Analiza globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki po niedotlenieniu

Podsumowanie

Opisujemy technikę analizy globalnej syntezy RNA w hipoksji za pomocą obrazowania. Znakowanie chemiczne RNA metodą kliknięcia nie było wcześniej wykonywane w warunkach hipoksji i umożliwia wizualizację globalnych zmian RNA na poziomie pojedynczej komórki. Podejście to uzupełnia istniejące techniki uśredniania RNA, umożliwiając bezpośrednią wizualizację zmian między komórkami w globalnej syntezie RNA.

Streszczenie

Niedotlenienie lub obniżenie dostępności tlenu jest związane z wieloma procesami fizjologicznymi i patologicznymi. Na poziomie molekularnym komórki inicjują określony program transkrypcyjny w celu uzyskania odpowiedniej i skoordynowanej odpowiedzi komórkowej. Komórka posiada kilka enzymów czujnika tlenu, które wymagają tlenu cząsteczkowego jako kofaktora swojej aktywności. Obejmują one zarówno hydroksylazy prolilowe, jak i demetylazy histonowe. Większość badań analizujących odpowiedzi komórkowe na niedotlenienie opiera się na populacjach komórkowych i badaniach średnich, w związku z czym rzadko przeprowadza się analizę pojedynczych komórek niedotlenionych komórek. W tym miejscu opisujemy metodę analizy globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki w hipoksji przy użyciu zestawów do obrazowania RNA Click-iT w stacji roboczej z kontrolacją tlenu, a następnie analizy mikroskopowej i kwantyfikacji.  Używając komórek rakowych wystawionych na niedotlenienie przez różny czas, RNA jest znakowane i mierzone w każdej komórce. Analiza ta pozwala na wizualizację czasowych i międzykomórkowych zmian w globalnej syntezie RNA po stresie niedotlenieniowym.

Wprowadzenie

Niedotlenienie (niskie ciśnienie tlenu) występuje, gdy normalny dopływ tlenu do tkanki jest zakłócony. Tlen środowiskowy jest zarówno składnikiem odżywczym, jak i cząsteczką sygnałową, dostarczając ważnych wskazówek dla wielu typów komórek. Zmiany w tlenie środowiskowym są wyczuwane przez grupę dioksygenaz, które kontrolują aktywność niezbędnej rodziny czynników transkrypcyjnych, znanej jako czynniki indukowane hipoksją (HIF). HIF składają się z dwóch podjednostek, α i β. Znane są trzy izoformy HIF-α (1, 2 i 3) oraz wiele wariantów splicingu HIF-1β. HIF-1β ulega konstytutywnej ekspresji i nie jest regulowany przez poziom tlenu w środowisku¹. Członkowie rodziny HIF-α są dynamicznie regulowani przez klasę hydroksylaz prolilowych (PHD) i czynnik hamujący HIF (FIH); oba wymagają tlenu jako kofaktora do katalizowania hydroksylacji HIF-α^2,3. W normoksji członkowie rodziny HIF-α są hydroksylowani i znakowani do degradacji proteosomalnej przez ligazę E3, von Hippel Lindau (vHL). W niedotlenieniu doktorzy i FIH są nieaktywni lub mają zmniejszoną aktywność. Izoformy HIF-α stabilizują się, tworzą heterodimer z HIF-1β i wpływają na transkrypcję genów, które zapewniają odpowiedź komórkową na środowisko niedotlenienia (Figura 1A)⁴.

Obecne techniki analizy RNA koncentrują się na kwantyfikacji uśrednionych wartości w danej populacji komórek. Komórki reagują na bodziec hipoksyjny, inicjując transkrypcję niezliczonych genów, które pozwalają im przystosować się do nieprzyjaznego środowiska⁵. Jednak niedotlenienie często występuje jako gradient, a komórki w niedotlenionym środowisku nie są poddawane jednolitemu bodźcowi hipoksyjnemu. Opisujemy implementację zestawów do obrazowania RNA Click-iT w stacji roboczej z kontrolą tlenu w celu zbadania globalnej syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki w niedotlenieniu.

