Artykuł metodologiczny

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

DOI:

10.3791/51408

⸱

29 maja 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heterogeniczność populacji komórek macierzystych utrudnia szczegółowe zrozumienie biologii komórek macierzystych, takich jak ich skłonność do różnicowania się w kierunku różnych linii. Test transkryptomu pojedynczej komórki może być nowym podejściem do analizy indywidualnej zmienności. Opracowaliśmy metodę qRT-PCR dla pojedynczej komórki i potwierdziliśmy, że metoda ta działa dobrze w kilku profilach ekspresji genów. Na poziomie pojedynczej komórki, każda ludzka embrionalna komórka macierzysta, posortowana według komórek dodatnich OCT4::EGFP, ma wysoką ekspresję w OCT4, ale inny poziom ekspresji NANOG. Nasz test ekspresji genów w pojedynczej komórce powinien być przydatny do badania heterogeniczności populacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość wyższych populacji eukariontów jest niejednorodna, dlatego przy analizie populacji zbiorczej, często trudno jest zinterpretować ich cechy komórkowe. Poszczególne komórki w populacji mogą się subtelnie różnić, a różnice te mogą mieć ważne konsekwencje dla właściwości i funkcji całej populacji 1,2. Wiadomo zwłaszcza, że ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) są niejednorodne, co powoduje różne poziomy pluripotencji i różne potencjały specyfikacji linii w delikatnie charakterystyczny sposób 3,4. Na przykład, różne antygeny powierzchniowe komórek mogą być używane do kategoryzacji niezróżnicowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, a grupa Austina Smitha zaproponowała różne poziomy pluripotencji w mysich embrionalnych komórkach macierzystych, w oparciu o ich morfologię, skłonność do różnicowania i zależność szlaku sygnałowego6. Hipotezę o zjawisku tym postawiono na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych7. Podczas gdy ogólne badania przeprowadzono na różnych liniach komórek macierzystych, a nie na pojedynczych komórkach macierzystych, bardzo intrygujące może być analizowanie różnych poziomów pluripotencji na poziomie pojedynczej komórki, co potencjalnie wpływa na ich zdolności różnicowania w kierunku wszystkich linii komórek somatycznych.

Heterogeniczność komórkowa i molekularna może być podyktowana profilowaniem transkrypcji, które nazywa się 'transkryptomem pojedynczej komórki' i kładzie nacisk na nowe podejścia do ilościowego określania poziomów ekspresji genów8-10. Do analizy poziomów ekspresji genów w poszczególnych komórkach opracowaliśmy prosty, ale solidny protokół ilościowego RT-PCR dla pojedynczych komórek. Potwierdziliśmy skuteczność i wykonalność naszego protokołu, porównując każdą połówkę lizatów pojedynczych komórek, a także seryjnie rozcieńczane całkowite RNA hESC, co skutkuje minimalnymi różnicami technicznymi i różnicami. Ponadto wykorzystaliśmy genetyczną linię reporterową do wyizolowania jednorodnej populacji hESC za pomocą systemu celowania genowego. Zastosowano wektor dawcy do celowania w locus OCT4 (konstrukt OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro) oraz parę plazmidów TALEN11. Wektor dawcy i parę plazmidów TALEN wprowadzono do hESC (H9, WA09) przy użyciu naszego protokołu nukleofekcji i selekcji klonalnej, a utrzymanie hESC przeprowadzono w oparciu o nasz rutynowy protokół12. Potwierdziliśmy, że ta genetyczna linia reporterowa wyraża EGFP dla ekspresji OCT4 w hESC OCT4::EGFP.

Nasz wynik pokazuje, że poszczególne hESC (posortowane według komórek OCT4::EGFP silnie dodatnie) mają wysoki poziom ekspresji OCT4, ale różne poziomy ekspresji NANOG. Tak więc nasz test ekspresji genów w pojedynczej komórce powinien być przydatny do badania heterogeniczności populacji pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie płytki 96-dołkowej

  1. Zmieszać 1 μl jednokomórkowej DNazy1 z 9 μl roztworu do lizy pojedynczych komórek.
  2. Umieścić 10 μl zmieszanego roztworu w każdym dołku 96-dołkowej płytki PCR.

2. Odłączanie hESC do oczyszczania FACS

  1. Odłączyć linię komórkową OCT4::EGFP ES od naczynia o średnicy 60 mm za pomocą 1 ml Accutase na 20 minut, w temperaturze 37 °C, które zostały zneutralizowane ludzkim podłożem ES.
  2. Przygotować populację komórek w 1 ml buforze FACS i dostosować komórkę do 1 x 106 komórek/ml.
  3. Przepuść próbkę komórek przez rurkę z filtrem siatkowym o średnicy 35 μm.
  4. Przechowuj probówkę w lodzie przed sortowaniem komórek.

