Artykuł metodologiczny

Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/51400

⸱

9 kwietnia 2014

 , 
1HIV Drug Resistance Program, National Cancer Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy cytotoksyczność komórkową i testy zakaźności w pojedynczej rundzie, które pozwalają na szybkie i dokładne badanie przesiewowe związków w celu określenia ich cytotoksyczności komórkowej (CC50) i wartości IC50 przeciwko WT i lekoopornemu HIV-1.

Streszczenie

Chociaż zatwierdzono wiele leków przeciw HIV, nadal występują problemy z toksycznością i opornością na leki. Wskazuje to na potrzebę identyfikacji nowych związków, które mogą hamować zakażenie powszechnymi lekoopornymi szczepami HIV-1 przy minimalnej toksyczności. Tutaj opisujemy skuteczny test, który można wykorzystać do szybkiego określenia cytotoksyczności komórkowej i skuteczności związku przeciwko WT i zmutowanym szczepom wirusa.

Pożądana docelowa linia komórkowa jest wysiewana na 96-dołkowej płytce i po 24 godzinnej inkubacji dodawane są seryjne rozcieńczenia testowanych związków. Nie są konieczne żadne dalsze manipulacje w przypadku testów cytotoksyczności komórkowej; w przypadku testów przeciwko HIV do komórek dodaje się z góry określoną ilość wektora WT lub lekoopornego wektora HIV-1, który wyraża lucyferazy. Cytotoksyczność mierzy się za pomocą testu luminescencji zależnego od ATP, a wpływ związków na zakaźność mierzy się, określając ilość lucyferazy w obecności lub braku przypuszczalnych inhibitorów.

Ten test przesiewowy trwa 4 dni i wiele związków może być badanych równolegle. Związki są badane w trzech egzemplarzach, a dane są normalizowane do poziomów zakaźności/ATP w przypadku braku związków docelowych. Technika ta zapewnia szybki i dokładny pomiar skuteczności i toksyczności potencjalnych związków anty HIV.

Wprowadzenie

Dostępność leków ukierunkowanych na kilka kluczowych etapów cyklu życia wirusa HIV-1 doprowadziła do skojarzonej terapii lekowej (zwanej wysoce aktywną terapią antyretrowirusową lub HAART), która znacznie poprawiła leczenie zakażeń HIV-1 i długoterminowe przeżycie pacjentów. HAART, który zazwyczaj wykorzystuje kombinacje dwóch nukleozydowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy (RT) oraz inhibitora proteazy lub nienukleozydowego inhibitora RT, przekształciła śmiertelną chorobę w stan trwający całe życie1-5. Jednak pomimo wielu sukcesów HAART w trwałym tłumieniu replikacji wirusa, ma on ograniczenia. HAART nie eliminuje wirusa HIV, więc pacjenci nie są wyleczeni, a terapia trwa przez całe życie. Istnieją problemy z toksycznością leków i pojawianiem się szczepów lekoopornych. Oporność może wystąpić na wszystkie zatwierdzone leki przeciw HIV, w tym nowo zatwierdzone leki, które są ukierunkowane na integrazę HIV (IN). Oporność na leki prawdopodobnie powstaje z powodu spontanicznych mutacji, które zachodzą podczas replikacji wirusa (wskaźnik błędów 3 x 10-5 mutacji/zasada/cykl replikacji)6. Kiedy pojawiają się mutacje w genach kodujących cele leków antyretrowirusowych, niewielki podzbiór tych mutacji doprowadzi do zmniejszenia podatności szczepu wirusa na leki. Aby uniknąć rozwoju oporności na leki, stężenia leków muszą być utrzymywane na poziomie, który w pełni hamuje replikację wirusa HIV. Słabe przestrzeganie schematu terapeutycznego zaostrza problem i może prowadzić do szybkiego rozwoju oporności7-9. Chociaż stężenia leków mogą się różnić u pacjentów ze względu na różne poziomy wchłaniania, metabolizmu, dystrybucji i wydalania, wysokie stężenia leków mogą prowadzić do toksyczności10. Ponieważ terapia jest kontynuowana przez całe życie pacjenta, istnieją poważne obawy dotyczące bezpieczeństwa dotyczące długoterminowej toksyczności leków antyretrowirusowych. Leki przeciwretrowirusowe powszechnie stosowane w HAART mogą mieć działania niepożądane i zdarzały się przypadki, w których skutki uboczne zagrażały życiu11-15. Problemy, jakie napotykają pacjenci w związku z rozwojem oporności i toksyczności, leżą u podstaw potrzeby opracowania nowych leków, które skutecznie blokują replikację powszechnie stosowanych lekoopornych szczepów wirusa przy niewielkiej lub zerowej toksyczności długoterminowej.