Zestaw do obrazowania RNA wykorzystuje modyfikowany alkinami nukleozyd, 5-etynylourydynę (EU) i chemoselektywną ligację, aby umożliwić wykrycie globalnej syntezy RNA w czasie i przestrzennie w komórkach i tkankach⁶. Krótko mówiąc, komórki są poddawane hipoksji i hodowane w obecności EU. Następnie są one utrwalane i przepuszczalne, a włączenie UE do powstającego RNA jest wykrywane przez chemoselektywną ligację UE z barwnikiem zawierającym azydek. Typowy przebieg tej reakcji przedstawiono na rysunku 1B. Użyliśmy zestawu do obrazowania RNA do zbadania syntezy RNA na poziomie pojedynczej komórki, która powstała w wyniku leczenia hipoksją.

Mały rozmiar znacznika alkinowego umożliwia efektywne włączenie zmodyfikowanego nukleozydu do RNA. Chemoselektywna ligacja lub reakcja "klik" jest bardzo wydajna, szybka i specyficzna^7-10. Wszystkie składniki reakcji są bioobojętne, a reakcja nie wymaga ekstremalnych temperatur ani rozpuszczalników. Reakcja kliknięcia eliminuje wymóg konwencjonalnego znakowania radioizotopowego i umożliwia bezpośrednią wizualizację wyników, ponieważ wynik jest niewielki. Ponadto cząsteczka detekcyjna może z łatwością przenikać do złożonych próbek, umożliwiając analizę multipleksową z uwzględnieniem przeciwciał do wykrywania białek interaktywnych z RNA. Ten test obrazowania RNA jest kompatybilny z barwnikami organicznymi, w tym Alexa, Fluor i fluoresceiną (FITC).

Zmierzyliśmy zmianę w syntezie RNA po leczeniu naszych komórek za pomocą implementacji otwartego środowiska mikroskopowego dla odległych obiektów (OMERO). OMERO to oprogramowanie typu open source, dostępne pod adresem http://openmicroscopy.org/ . To oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych umożliwia dostęp do szerokiego zakresu danych biologicznych i korzystanie z nich, w tym zarządzanie wielowymiarowymi, heterogenicznymi zestawami danych. Aplikacja kliencka umożliwia zdalną wizualizację i analizę złożonych danych obrazu biologicznego¹¹; użyliśmy go do ilościowego określenia wizualnych zmian w globalnej i jednokomórkowej syntezie RNA. Te dane i kroki wymagane do analizy naszego eksperymentu z obrazowaniem RNA przy użyciu tego oprogramowania do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych przedstawiono poniżej.

Przyjrzeliśmy się zmianom w globalnej syntezie RNA po leczeniu komórek ludzkiego kostniakomięsaka (U2OS) z niedotlenieniem przez okres do 24 godzin. We wszystkich warunkach wykryliśmy zmienność poziomu produkcji RNA między komórkami. Krótkie czasy ekspozycji na niedotlenienie nie powodowały istotnych zmian w poziomie powstającego RNA w komórkach. Jednak narażenie na 24-godzinną hipoksję spowodowało znaczny wzrost ilości RNA wytwarzanego w komórkach. Większość odpowiedzi komórkowych na niedotlenienie mierzy się po dłuższych okresach ekspozycji, takich jak od 4 do 24 godzin. Niektóre mechanizmy są jednak wprowadzane znacznie wcześniej, na przykład; Aktywacja NF-κB następuje w ciągu 5-15 minut od ekspozycji na^{niedotlenienie 12}. Badanie krótszych czasów ekspozycji na hipoksję jest zatem uzasadnione i może odwrócić uwagę od bardziej skomplikowanych reakcji, takich jak cykl komórkowy i apoptoza.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i leczenie