3. Liza pojedynczej komórki oczyszczonej metodą FACS w każdym dołku płytki 96-dołkowej

  1. Posortuj próbkę pod kątem komórek dodatnich pod kątem EGFP w sortowniku komórek z przeszkolonym operatorem. Umieść pojedynczą komórkę w roztworze lizy pojedynczej komórki/DNazy1 w 96-dołkowej płytce PCR. W razie potrzeby 96-dołkową płytkę z próbką można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C krócej niż jeden miesiąc.
  2. Próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu lizy komórek.
  3. Dodać 1 μl roztworu zatrzymującego, aby zatrzymać reakcję lizy.
  4. Inkubować 2 minuty w temperaturze pokojowej.

4. Odwrotna transkrypcja

  1. Dodać do każdego z nich 0,5 μl podwielokrotności 20 μM SMA-T15, SMA-A.
  2. Do każdej studzienki dodać 4 μl buforu 5X, 2 μl DTT, 1 μl odwrotnej transkryptazy i 1 μl dNTP.
  3. Wykonaj odwrotną transkrypcję w termocyklerze.
    1. Ustaw program termiczny na 42 °C × 90 min i dezaktywuj odwrotną transkryptazę na 85 °C × 5 min.

5. Wzmocnienie

  1. Dodać 4 μl odczynnika ExoSAP-IT do każdej próbki poddanej odwrotnej transkrypcji.
    1. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 15 minut i w temperaturze 80 °C przez 15 minut w celu dezaktywacji odczynnika ExoSAP-IT.
  2. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR z SMA-p2 (2 nM)
  3. Dodać 10 μl mieszaniny reakcyjnej PCR do każdej próbki poddanej odwrotnej transkrypcji.
  4. Wykonaj amplifikację, składającą się z 20 cykli denaturacji (94 °C przez 30 sekund), wyżarzania (57 °C przez 30 sekund) i przedłużania (68 °C przez 10 minut).

6. Wydajność qRT-PCR

  1. Do każdej studzienki dodaj 10 μl 2X SYBR Green PCR Master Mix, 1 μl amplifikowanego cDNA, 2 startery nM i 7 μl wody.
    1. Ustaw program, a następnie 95 °C na 3 sekundy, 60 °C na 30 sekund x 40 cykli.
  2. Wykonuj w dwóch egzemplarzach w przypadku błędów technicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wydajna i solidna amplifikacja RNA pojedynczej komórki

Aby zminimalizować zmienność transkrypcji wśród hESC, użyliśmy klonu hESC OCT4::EGFP do oczyszczania FACS. Po posortowaniu komórek dodatnich OCT4::EGFP na 96-dołkową płytkę, każda komórka jest poddawana lizie w buforze do lizy i przekształcana w poli(A)+ RNA do cDNA o pełnej długości przy użyciu startera SMA-T15 (GACATGTATCCGGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT) i zakotwiczeniu za pomocą SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG) przy użyci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Profilowanie genów pojedynczych komórek może być głównym narzędziem do przewidywania funkcjonalności pojedynczej komórki lub całej populacji. Ze względu na ograniczenia techniczne, analiza profilowania całych genów została ograniczona do średnich populacji. Zaproponowano, aby różnice we wzorcach i poziomach ekspresji genów między poszczególnymi komórkami a subpopulacjami powodowały błędną interpretację. Tak zróżnicowane aspekty komórkowe można odnaleźć w hESC, a ich heterogeniczność powoduje subtelnie różną zdolność do u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Lee za cenne dyskusje na temat rękopisu. Prace w laboratorium Lee były wspierane przez granty z Robertson Investigator Award New York Stem Cell Foundation oraz z Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
96-dołkowa płytka do PCRUSA scientific1402-8900
Zestaw do lizy komórek AmbionTechnologies4458235
SMARTScribe Odwrotna transkryptazaClonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq DNA polimeraza High FidelityInvitrogen11304
10 mM dNTP Mix, PCR GradeInvitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
Bufor45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μ l DNaza, filtr sterylizowany
35 i mu; m rurki z nakrętką sitową do komórekBD Biosciences352235
Life FACS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
  7. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
  8. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
  9. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  10. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  11. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
  12. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

qRT PCR pojedynczych kom rekfluorescencyjne sortowanie kom rek aktywowane laseremodwrotna transkrypcjareakcja a cuchowa polimerazykom rki pozytywne pod k tem OCT4 EGFPprofilowanie ekspresji gen wheterogeniczno populacjimarkery kom rek macierzystych

Powiązane artykuły