z nich pozwala na jednoczesny pomiar pH cytoplazmatycznego i organellarnego. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szybką i dokładną metodologię jednoczesnego pomiaru pH cytoplazmatycznego i pęcherzykowego za pomocą obrazowania ratiometrycznego żywych komórek.

Streszczenie

Wewnątrzkomórkowe pH jest ściśle regulowane i odnotowano różnice w pH między cytoplazmą a organellami¹. Regulacja pH komórkowego ma kluczowe znaczenie dla homeostatycznej kontroli procesów fizjologicznych, które obejmują: syntezę białek, DNA i RNA, transport pęcherzykowy, wzrost komórek i podział komórek. Zmiany w komórkowej homeostazie pH mogą prowadzić do szkodliwych zmian funkcjonalnych i sprzyjać postępowi różnych chorób². Dostępne są różne metody pomiaru pH wewnątrzkomórkowego, ale bardzo niewiele z nich pozwala na jednoczesny pomiar pH w cytoplazmie i organellach. W tym miejscu szczegółowo opisujemy szybką i dokładną metodę jednoczesnego pomiaru pH cytoplazmatycznego i organellarnego za pomocą mikroskopii konfokalnej na żywych komórkach³. Cel ten osiąga się dzięki zastosowaniu dwóch barwników ratiometrycznych wykrywających pH, które posiadają selektywny podział przedziałów komórkowych. Na przykład SNARF-1 jest podzielony na przedziały wewnątrz cytoplazmy, podczas gdy HPTS jest podzielony na przedziały wewnątrz organelli endosomalnych / lizosomalnych. Chociaż HPTS jest powszechnie stosowany jako cytoplazmatyczny wskaźnik pH, barwnik ten może specyficznie oznaczać pęcherzyki wzdłuż szlaku endosomalno-lizosomalnego po wchłonięciu przez pinocytozę^3,4. Za pomocą tych sond wykrywających pH można jednocześnie mierzyć pH w przedziałach endocytarnych i cytoplazmatycznych. Optymalna długość fali wzbudzenia HPTS różni się w zależności od pH, podczas gdy w przypadku SNARF-1 zmienia się optymalna długość fali emisji. Po załadowaniu SNARF-1 i HPTS komórki są hodowane w różnych roztworach skalibrowanych pod kątem pH w celu skonstruowania krzywej wzorca pH dla każdej sondy. Obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na eliminację artefaktów i szumów tła. Ze względu na właściwości spektralne HPTS, sonda ta lepiej nadaje się do pomiaru łagodnie kwaśnego przedziału endosomalnego lub do wykazania alkalizacji organelli endosomalnych / lizosomalnych. Metoda ta upraszcza analizę danych, poprawia dokładność pomiarów pH i może być wykorzystana do odpowiedzi na podstawowe pytania związane z modulacją pH podczas reakcji komórek na wyzwania zewnętrzne.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów do kalibracji pH komórkowego

1. Dodać następujące związki do pięciu oddzielnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml, aby przygotować 5 roztworów, które zostaną użyte do kalibracji:
   • NaCl (1 ml 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0,58 g w 10 ml H₂0)
   • KCl (6,75 ml z 1 M KCl) (1 M KCl = 0,75 g w 10 ml H₂0)
   • Glukoza (1 ml 1 M D-glukozy) ( 1 M D-glukoza = 1,80 g w 10 ml H₂0)
   • MgS0₄ (0,05 ml 1 M_MgSO4) (1 M_MgSO4 = 1,20 g w 10 ml H₂0)
   • 20 mM HEPES: (1 ml 1 M, HEPES) (1 M HEPES: = 2,38 g w 10 ml H₂0)
   • CaCl₂ (0,05 ml 1M CaCl₂) (1 M CaCl₂ = 1,47 g w 10 ml H₂0)
     Przygotować wszystkie roztwory w podwójnie destylowanym_H2O(ddH₂O).
2. Uzupełnić każdy roztwór 35 ml ddH₂O i mieszać mieszadłem magnetycznym aż do uzyskania roztworu.
3. Dostosuj pH każdego roztworu za pomocą 1 N KOH lub 1 N HCl, aby uzyskać wartości pH 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 i 7,5. Następnie dostosuj objętość wodą dejonizowaną do końcowej objętości 50 ml.
4. Odmierz 5 mg nigerycyny i dodaj ją do 670 μl absolutnego EtOH, aby przygotować 10 mM roztworu podstawowego nigerycyny.
   Uwaga: nigerycyna jest wysoce toksyczna i należy obchodzić się z nią bardzo ostrożnie (rękawice, okulary ochronne i maska). Mieszać roztwór przez odwrócenie, aż nigerycyna całkowicie się rozpuści.
5. Dodać 0,05 ml 10 mM nigerycyny (końcowe stężenie 10 μM) do każdego roztworu kalibracyjnego. Nigerycyna jest jonoforem, który zwiększa przepuszczalność błony komórkowej i powoduje równowagę wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego pH w obecności depolaryzującego stężenia zewnątrzkomórkowego K⁺.
6. Roztwory kalibracyjne mogą być przechowywane do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C