Dlatego istnieje potrzeba testu, który może szybko wykryć związki, które blokują kluczowe etapy cyklu życia wirusa. W tym miejscu opisujemy skuteczny test, który można wykorzystać do oceny cytotoksyczności związków i ich zdolności do szybkiego i skutecznego blokowania replikacji zarówno WT, jak i lekoopornych szczepów HIV. Test, którego używamy, jest podobny do testu, który został opracowany w celu badania przesiewowego pod kątem oporności na leki u wirusa wyizolowanego od pacjentów wwieku 16-18 lat.

Chociaż test może być używany bez modyfikacji do badań przesiewowych pod kątem związków, które mogą blokować odwrotną transkrypcję HIV, opiszemy użycie testu do oceny inhibitorów IN. IN jest niezbędnym enzymem wirusowym, który wprowadza wirusowe DNA do genomu komórkowego19. Chociaż opracowywanych jest wiele obiecujących inhibitorów IN, z których niektóre są obecnie w fazie badań klinicznych, tylko Isentress20,21 (znany również jako Raltegravir lub RAL), a ostatnio Elvitegravir (EVG)22 i Dolutegravir (DTG)23 zostały zatwierdzone przez FDA. Związki te są aktywne zarówno przeciwko podtypom HIV B, jak i innym niż B w hodowli komórkowej i u pacjentów24, Lokal mieszkalny 25. Jednak leczenie RAL selekcjonuje lekooporne mutanty HIV-1 IN, w tym Y143R, N155H i G140S/Q148H 24,26-31. N155H i G140S/Q148H zmniejszają również skuteczność EVG, co podkreśla potrzebę zaprojektowania i opracowania inhibitorów transferu nici IN drugiej generacji (INSTI), które są skuteczne przeciwko tym mutacjom oporności.

Protokół

1. Przygotowanie głównych zapasów

  1. Wykonać zapasy wzorcowe związków, które mają być testowane w DMSO. Przygotuj zapasy w standardowym stężeniu 20 mM.
    Uwaga: można użyć dowolnego stężenia powyżej 10 mM. Związki, które można wykorzystać jako kontrole pozytywne do walidacji tego testu, obejmują RAL, EVG i DTG.
  2. Upewnij się, że związki są rozpuszczone w DMSO, wielokrotnie wirując roztwory przez 15 sekund i inkubując w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przechowywać roztwory podstawowe 20 mM w ciemności w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

2. Przygotowanie 96-dołkowych płytek do badania przesiewowego

  1. Należy wybrać linię komórkową, która ma być badana (np. HOS lub TZM-bl) i zasiać 100 μl tych komórek o gęstości 4 x 104 komórek/ml (4 000 komórek/basenik) w pożywce (np. zmodyfikowanej pożywce Eagle's lub DMEM firmy Dulbecco uzupełnionej 5% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy nowonarodzonej cielętej, i penicylina (50 jednostek/ml) plus streptomycyna).

3. Generowanie zapasów wirusów

Wyprodukuj wirusa HIV o pseudonimie VSV-g poprzez transfekcję 293 komórek (jak pokazano na rysunku 1, krok 1)32-34.

  1. W dniu poprzedzającym transfekcję płytkować 293 komórki na szalkach o średnicy 100 mm o gęstości 1,5 x 106 komórek.
  2. W dniu transfekcji należy przetransfekować 293 komórki 16 μg wirusa HIV typu dzikiego lub zmutowanego (pNLNgoMIVR-ΔLUC) i 4 μg VSV (pHCMV-g) metodą fosforanu wapnia35.
  3. Około 6 godzin po dodaniu osadu fosforanu wapnia przemyć 293 komórki dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i inkubować ze świeżą pożywką przez 48 godzin. [DMEM uzupełniony 5% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy nowonarodzonych cieląt i penicyliny (50 jednostek/ml) plus streptomycyny (50 μg/ml)].
  4. Zebrać supernatanty zawierające wirusa poprzez usunięcie pożywki z szalek o średnicy 100 mm, sklarować supernatanty przez odwirowanie na niskiej prędkości przy 3 000 obr./min przez 10 minut, przefiltrować supernatanty przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 45 μm, potraktować supernatanty Turbo DNazą przez 30 minut w temperaturze pokojowej i rozcieńczyć supernatanty w pożywce w celu przygotowania w testach infekcji. Supernatanty wirusowe należy przechowywać zamrożone, w porcjach, w temperaturze -80 °C.
    Uwaga: ilość p24 w supernatancie określa się za pomocą zestawu do oznaczania immunoenzymu HIV-1 p24. Stężenie p24 służy do kontrolowania ilości wirusa w próbce. Około 500 ng wirusa dodaje się do komórek HOS posianych na szalkach o średnicy 60 mm w gęstości 1,5 x 105 komórek/szalkę w dniu poprzedzającym zakażenie. Po 48 godzinach inkubacji komórki są zbierane, zbierane przez wirowanie, przemywane i ponownie zawieszane w 100 μl PBS. Dodać równą ilość odczynnika do oznaczania genu reporterowego Luminescence i zmierzyć aktywność lucyferazy zgodnie z opisem w punktach 5.4.1 i 5.4.2. Na tej podstawie można dokonać odpowiedniego rozcieńczenia wirusa, jak omówiono w kroku 4.6.