1. Zebrać odczynniki i sprzęt wymieniony w Tabeli 1 do hodowli komórek ludzkiego kostniakomięsaka (U2OS). Przygotuj wszystkie odczynniki i przeprowadź wszystkie techniki hodowli tkankowej w okapie z laminarnym przepływem powietrza, aby zapewnić sterylność
2. Przygotować pożywkę hodowlaną w następujący sposób: Dodać 50 ml FCS, 5 ml L-glutaminy i 5 ml penicyliny/streptomycyny do DMEM, aby osiągnąć końcowe stężenia 10% (FCS), 2 mM (L-glutamina), 50 U/ml (penicylina) i 50 U/ml (streptomycyna). Ogrzać pożywkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
3. Przygotuj komórki do zabiegu:
   1. Wysterylizuj kilka szkiełek nakrywkowych w 70% etanolu, pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i umieść jedno na dnie sześciu płytek o średnicy 3,5 cm.
   2. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w 2 ml ogrzanego kompletnego DMEM (37 °C), dociskając kleszcze do szkiełek nakrywkowych, aby upewnić się, że pozostają przyklejone do dna studzienek.
   3. Odłączyć komórki U2OS od płytki do hodowli tkankowej, przemywając je raz 3 ml PBS, stosując 4 ml ogrzanej 0,05% trypsyny-EDTA (1%) i inkubując w temperaturze 37 °C przez 7 minut.
   4. Ponownie zawieś komórki w 6 ml podgrzanego kompletnego DMEM, aby dezaktywować trypsynę-EDTA i policz za pomocą hemocytometru.
   5. Tabliczka 2 x 10⁵ komórek na każdą z płytek o średnicy 3,5 cm przygotowanych w pkt 1.3.1. Delikatnie kołysz płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Pozwól komórkom przylegać przez noc przed zabiegiem.
4. Poddać je działaniu substancji, umieszczając cztery płytki o średnicy 3,5 cm w stacji roboczej do hipoksji, a pozostałe dwie płytki o średnicy 3,5 cm należy pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C w normalnych warunkach tlenowych. Należy być gotowym do rozpoczęcia testu znakowania RNA w warunkach poddanych działaniu substancji (w komorze hipoksji dla komórek poddanych hipoksji) na 1 godzinę przed zakończeniem leczenia hipoksją.
5. Wystaw komórki na niedotlenienie przez 1 godzinę 15 minut, 1 godzinę 30 minut, 2 godziny i 24 godziny. Te punkty czasowe są elastyczne i określane przez użytkownika.
6. Stosować normoksyjną płytkę o średnicy 3,5 cm jako kontrolę dodatnią i normoksyjną płytkę o średnicy 3,5 cm potraktowaną aktynomycyną D (stężenie końcowe 10 μg/ml) przez 4 godziny jako kontrolę ujemną. Aktynomycyna D jest inhibitorem globalnej syntezy RNA.

Przestrogi:

Hoechst 33342 to znany mutagen.
DMSO jest znany z tego, że ułatwia wnikanie cząsteczek organicznych do tkanek.
NaOH jest.
HCl jest.
Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny dla wszystkich zwierząt i może powodować śmierć u ludzi.
Triton X-100 może powodować podrażnienie skóry w przypadku bezpośredniego kontaktu.
Aktynomycyna D jest toksyczna w kontakcie ze skórą lub po połknięciu.
Podejmij odpowiednie środki ostrożności podczas obchodzenia się ze wszystkimi niebezpiecznymi chemikaliami.