2. Przygotowanie komórek

1. Pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego, komórki nasienne w szalkach hodowlanych o wymiarach 35 mm x 10 mm w 2 ml pożywki wzrostowej uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą i antybiotykami. Użyj ilości komórek potrzebnej do zapewnienia około 50% zbieżności po 24 godz.
   UWAGA: W naszych eksperymentach używamy linii komórkowej HT-1080 i płytki 1 x 10⁵ komórek na naczynie hodowlane.
2. Określ liczbę szalek hodowlanych potrzebnych do eksperymentu i ułóż na talerzu 5 dodatkowych szalek hodowlanych, które zostaną użyte do kalibracji.
3. Umieścić szalki hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO₂ na co najmniej 24 godziny.

3. Przygotowanie sond wykrywających pH

1. Przygotować 1M roztwór podstawowy fluorescencyjnej sondy pH kwasu 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowego, soli trisodowej (HPTS/piranina) w ddH₂0. Roztwór ten musi być przechowywany w temperaturze pokojowej i chroniony przed światłem.
2. Przygotować roztwór podstawowy 1 mM octanu estru 5-(i-6)-karboksylowo-seminaftorodafluorowego acetoksymetylu (C-SNARF-1 AM; zwanego dalej SNARF-1), rozpuszczając 1 mg SNARF-1 w 1,76 ml DMSO. Dokładnie wymieszać przez wielokrotne pipetowanie. Roztwór SNARF-1 należy przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem.

4. Etykietowanie komórek

1. Szesnaście godzin przed obrazowaniem żywych komórek dodać 2 μl roztworu podstawowego 1M HPTS (stężenie końcowe 1 mM) do każdej szalki hodowlanej zawierającej 2 ml kompletnej pożywki.
2. Włóż naczynia hodowlane do inkubatora. Sonda HPTS jest nieprzepuszczalna dla komórek, dlatego do znakowania organelli sonda musi być wchłonięta przez pinocytozę. Ten warunek wymaga, aby inkubacje komórek z HPTS były przeprowadzane w pożywce hodowlanej uzupełnionej surowicą.
3. Po inkubacji z HPTS przemyć komórki dwukrotnie sterylnym PBS i dodawać 2 ml pożywki bez surowicy przez co najmniej 2 godziny. Inkubację z SNARF-1 należy przeprowadzić w pożywce bez surowicy, ponieważ surowica może uniemożliwić wychwyt sondy.
4. Dodać 10 μl 1 mM roztworu podstawowego SNARF-1 w celu uzyskania końcowego stężenia 5 μM i pozostawić komórki do inkubacji przez 20 minut w temperaturze 37 °C, w słabym świetle. Stężenie C-SNARF-1 i czas inkubacji mogą się różnić w zależności od typu komórki.
5. Pod koniec inkubacji przemyć komórki dwukrotnie w sterylnym PBS i dodać 2 ml pożywki bez surowicy.

5. Dodanie modulatorów pH

1. Aby ocenić, czy metoda może wykryć zmiany pH w komórkach, można zastosować różne odczynniki, które modulują pH wewnątrzkomórkowe:
   • Bafilomycyna A1, swoisty inhibitor V-ATPazy⁵
   • Wymiennik Na⁺/H⁺ izoforma 1 (NHE-1)⁶
   • NH₄Cl, słaba zasada, która zwiększa wewnątrzkomórkowe pH⁷
   1. Przygotować roztwory podstawowe wyżej wymienionych odczynników:
      • Bafilomycyna A1: dodać 10 μg bafilomycyny A1 do 160 μl DMSO, aby otrzymać roztwór podstawowy 100 μM
      • EIPA: dodać 25 mg EIPA do 1,67 ml metanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 50 mM
      • NH₄Cl: rozpuścić 0,53 g chlorku amonu w 10 ml ddH₂O, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.
      
      Uwaga: Wszystkie roztwory podstawowe muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C, z wyjątkiem bafilomycyny A1, która musi być przechowywana w temperaturze -20 °C i chroniona przed światłem.
   2. W oddzielnych naczyniach hodowlanych dodaj jeden z odczynników, jak opisano poniżej:
      • 2 μl 100 μM bafilomycyny A1 (stężenie końcowe 100 nM)
      • 1 μl 50 mM EIPA (stężenie końcowe 25 μM)
      • 40 μl 1M NH₄Cl (stężenie końcowe 20 mM)
   3. Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
2. Przejdź do akwizycji obrazu.