4. Badanie przesiewowe złożone na płytkach 96-dołkowych

Przesiewaj każdy związek w trzech egzemplarzach i uśredniaj wyniki.

Uwaga: wpływ każdego związku na replikację wirusa jest korygowany przez normalizację do poziomu replikacji uzyskanego przy braku jakiegokolwiek związku.

  1. Określić empiryczny zakres stężeń, który ma być poddany badaniom przesiewowym.
    Uwaga: zazwyczaj sita z 11 seryjnymi rozcieńczeniami są wykonywane przez dodawanie związku do kolumny płytkowej po kolumnie, a sita z 7 seryjnymi rozcieńczeniami są wykonywane przez dodawanie związku po rzędach. Jeden potrójny zestaw studzienek musi być zarezerwowany dla kontroli bez związku. Ponadto jedna kolumna lub jeden wiersz musi pozostać pusty, aby działał jako kontrola negatywna/tła. Wreszcie, o tym, czy jest to test cytotoksyczności komórkowej czy zakaźności, będzie decydowało o tym, czy wirus zostanie dodany.
  2. Przygotować seryjne rozcieńczenia z roztworu podstawowego o stężeniu 20 mM. Stężenia dobiera się w zależności od empirycznie określonego zakresu stężeń, które mają być badane (jak pokazano w tabeli 1). Przygotować rozcieńczenia w pożywce o stężeniu 10-krotnym od pożądanego końcowego stężenia, tj. jeśli końcowe stężenie ma wynosić 100 μM, należy wykonać zapas roboczy o masie 1 mM.
    Uwaga: związki o IC50s powyżej 5-10 μM zwykle nie są dobrymi kandydatami do opracowania leków. We wstępnych testach testujemy związki tylko w stosunku do wektora WT. Obiecujące związki, które skutecznie hamują wektor WT, są następnie testowane pod kątem panelu mutantów opornych na leki.
  3. Wyjąć 96-dołkowe płytki z inkubatora i dodać seryjne rozcieńczenia badanych związków do studzienek w trzech dowartościach (jak pokazano na rysunku 1, krok 2).
    Uwaga: objętość dodana do studzienki powinna wynosić 1/10 objętości końcowego stężenia. W ten sposób dodać 22 μl/basenik (końcowa objętość po dodaniu wirusa wynosi 220 μl) do testów zakaźności. W przypadku testów cytotoksyczności dodać 11 μl/basenik (końcowa objętość wynosi 110 μl/basenik).
  4. Włożyć 96-dołkowe płytki z powrotem do inkubatora. W celu przeprowadzenia badania przesiewowego cytotoksyczności komórkowej inkubować 96-dołkowe płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i nie są potrzebne żadne dalsze manipulacje w Protokole 4: należy przejść do Protokołu 5. W przypadku testów zakaźności należy postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole 4.
  5. Tylko testy zakaźności. Wyjąć płytki z inkubatora po co najmniej 3 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C ze związkami, które mają być analizowane.
    Uwaga: pozwala to na wchłonięcie związku przez komórki przed zakażeniem wektorem HIV.
  6. Przygotować podstawowy rozcieńczenie wirusa33,34 (zwykle w stosunku 1:3), który wytworzy sygnał lucyferazy między 0,2-1,5 względnymi jednostkami lucyferazy (RLU) w komórkach nieleczonych. Cała płytka zajmie około 10 ml rozcieńczonego wirusa. Dodać 100 μl wirusa do każdej z studzienek, używając pipetora wielokanałowego z 8 lub 12 kanałami. Nie dodawaj wirusa do studzienek kontrolnych negatywnych/tła. Włóż płytki do inkubatora w temperaturze 37 °C na 48 godz.
    Uwaga: podstawowe rozcieńczenie wirusa w stosunku 1:3 jest typowym rozcieńczeniem, które wytwarza sygnał lucyferazy między 0,2 -1,5 RLU w oparciu o test p24 wykazujący, że stężenie wirusa w supernatancie wynosi około 500 ng w 1,0 ml.