2. Test Click-iT

1. Zbierz następujące odczynniki, które są wymagane oprócz zestawu testowego Click-iT: sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,2 - 7,6, 3,7% paraformaldehyd (PFA) w PBS, 1% Triton X-100 w PBS, woda dejonizowana (_dH2O), dimetylosulfotlenek (DMSO), 10 M wodorotlenek sodu (NaOH) i 37% kwas solny (HCl); Dodatkowo - paski wskaźnikowe pH.
2. Przygotuj świeży roztwór podstawowy PFA przed wykonaniem reakcji Click-iT w następujący sposób:
   1. Umieścić 1,85 g PFA, 3,5 ml_dH2O i 10 μl 10 M NaOH w 50 ml probówce Falcon. Zagotuj 300 - 400 ml_H2Ow dużej zlewce w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać kąpiel wodną i umieść ją w dygestorium.
   2. Umieścić 50 ml Falcona w łaźni wodnej i delikatnie mieszać przez 10 minut, okresowo zwalniając pokrywkę, aż PFA się rozpuści.
   3. Przelej roztwór PFA przez filtr 0,2 μm do kolejnej probówki Falcon o pojemności 50 ml, otrzymując 37% roztwór.
   4. Rozcieńczyć to 10x, dodając PBS i doprowadzić pH do 6,8, dodając około 12 μl stężonego HCl. Opcja: Potwierdź prawidłowe pH za pomocą pasków wskaźnikowych w dygestorium.
   5. Zużyć natychmiast lub przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Przygotować roztwory podstawowe zestawu do obrazowania RNA w następujący sposób:
   1. Dodać 373 μl dH₂O do składnika A, otrzymując roztwór podstawowy 100 mM UE. Przechowywać w temperaturze -20 °C do jednego miesiąca.
   2. Dodać 85 μl DMSO do składnika B (Alexa Fluor 594) i wymieszać przez pipetowanie lub wirowanie. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.
   3. Dodać 2 ml dH₂O do składnika E, aby uzyskać 10-krotny roztwór dodatku buforowego do obrazowania reakcji zestawu do obrazowania RNA. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku, wyrzucić, gdy roztwór uzyska brązowy kolor.
4. Etykietowanie komórek za pomocą UE: Przygotować 2X roztwór roboczy UE z 100 mM zapasu przygotowanego w kroku 2.3 we wstępnie podgrzanym kompletnym pożywce (37 °C). Wykonaj pozostałą część tego kroku i krok 2.5 w komorze hipoksji dla komórek poddanych hipoksji. Rozcieńczyć do 1X, dodając równą objętość tego 2X roztworu roboczego do pożywki zawierającej komórki. Inkubować przez 1 godzinę w warunkach hodowli komórkowej poddanej działaniu substancji.
5. Utrwalanie komórek: Umyj każdą studzienkę raz PBS i dodaj 1 ml 3,7% bulionu PFA przygotowanego w kroku 2.2 powyżej w warunkach traktowania. Inkubować przez 15 minut w warunkach zabiegowych. W tym momencie próbki poddane działaniu hipoksji można usunąć z komory hipoksji. Usuń utrwalacz i umyj każdą studzienkę raz za pomocą PBS (należy uważać, aby odpowiedzialnie utylizować odpady PFA). Kolejne kroki wykonaj w temperaturze pokojowej.
6. Przepuszczalność: Usunąć roztwór płuczący i dodać 1 ml 1% Triton X-100 w PBS do każdej studzienki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor przepuszczalny i przemyć każdą studzienkę raz PBS.
7. Znakowane wykrywanie RNA:
   1. Przygotować świeży roztwór roboczy 1X dodatku buforowego do zestawu do obrazowania RNA, rozcieńczając roztwór 10X (przygotowany w kroku 2.3) w stosunku 1:10 w dH₂O.
   2. Przygotować koktajl reakcyjny zestawu do obrazowania RNA zgodnie z tabelą 2 do użycia natychmiast po przygotowaniu.
   3. Usunąć roztwór płuczący i dodać 500 μl koktajlu reakcyjnego zestawu do obrazowania RNA do każdej próbki. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
   4. Wyjąć koktajl reakcyjny zestawu do obrazowania RNA i przemyć go raz 1 ml buforu do płukania reakcyjnego zestawu do obrazowania RNA (składnik F), a następnie usunąć bufor do płukania reakcji zestawu do obrazowania RNA.
8. Opcjonalna reakcja multipleksowa: W tym momencie należy wykonać dodatkowe znakowanie przeciwciałami próbek zgodnie z zaleceniami producenta.
9. Barwienie DNA: Umyj próbki PBS, a następnie usuń roztwór do mycia. Rozcieńczyć Hoechst 33342 (składnik G) w stosunku 1:1,000 w PBS. Dodać 1 ml rozcieńczonego Hoechst 33342 do każdego dołka i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem. Usunąć roztwór Hoechst 33342 i dwukrotnie przemyć komórki PBS. Usuń roztwór płuczący i przystąp do mikroskopii świetlnej.

3. Mikroskopia świetlna

1. Zamontuj szkiełka nakrywkowe:
   1. Umieść 10 μl medium montażowego na środku standardowego szkiełka mikroskopowego.
   2. Umieść szkiełko nakrywkowe komórką do dołu na środku szkiełka mikroskopowego, aby zakryć porcję podłoża montażowego. Należy uważać, aby nie dopuścić do powstawania pęcherzyków powietrza w podłożu montażowym, ponieważ zasłania to późniejszą akwizycję obrazu.
   3. Przyklej szkiełko nakrywkowe do szkiełka mikroskopowego, nakładając na jego obwód bezbarwny lakier do paznokci. Pozostawić do wyschnięcia na 5 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem. Po zamontowaniu próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
2. Akwizycja obrazu: Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu szerokokątnego zdolnego do wykrywania fluorescencji. Przybliżone maksima emisji fluorescencji/wzbudzenia dla barwnika Alexa Fluor i Hoechst 33342 związanego z DNA przedstawiono w tabeli 3.
3. Wykonuj obrazowanie za pomocą obiektywu olejowego 40X/1,30 NA i rejestruj obrazy za pomocą chłodzonej kamery CCD.