6. Specyfikacja mikroskopu do obrazowania żywych komórek i ustawień akwizycji

1. Wykonaj obrazowanie żywych komórek za pomocą obiektywu 40X zamontowanego na spektralnym odwróconym skaningowym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w zmotoryzowany stolik XY, komorę, w której mieszczą się naczynia hodowlane ze szklanym dnem w inkubatorze o kontrolowanym poziomie środowiskowym (temperatura, wilgotność, CO₂ ) inkubatorze.
2. Zastosowany tu instrument konfokalny (Olympus FV1000) wyposażony jest w:
   • Laser diodowy 405 nm
   • Laser argonowy o mocy 40 mW (458 nm, 488 nm, 515 nm)
   • Laser helowo-neonowy (543 nm)
   • Obiektyw fluorytowy 10X, NA0.4
   • Obiektyw LUCPLFLN 40X, NA0.60
   • Obiektyw olejowy PLAPONSC PLAN APO 60X, NA1.4
   • Lustro dichroiczne DM 405/458/488/543
   • Filtry dichroiczne SDM 560 i SDM 640
   • Filtr barierowy BA655-755
   • Rozdzielacz wiązki BS20/80
   • Oprogramowanie do analizy danych do akwizycji i analizy obrazu,
3. Po ogrzaniu inkubatora do temperatury 37 °C i ustawieniu mikroskopu, umieścić naczynie hodowlane uprzednio inkubowane z HPTS i SNARF-1 w komorze obrazowania stopnia konfokalnego.
4. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania dostosuj ustawienia pobierania oprogramowania Rysunek 1.
   • Skonfiguruj dwa zestawy kanałów wirtualnych.
   • Rozpocząć pierwszą fazę, która odpowiada wzbudzeniu HPTS przy 405 nm i odbiorowi emisji przy 505 - 525 nm oraz wzbudzeniu SNARF-1 przy 543 nm i odbiorowi emisji przy 570 - 600 nm.
   • Rozpocząć drugą fazę, która odpowiada wzbudzeniu HPTS przy 458 nm i odbiorowi emisji przy 505 - 525 nm oraz wzbudzeniu SNARF-1 przy 543 nm i odbiorowi emisji przy 640 - 650 nm.
   • Przysłona konfokalna jest domyślnie ustawiona na 175 μm, a optymalna przysłona musi być ustawiona ręcznie na 300 μm.
   • Zrób zdjęcie, układając szeregowe poziome sekcje optyczne (800 x 800 pikseli) o grubości 0,4 μm.

UWAGA: Obiektyw 40X jest przydatny do obserwacji kilku komórek jednocześnie i dobrze sprawdza się przy oglądaniu organelli. Jednak rozdzielczość przestrzenną i intensywność sygnału można lepiej osiągnąć przy użyciu obiektywu olejowego 60X. Ponadto nie ma przesłuchów wzbudzenia ani emisji między tymi dwoma barwnikami.

7. Kalibracja sond wykrywających pH

1. Przed kalibracją należy usunąć pożywkę z naczynia hodowlanego uprzednio inkubowanego z HPTS i SNARF-1, przemyć dwukrotnie sterylnym PBS, a następnie dodać 2 ml jednego z pięciu roztworów kalibracyjnych.
2. Umieść naczynie hodowlane w komorze stopnia konfokalnego.
3. Przejdź do akwizycji obrazu poklatkowego zgodnie z następującymi ustawieniami:
   1. Ustaw liczbę obrazów i czasy trwania interwałów dla eksperymentu.
      UWAGA: Zazwyczaj używamy 1-minutowego interwału między obrazami do 30 minut.
   2. Zaprogramuj migawkę tak, aby zamykała się między rejestracją każdego obrazu.
4. Zapisz intensywność fluorescencji na minutę w arkuszu kalkulacyjnym i określ czas, w którym intensywność fluorescencji jest stała. Wewnątrzkomórkowe pH jest zwykle stabilne po 15 - 20 minutach.
5. Powtórzyć kroki od 7.1 do 7.4, używając nowej płytki hodowlanej dla każdego pozostałego roztworu kalibracyjnego.