5. Przygotowanie i pomiar cytotoksyczności i zakaźności na płytkach 96-dołkowych

  1. Odessać pożywkę ze studzienek (czerwień fenolowa w pożywce może zakłócać sygnał lucyferazy). Użyj szklanej pipety z końcówką do pipety o pojemności 200 μl przymocowaną do końca. Zacznij od góry nośnika i powoli przesuwaj się w dół w kierunku dolnego rogu studni. Nie spędzaj zbyt wiele czasu na dnie studni, ponieważ komórki mogą zostać usunięte ze studni.
  2. Do każdej studzienki dodać 100 μl PBS uzupełnionego 0,5 mM MgCl2. Należy to zrobić natychmiast po usunięciu pożywki, aby komórki nie wyschły.
  3. Tylko w przypadku testów cytotoksyczności dodać 5 ml buforu substratowego z testu wykrywania ATP luminescencji do każdej fiolki dostarczonego liofilizowanego odczynnika. Jedna fiolka wystarcza na płytkę 96-dołkową.
    1. Do każdej studzienki dodać 50 μl buforu do lizy komórek z testu detekcji luminescencji ATP. Potrząsaj 96-dołkową płytką z prędkością 700 obr./min w temperaturze pokojowej przez 5 minut za pomocą kompaktowego termomiksera.
    2. Dodać 50 μl odczynnika do oznaczania neutralności luminescencji ATP do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej/tła. Wstrząsać z prędkością 700 obr./min w temperaturze pokojowej przez 5 minut za pomocą kompaktowego termomiksera. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby dać czas na rozwinięcie sygnału.
    3. Odczytać 96-dołkową płytkę za pomocą luminometru mikropłytki.
      Uwaga: otwórz program luminometru mikropłytki SoftMax Pro. Upewnij się, że luminometr jest ustawiony na pomiar luminescencji przy czułości 5 odczytów/studzienkę.
  4. Tylko w przypadku testów zakaźności dodać 10 ml buforu substratowego z testu genu reporterowego luminescencji do każdej fiolki dostarczonego liofilizowanego odczynnika. Jedna fiolka wystarcza na każdą płytkę 96-dołkową.
    1. Dodać 100 μl odczynnika do testu genu reporterowego Luminescence do każdego dołka. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby dać czas na rozwinięcie sygnału.
    2. Odczytać 96-dołkową płytkę za pomocą luminometru mikropłytki, jak to opisano w sekcji 5.3.3.

6. Wyznaczanie wartości CC50 i IC50 dla związków

  1. Przenieś dane lucyferazy z luminometru mikropłytki do arkusza kalkulacyjnego Excel.
    1. Uśrednić zarówno dane lucyferazy w trzech egzemplarzach, jak i dane dotyczące tła/sygnału kontrolnego. Odejmij średni sygnał tła/kontrolny od średniego sygnału potrójnego dla całego zakresu stężeń.
    2. Znormalizować skorygowany w tle średni sygnał dla zakresów stężeń w zależności od aktywności, niezależnie od tego, czy jest to cytotoksyczność, czy zakaźność, przy braku jakiegokolwiek związku, aby określić procentową inhibicję.
      Uwaga: procentowe hamowanie definiuje się jako aktywność lucyferazy w obecności leku podzieloną przez aktywność lucyferazy przy braku leku pomnożoną przez 100.
  2. Użyj oprogramowania Kaleidagraph, aby uzyskać wartości CC50 i IC50
    1. Przenieś zarówno empirycznie określony zakres stężeń, jak i procentowe zahamowanie aktywności lucyferazy do Kaleidagraph.
    2. Wykreśl dane z zakresem stężeń na osi x i procentowym hamowaniem aktywności lucyferazy na osi y.

