Protokół obejmujący zintegrowane zagęszczenie, wzbogacenie i kolorymetryczne wykrywanie patogenów przenoszonych przez żywność w dużych ilościach wody rolniczej jest tutaj przedstawiony. Woda jest filtrowana przez zmodyfikowane waciki Moore'a (MMS), wzbogacone o selektywne lub nieselektywne media, a detekcja odbywa się za pomocą papierowych urządzeń analitycznych (μPAD) osadzonych w bakteryjno-orientacyjnych podłożach kolorymetrycznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Kolorymetryczne wykrywanie Escherichia coli, Salmonella spp. i Listeria monocytogenes na papierze w dużych ilościach wody rolniczej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Ten protokół opisuje szybkie wykrywanie kolorymetryczne Escherichia coli, Salmonella spp. i Listeria monocytogenes z dużych objętości (10 L) wód rolniczych. Tutaj woda jest filtrowana przez sterylne zmodyfikowane waciki Moore'a (MMS), które składają się z prostego filtra z gazy zamkniętego w plastikowym wkładzie, w celu koncentracji bakterii. Po filtracji w MMS przeprowadza się nieselektywne lub selektywne wzbogacanie bakterii docelowych. W celu kolorymetrycznego wykrywania bakterii docelowych, wzbogacenia są następnie oznaczane za pomocą papierowych urządzeń analitycznych (μPAD) osadzonych w substratach wskazujących na obecność bakterii. Każdy substrat reaguje z enzymami bakteryjnymi wskazującymi na cel, wytwarzając kolorowe produkty, które można wykryć wizualnie (detekcja jakościowa) na μPAD. Alternatywnie, cyfrowe obrazy przereagowanych μPAD mogą być generowane za pomocą zwykłych urządzeń skanujących lub fotograficznych i analizowane za pomocą oprogramowania ImageJ, co pozwala na bardziej obiektywną i ustandaryzowaną interpretację wyników. Chociaż biochemiczne procedury przesiewowe mają na celu identyfikację wyżej wymienionych patogenów bakteryjnych, w niektórych przypadkach enzymy wytwarzane przez mikrobiotę tła lub degradacja substratów kolorymetrycznych mogą dawać fałszywie dodatni wynik. W związku z tym potrzebne jest potwierdzenie za pomocą bardziej dyskryminującej diagnostyki. Niemniej jednak ta platforma koncentracji i wykrywania bakterii jest niedroga, czuła (granica wykrywalności 0,1 CFU/ml), łatwa do wykonania i szybka (zatężanie, wzbogacanie i wykrywanie odbywa się w ciągu około 24 godzin), co uzasadnia jej zastosowanie jako wstępnej metody przesiewowej pod kątem jakości mikrobiologicznej wody rolniczej.
Wprowadzenie
Ważne jest, aby czynniki chorobotwórcze przenoszone drogą pokarmową były wykrywane szybko i najlepiej w terenie, aby zmniejszyć obciążenie chorobami przenoszonymi drogą pokarmową. Typowe strategie wykrywania patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność obejmują profilowanie biochemiczne, hodowlę selektywną i różnicową, izolację immunologiczną i wykrywanie oraz wykrywanie molekularne. Metody te są jednak utrudnione ze względu na sporadyczne zanieczyszczenie, małe rozmiary badanych próbek, często niskie stężenia bakterii chorobotwórczych przenoszonych przez żywność, wymagają długiego czasu przetwarzania i/lub nie mają zastosowania w warunkach polowych. Co więcej, ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Koncentracja bakterii w dużych ilościach wody rolniczej za pomocą MMS
- Przygotowanie do wiadomości MMS
- Wytnij prostokątny odcinek 4-warstwowej gazy o wymiarach 40 x 12 cm.
- Złóż gazę wzdłuż obu osi, aby uzyskać prostokąt o wymiarach 20 x 6 cm.
- Zwiń gazę ciasno wzdłuż jej długiej osi, aby utworzyć cylindryczny wacik o wysokości około 6 cm i średnicy 3 cm.