8. Akwizycja danych

1. Po wykonaniu kalibracji pobierz dane próbki z 4-5 losowo wybranych pól zawierających 15-20 komórek na pole. Dla każdego pola uzyskuje się dwa obrazy: jeden dla znakowania HPTS (pęcherzyki), a drugi dla znakowania SNARF-1 (cytozol).
2. Fluorescencja tła (obszar zewnątrzkomórkowy) jest cyfrowo odejmowana od obrazów fluorescencyjnych obu sond. Oznaczone pęcherzyki i cytozol z odpowiednich zapisanych obrazów są wybierane za pomocą maski binarnej. Dla każdej sondy wykrywającej pH intensywność fluorescencji jest mierzona w skali numerycznej (skala szarości 0-4,095). Obliczana jest średnia intensywność dla wszystkich pikseli w organelli lub cytoplazmie, a wartości są wykorzystywane do obliczania współczynników fluorescencji.

9. Analiza danych

1. Na rynku dostępne są różne pakiety oprogramowania do analizy danych. tj. oprogramowanie Fluoview.
2. W arkuszu kalkulacyjnym zapisz wartości i oblicz współczynniki fluorescencji w następujący sposób: w przypadku HPTS R = (F_{458 nm}/F_{405 nm}), a w przypadku SNARF-1 R = (F_{644 nm}/F_{584 nm}).
3. Wykreślaj dane za pomocą naukowego oprogramowania do tworzenia wykresów, takiego jak GraphPad Prism. Wykres powinien przedstawiać współczynniki fluorescencji (oś Y) w funkcji pH (oś X). Dopasowanie krzywej uzyskuje się za pomocą regresji nieliniowej.
4. Zebrać intensywności fluorescencji próbek zgodnie z opisem w kroku 8.2 i obliczyć współczynniki fluorescencji. Użyj krzywych kalibracyjnych, aby przekształcić proporcje w wartości pH.

Wyniki

Do jednoczesnego pomiaru pH w przedziałach wewnątrzkomórkowych oraz endosomalnych/lizosomalnych wykorzystano ratiometryczne fluorescencyjne sondy pH SNARF-1 oraz HPTS. Sonda SNARF-1 ogranicza się do przedziału cytozolowego, natomiast HPTS umożliwia ratiometryczny pomiar pH w przedziale endosomalnym/lizosomalnym. Inkubacja komórek z HPTS przez 16 h pozwala na jego selektywną lokalizację w endosomach/lizosomach⁴. Typowy przykład fluorescencji zarejestrowanej z komórek HT-1080 obciążonych sondami pH przedstawiono...

Dyskusja

Ilościowy pomiar pH w obrazowaniu żywych komórek różnych przedziałów komórkowych jest potrzebny do dokładnego pomiaru zmian pH w odpowiedziach komórek na wyzwania zewnętrzne. Jednak jedną z głównych przeszkód, które pozostają, jest łatwe i specyficzne celowanie w przedziały komórkowe. W związku z tym kilka badań podkreśliło zastosowanie HPTS jako wewnątrzkomórkowego wskaźnika pH wprowadzanego do komórek za pomocą elektroporacji lub mikroiniekcji^8-10. Techniki te mają poważne wady, a mianowicie elektroporacja p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Roztwory do kalibracji
Chlorek sodu	Fischer	L-11621
Chlorek potasu	Fischer	M-12445
D-Glukoza (dekstroza)	Fischer	D16-1
Siarczan magnezu	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Chlorek wapnia dwuwodny	Fischer	M-1612
Woda dejonizowana	N/A	N/A
Nigericin	Calbiochem	481990	Działa toksycznie przez drogi oddechowe lub w kontakcie ze skórą
Chronić przed światłem w temperaturze 4 & stopni; C
Naczynia hodowlane &puste; 35mm	BD Biosciences	354456
wykrywające
Kwas 8-hydroksypireno-1,3,6-trisulfonowy (HPTS)	Technologie życia	H-348	Przechowywać z dala od światła w temperaturze pokojowej
5-(i-6)-karboksynowy SNARF®-1, ester acetoksymetylowy, octan	Technologie życia	C-1271	Przechowywać z dala od światła i wilgoci w temperaturze -20 stopni; C
Dimetylosutlenek (DMSO)	Fischer	BP231-1	szkodliwy
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 100X
Chlorek potasu	Fischer	M-12445	20 g
Fosforan sodu jednozasadowy	Fischer	S369-1	115 g
Fosforan potasu jednozasadowy	J.T Baker	3246-01	20 g
Woda dejonizowana	NIE	DOTYCZY N/D	Doprowadzić do 1 l
Autoklawu i doprowadzić pH do 7,4
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1X
PBS 100X	N/A	N/D	50 ml
Chlorek sodu	Fischer	L-11621	40,5 g
Woda deoinizowana	N/A	N/D	Doprowadzić do 5 l
modulatory
Bafilomycyna A1	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-etylo-N-izopropylo)amiloryd (EIPA)	Sigma-Aldrich	A3085
Chlorek amonu	Fischer	A649-500

sondy pHpH