Wyniki

Jeśli test (Rysunek 1, kroki 1 i 2) został przeprowadzony pomyślnie, wartości lucyferazy powinny być zbliżone do danych przedstawionych w Tabeli 2. Należy przeanalizować zakres stężeń; potencjalnie silny związek wykaże wzrost aktywności lucyferazy od lewej do prawej strony, a kontrola powinna wykazywać najwyższą aktywność lucyferazy. Jeśli aktywność lucyferazy nie przekracza 0,1 Relative Luciferase Units (RLUs) w całym zakresie stężeń, zazwyczaj wskazuje to na to, że związek zabił komórki. Jeśli dane dotyczące lucyferazy są większe lub równe 2,0 RLUs we wszystkich rozcieńczeniach seryjnych, oznacza to, że związki nie były w stanie zahamować infekcji HIV-1 w testowanych stężeniach.

Przedstawienie zależności stężenia związków od procentowego zahamowania aktywności lucyferazy w programie Kaleidagraph (Tabela 3, część A), po przeprowadzeniu analizy regresji liniowej, pozwoli na uzyskanie wyników podobnych do tych przedstawionych w Tabeli 3, część B.

Schemat badania lucyferazy: transfekcja 293Ts, zbiór wirusa, infekcja komórek Hos, pomiar aktywności.
Rycina 1. Przygotowanie zapasów wirusa HIV-1 oraz konfiguracja testów cytotoksyczności komórkowej i jednorazowej zakaźności. W kroku 1 komórki 293T są transfekowane pNL4.3ΔEnv.LUC oraz VSV-G i inkubowane przez 48 hr w celu produkcji wirusa34. Wirus jest zbierany i przechowywany (zamrożony w aliquotach w temperaturze -80 °C) do czasu użycia w testach zakaźności. W kroku 2 komórki HOS są wysiewane na płytkę 96-dołkową i inkubowane przez 24 hr. Następnie komórki są preinkubowane z szeregowymi rozcieńczeniami testowanych związków przez 3 hr, a następnie infekowane wirusem (typu WT lub opornym na leki). Po 48 hr inkubacji mierzy się aktywność lucyferazy.

Tabela rozcieńczeń chemicznych, stężenia w mikromolach, przygotowanie eksperymentalne, dane laboratoryjne.
Tabela 1. Prototyp rozcieńczeń seryjnych w badaniach przesiewowych leków. Bardziej rygorystyczne badanie przesiewowe obejmuje 11 rozcieńczeń seryjnych, które zazwyczaj zaczynają się od 10 µM i kończą na 0,0005 µM. Rozcieńczenia seryjne przygotowuje się w stężeniu 10x (w każdej studzience znajduje się 100 µl komórek i 100 µl wirusa). Przy tej objętości i zgodnie z tymi obliczeniami, rozcieńczenia seryjne będą wystarczające dla 3 rzędów całej płytki 96-dołkowej. Testy cytotoksyczności przygotowuje się w podobny sposób; jednak 11 rozcieńczeń seryjnych zaczyna się od 250 μM i kończy na 0,05 μM. Do studzienek na płytce zawierających 100 μl komórek dodaje się tylko 11 μl rozcieńczeń. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Tabela danych z testu lucyferazy przedstawiająca sygnał zależny od stężenia oraz analizę % inhibicji.
Tabela 2. Odczyt danych sygnału lucyferazy oraz oznaczenie procentowej inhibicji aktywności lucyferazy. Tabela danych przedstawia typowy zestaw danych lucyferazy dla skutecznego związku. W tabeli zaprezentowano również dodatkowe obliczenia niezbędne do wyznaczenia procentowej inhibicji aktywności lucyferazy oraz wartości CC50 i IC50 . Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza krzywej inhibicji; wykres przedstawia % inhibicji w funkcji stężenia; wyświetlone równanie dopasowanego modelu danych.
Tabela 3. Tabela danych analizy regresji liniowej. Część A. Wykreślenie zakresu zastosowanych stężeń w stosunku do procentowej inhibicji aktywności lucyferazy w programie Kaleidagraph pozwoli na uzyskanie odpowiednich krzywych inhibicji. Część B. Krzywe inhibicji są zdefiniowane przez 3-parametryczną funkcję sigmoidalną i dopasowane do danych za pomocą analizy regresji liniowej18. Tabela danych ta jest następnie wykorzystywana w programie Microsoft Excel do obliczenia stężeń leku wymaganych do zahamowania integracji wirusa oraz cytotoksyczności komórkowej o 50%, np. IC50 i CC50. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Opisujemy szybki, wydajny i powtarzalny test, który może być stosowany do badań przesiewowych związków pod kątem cytotoksyczności i ich zdolności do hamowania replikacji zarówno WT, jak i lekoopornego HIV-1. Zdolność do szybkiej identyfikacji związków i testowania ich skuteczności i cytotoksyczności ma kluczowe znaczenie w opracowywaniu nowych i ulepszonych leków przeciwko HIV-1. Po zidentyfikowaniu związków ołowiu można wyprodukować i przetestować analogi związku ołowiu przy użyciu tego samego testu. Test jest stosunkowo prosty. Istnieją zarówno kontrole pozytywne, jak i negatywne, które pozwalają użytkownikowi zdiagnozować najczęstsze problemy (związki toksyczne, problemy z zasobem wektora). Użycie potrójnego zestawu studzienek bez dodatku związku pokazuje, że doszło do infekcji wirusowej. Fakt, że cytotoksyczność jest mierzona w niezależnym teście, pozwala uniknąć błędnej interpretacji zmniejszenia lucyferazy spowodowanego cytotoksycznością jako specyficznego wpływu na replikację wirusa.