- Autoklaw gazy w folii aluminiowej, nie autoklawuj kasety. Kasetę należy odkazić, mocząc ją przez 30 minut w 10% domowym wybielaczu, a resztkowy chlor dezaktywować, mocząc kasetę przez 15 minut w pięciowodnym roztworze pięciowodnego tiosiarczanu sodu (Na2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Zgodnie z opisanym protokołem, zagęszczanie bakterii przy użyciu MMS (Rycina 1) może zostać przeprowadzone w ciągu około 15-20 min. MMS jest wykonany z akrylonitrylo-butadien-styrenu (ABS) i składa się z dwóch oddzielnych elementów: pokrywki oraz wkładu, z których oba posiadają zintegrowany zespół kranika, w który wstawia się cylindryczny tampon z gazy (Rycina 1A). Oba komponenty są następnie skręcane, tworząc MMS (Rycina 1B). Procesowanie w systemie MMS jest napędzane p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje zintegrowaną metodę wykrywania E. coli, Salmonella spp. i L. monocytogenes w wodzie rolniczej. W tym przypadku stężenie MMS bakterii w dużych objętościach (10 l) wody rolniczej jest połączone ze wzbogacaniem bakteryjnym i bakteryjno-orientacyjną detekcją kolorymetryczną za pomocą μPADs. Procedura MMS radzi sobie z wysoką zawartością cząstek stałych w próbkach wody przy jednoczesnej 10-krotnej koncentracji bakterii, jest wystarczająco wytrzymała i prosta do zastosowań tereno.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Z wdzięcznością dziękujemy za dofinansowanie tego projektu z grantów Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA na lata 2009-01208 i 2009-01984.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| rolnicza | Woda do nawadniania, woda do mycia, woda ze studni itp. | ||
| Rurki winylowe | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" średnica wewnętrzna, Średnica zewnętrzna 3/8", dostępna w: http://www.wilmar.com |
| Zmodyfikowany wkład Moore Swab | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm długości i 4 ½ cm szerokości, dostępne pod adresem: http://www.lumierediagnostics.com. Alternatywnie można użyć jednorazowej wersji wkładu (patrz tekst) | |
| Gaza | Chesapeake Wiper & Dostawa, Inc. | CC90 | Grade #90, splot 44 x 36, dostępny w: www.raglady.com |
| Wybielacze domowe | Różne | Stężenie podchlorynu sodu ok. 6% | |
| Tiosiarczan sodu 5-hydrat | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Kolektor | zbudowany we własnym zakresie | Opcjonalnie, urządzenie może być zbudowane z rur PVC i odpowiednich kształtek | |
| Pompa perystaltyczna | Mikrometry | RPP1300 | Dostępne pod adresem: http://www.micronmeters.com |
| Pipeta serologiczna | Różne | jednorazowe, 10 ml | |
| Uniwersalny bulion do wstępnego wzbogacania | Difco | 223510 | |
| Buforowana woda peptonowa | Difco | 218105 | |
| Suplement Salmonella | Biomé rieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Rosół | Biomé rieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Różne | tutaj używane Drummond DP-110 | |
| Inkubator wstrząsający | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific używany tutaj | |
| Mikropipeta | Różne | 10 μ l, 1 ml | |
| Końcówki do mikropipet | Różne | bariery, 10 μ l, 1 ml | |
| 1,5 probówki do mikrowirówek | Różne | sondy bez RNaz i DNaz | |
| Sonikator Q | Sonica LLC | Seria | |
| i mikro; Podkładki Avant | Drukowane woskiem koła o średnicy 7 mm, o grubości linii 4 pkt. Skontaktuj się z dr Charlesem Henrym, aby uzyskać dodatkowe informacje | ||
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazyno-N′ -2-etanosulfonowy] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorofenol czerwony-galaktopiranozyd (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-glukuronid (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylkaprylan (magenta kaprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| Fosforan 5-bromo-4-chloro-mio-inozytolu (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Szalki Petriego, polistyren 100 mm na 15 mm | Różne | sterylne | |
| płaskie skanery Różne | skanery USB Xerox | ||
| Oprogramowanie ImageJ | Narodowe Instytuty Zdrowia | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Bibliografia
- Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