Krytycznymi krokami w protokole jest przygotowanie płytek tak, aby komórki były równomiernie rozmieszczone w studzienkach, aby studzienki miały odpowiednie stężenia związków do testowania, dodanie tej samej ilości wirusa do każdej ze studni i pomiar aktywności lucyferazy w celu określenia wartości CC50 i IC50 .

Test jest bezpieczny, ilościowy i powtarzalny. Test jest bezpieczny, ponieważ wektor jest wadliwy w replikacji. Test jest ilościowy i powtarzalny, ponieważ opiera się na pojedynczym okrągłym wektorze, który wyraża lucyferazę, którą można dokładnie i wygodnie oznaczyć. W wielorundowym teście replikacji wirusa zmierzona IC50 zależy od liczby cykli życiowych wirusa; Jest to szczególny problem, gdy testy obejmują zarówno wirusy oporne na WT, jak i lekooporne, które mogą mieć znacznie różne zdolności replikacji.

Wcześniej zgłoszono kilka testów enzymatycznych, które można wykorzystać do badań przesiewowych na obecność inhibitorów IN. Testy, które wykorzystują technologię PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru zintegrowanego DNA, wymagają oczyszczonych rekombinowanych białek i są na ogół zarówno bardziej pracochłonne, jak i kosztowne36,37. Chociaż możliwe jest stosowanie testów enzymatycznych do pomiaru wpływu związków na inne enzymy wirusowe (RT i proteazę), każdy enzym wymaga własnego systemu testów. Test z jednym okrągłym wektorem, jak opisano, może być stosowany, bez modyfikacji, do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów RT. Podobny test można zastosować do badań przesiewowych w kierunku inhibitorów proteazy; Jednak w teście inhibitora proteazy związki muszą zostać dodane do komórek używanych do produkcji wektorów. Pokrewny test, wykorzystujący różne komórki i wektory, może być również wykorzystany do badań przesiewowych pod kątem otoczki (env) i inhibitorów fuzji wnikania wirusa HIV. Wreszcie, test może być stosowany, na większą skalę, za pomocą zautomatyzowanych dozowników zrobotyzowanych. W związku z tym test może być stosowany do badań przesiewowych dużych bibliotek związków przeciwko WT i zmutowanemu wirusowi HIV. Jednak fakt, że test może wykryć inhibitor replikacji wirusa HIV, który działa na różnych etapach cyklu życiowego wirusa, wskazuje na ograniczenie w interpretacji danych. Sam w sobie test nie określa, który etap cyklu życia jest blokowany przez związek. Jeśli pojawi się to pytanie, można je rozwiązać, stosując testy czasu dodania38 i testując związek w porównaniu z oczyszczonymi rekombinowanymi białkami wirusowymi.

Niestety, pomimo sukcesu leków przeciw HIV, nadal istnieją problemy zarówno z opornością, jak i toksycznością. Wobec braku skutecznej szczepionki przeciw HIV istnieje potrzeba nie tylko opracowania nowych leków terapeutycznych, które będą skuteczne przeciwko istniejącym mutantom opornym na leki, ale także opracowania leków profilaktycznych, które mogą ograniczyć rozprzestrzenianie się wirusa. Jeżeli profilaktyczne stosowanie leków przeciw HIV obejmuje leczenie osób niezakażonych, takie podejście będzie stanowić szczególne obciążenie dla opracowywania leków, które mają niewielką lub żadną długoterminową toksyczność.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program NCI.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMSOSigmaD2650
DMEMCorning Cellgro10-017
ATPlite System detekcji luminescencji ATPPerkin Elmer6016941
Steady Lite Plus Reporter o wysokiej czułości System oznaczania genów luminescencjiPerkin Elmer6016751
PBS DulbeccoGibco-Life Technologies-Invitrogen14190-136
SpectraMax Gemini EMmolekularne
KaleidaGraphSynergy Software
Nunc F96 Microwell Biała płyta polistyrenowaThomas Scientific12-566-26
Eppendorf Thermomixer CompactSigma AldrichT1442-1EA
Turbo DNaseAmbion-Life Technologies-InvitrogenAM2238
Jednostka filtrująca Millex HA, 0,45 i mikro; MMilliporeSLAHA033SS
Alliance HIV-1 p24 Elisa KitPerkin ElmerNEK050B001KT
komórki HOSATCCCRL-1543
komórki TZM-blNIH AIDS Program odczynnikowy8129
pNL4.3 i Delta; NIH-NCI HIV - Hughes Lab
VSV-GNIH-NCI Hiv Program oporności na leki - Hughes Lab
SoftMax ProMolecular Devices0200-310
Urządzenia Program oporności na leki Env.LUC

Bibliografia

  1. Mouton, Y., et al. Impact of protease inhibitors on AIDS-defining events and hospitalizations in 10 French AIDS reference centres. Federation National des Centres de Lutte contre le SIDA. AIDS. , 101-105 (1997).
  2. Hammer, S. M., et al. A controlled trial of two nucleoside analogues plus indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 cell counts of 200 per cubic millimeter or less AIDS Clinical Trials Group 320 Study Team. New Eng. J. Med. 337, 725-733 (1997).
  3. Hogg, R. S., et al. Improved survival among HIV-infected patients after initiation of triple-drug antiretroviral regimens. Can. Med. Assoc. 160, 659-665 (1999).
  4. Egger, M., et al. Impact of new antiretroviral combination therapies in HIV infected patients in Switzerland: prospective multicentre study. Swiss HIV Cohort Study. BMJ. 315, 1194-1199 (1997).
  5. Gulick, R. M., et al. Treatment with indinavir, zidovudine, and lamivudine in adults with human immunodeficiency virus infection and prior antiretroviral therapy. New Eng. J. Med. 337, 734-739 (1997).
  6. Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., Ho, D. D. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science. 271, 1582-1586 (1996).
  7. Simoni, J. M., Amico, K. R., Pearson, C. R., Malow, R. Strategies for promoting adherence to antiretroviral therapy: a review of the literature. Curr. Infect. Dis. Rep. 10, 515-521 (2008).
  8. Simoni, J. M., Amico, K. R., Smith, L., Nelson, K. Antiretroviral adherence interventions: translating research findings to the real world clinic. Curr. HIV/AIDS Rep. 7, 44-51 (2010).
  9. Volberding, P. A., Deeks, S. G. Antiretroviral therapy and management of HIV infection. Lancet. 376, 49-62 (2010).
  10. Acosta, E. P., et al. Novel method to assess antiretroviral target trough concentrations using in vitro susceptibility data. Antimicr. 56, 5938-5945 (2012).
  11. Rockstroh, J. K., et al. Long-term treatment with raltegravir or efavirenz combined with tenofovir/emtricitabine for treatment-naive human immunodeficiency virus-1-infected patients: 156-week results from STARTMRK. Clin. Infect. Dis. 53, 807-816 (2011).
  12. Fernandez-Montero, J. V., Eugenia, E., Barreiro, P., Labarga, P., Soriano, V. Antiretroviral drug-related toxicities - clinical spectrum, prevention, and management. Exp. Opin. Drug Safety. , (2013).
  13. Lunzen, J., et al. Once daily dolutegravir (S/GSK1349572) in combination therapy in antiretroviral-naive adults with HIV: planned interim 48 week results from SPRING-1, a dose-ranging, randomised, phase 2b trial. Lancet Infect Dis. 12, 111-118 (2012).
  14. Sax, P. E., et al. Co-formulated elvitegravir, cobicistat, emtricitabine, and tenofovir versus co-formulated efavirenz, emtricitabine, and tenofovir for initial treatment of HIV-1 infection: a randomised, double-blind, phase 3 trial, analysis of results after 48 weeks. Lancet. 379, 2439-2448 (2012).
  15. Sax, P. E., et al. Abacavir/lamivudine versus tenofovir DF/emtricitabine as part of combination regimens for initial treatment of HIV: final results. Infect. Dis. 204, 1191-1201 (2011).
  16. Kellam, P., Larder, B. A. Recombinant virus assay: a rapid, phenotypic assay for assessment of drug susceptibility of human immunodeficiency virus type 1 isolates. Antimicr. Agents Chemother. 38, 23-30 (1994).
  17. Hertogs, K., et al. A rapid method for simultaneous detection of phenotypic resistance to inhibitors of protease and reverse transcriptase in recombinant human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients treated with antiretroviral drugs. Antimicr. Agents Chemother. 42, 269-276 (1998).
  18. Petropoulos, C. J., et al. A novel phenotypic drug susceptibility assay for human immunodeficiency virus type 1. Antimicr. Agents Chemother. 44, 920-928 (2000).
  19. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67, 1211-1221 (1991).
  20. Hazuda, D. J., et al. Inhibitors of strand transfer that prevent integration and inhibit HIV-1 replication in cells. Science. 287, 646-650 (2000).
  21. Nguyen, B. Y., et al. Raltegravir: the first HIV-1 integrase strand transfer inhibitor in the HIV armamentarium. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1222, 83-89 (2011).
  22. Wills, T., Vega, V. Elvitegravir: a once-daily inhibitor of HIV-1 integrase. Exp. Opin. Invest. Drugs. 21, 395-401 (2012).
  23. Kobayashi, M., et al. In Vitro antiretroviral properties of S/GSK1349572, a next-generation HIV integrase inhibitor. Antimicr. Agents Chemother. 55, 813-821 (2011).
  24. Cooper, D. A., et al. Subgroup and resistance analyses of raltegravir for resistant HIV-1 infection. Eng. J. Med. 359, 355-365 (2008).
  25. Briz, V., et al. Raltegravir and etravirine are active against HIV type 1 group O. AIDS Res.Human Retroviruses. 25, 225-227 (2009).
  26. Fransen, S., et al. Loss of raltegravir susceptibility by human immunodeficiency virus type 1 is conferred via multiple nonoverlapping genetic pathways. J. Virol. 83, 11440-11446 (2009).
  27. Goethals, O., et al. Primary mutations selected in vitro with raltegravir confer large fold changes in susceptibility to first-generation integrase inhibitors, but minor fold changes to inhibitors with second-generation resistance profiles. Virology. 402, 338-346 (2010).
  28. Goethals, O., et al. Resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 integrase selected with elvitegravir confer reduced susceptibility to a wide range of integrase inhibitors. J. Virol. 82, 10366-10374 (2008).
  29. Canducci, F., et al. Dynamic patterns of human immunodeficiency virus type 1 integrase gene evolution in patients failing raltegravir-based salvage therapies. AIDS. 23, 455-460 (2009).
  30. Ceccherini-Silberstein, F., et al. Characterization and structural analysis of HIV-1 integrase conservation. AIDS Rev. 11, 17-29 (2009).
  31. Charpentier, C., et al. Drug resistance profiles for the HIV integrase gene in patients failing raltegravir salvage therapy. HIV Med. 9, 765-770 (2008).
  32. Julias, J. G., et al. Effects of mutations in the G tract of the human immunodeficiency virus type 1 polypurine tract on virus replication and RNase H cleavage. J. Virol. 78, 13315-13324 (2004).
  33. Hare, S., et al. Structural and functional analyses of the second-generation integrase strand transfer inhibitor dolutegravir (S/GSK1349572). Mol. Pharmacol. 80, 565-572 (2011).
  34. Adachi, A., et al. Production of acquired immunodeficiency syndrome-associated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone. J. Virol. 59, 284-291 (1986).
  35. Kemp, S. D., et al. A novel polymorphism at codon 333 of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase can facilitate dual resistance to zidovudine and L-2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine. J. Virol. 72, 5093-5098 (1998).
  36. Butler, S. L., Hansen, M. S., Bushman, F. D. A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nat. Med. 7, 631-634 (2001).
  37. Brussel, A., et al. Longitudinal monitoring of 2-long terminal repeat circles in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic HIV-1 infection. AIDS. 17, 645-652 (2003).
  38. Daelemans, D., Pauwels, R., De Clercq, E., Pannecouque, C. A time-of-drug addition approach to target identification of antiviral compounds. Nat. Protoc. 6, 925-933 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Inhibitory integrazu HIVtest cytotoksyczno ci kom rkowejtest reporterowy lucyferazyseryjne rozcie czenia zwi zk wHIV 1 typu dzikiegoHIV 1 oporny na lekiluminescencja zale na od ATPluminometr do mikrop ytekprzesiewanie na p ytkach 96 do kowych
Szybkie badania przesiewowe w kierunku inhibitorów odwrotnej transkryptazy i integrazy HIV
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.