4. Analiza danych

1. Dekonwoluuj obrazy za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu (patrz tabela Materiały) przed zaimportowaniem do klienta OMERO. Znormalizuj ustawienia renderowania dla wszystkich obrazów w tym samym eksperymencie w oprogramowaniu do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych, stosując ustawienia renderowania z kontrolnych komórek normoksycznych do wszystkich innych warunków.
2. Użyj narzędzia Region Of Interest (ROI) w oprogramowaniu do wizualizacji i analizy obrazu mikroskopowego (patrz tabela materiałów), aby wybrać jądra z każdego obrazu. Uzyskaj średnie intensywności dla każdego zwrotu z inwestycji i oblicz średnią i odchylenie standardowe dla każdego warunku, wybierając opcję analizy intensywności, w tym liczbę z zakresu 30-50 komórek.
3. Skonstruuj wykresy punktowe za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów danych (patrz tabela materiałów), wykreślając wszystkie indywidualne średnie wartości intensywności uzyskane w kroku 4.2, aby odzwierciedlić zmienność między komórkami w każdym warunku. Alternatywnie skonstruuj wykresy słupkowe, aby przedstawić średnią intensywność plus odchylenie standardowe powstającego RNA.

Wyniki

Schemat reakcji zestawu do obrazowania RNA przedstawiono na Rysunku 1B. Reakcję tę wykorzystaliśmy do ilościowego oznaczenia całkowitej syntezy RNA w komórkach U2OS po poddaniu ich hipoksji, zarówno na poziomie indywidualnym (pojedyncza komórka), jak i globalnym (populacja komórek). Komórki poddano hipoksji i hodowano w obecności EU. Następnie zostały one utrwalone i permeabilizowane, a wbudowanie EU wykryto za pomocą chemoselektywnego ligowania EU z barwnikiem zawierającym grupę azydkową. Ta reakcja typu „click” prowadzi do emisji fluorescencji, którą można wykryć i ilościowo ocenić przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Rysunek 2A przedstawia typowy wynik tego eksperymentu. Komórki znakowane fluorescencyjnie są zaznaczone pseudokolorem czerwonym, a obraz otwarto w programie Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO). To oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych posiada wbudowane narzędzie ROI, które można wykorzystać do zaznaczania poszczególnych struktur wewnątrzkomórkowych i ilościowej analizy intensywności obrazu w wybranym obszarze. Typowy przykład danych wyjściowych po zastosowaniu tego narzędzia w programie klienckim przedstawiono na Rysunku 2B; intensywności poszczególnych komórek pokazano obok reprezentatywnego obrazu z eksperymentu, który służy jako wizualna weryfikacja poprawności danych.

Intensywności fluorescencji poszczególnych komórek można przedstawić na wykresie rozrzutu, aby ukazać rozkład intensywności poszczególnych komórek w obrębie populacji komórek poddanych działaniu czynnika. Przykład tego typu wykresu znajduje się na Rysunku 2C. Przedstawienie danych o intensywności w ten sposób jest przydatne, ponieważ pozwala na szybkie porównanie wyników zabiegów i wyraźnie demonstruje znaczną heterogeniczność w obrębie populacji komórek traktowanych, która w przeciwnym razie byłaby niewidoczna przy zastosowaniu standardowej reprezentacji danych. Heterogeniczność odpowiedzi jest interesująca w tym eksperymencie, ponieważ mimo zastosowania jednorodnego bodźca hipoksycznego wobec komórek, ewidentne jest, że każda komórka z tej samej populacji monowarstwy reaguje na ten bodziec w inny sposób.

Rycina 2D przedstawia ogólny wynik naszego eksperymentu. Intensywności fluorescencji ze wszystkich komórek w ramach populacji poddanej danej próbie zostały uśrednione, a następnie naniesione na ten wykres słupkowy. Do obliczenia prawdopodobieństwa statystycznego istotnej różnicy każdej grupy badawczej w stosunku do grupy kontrolnej wykorzystano test t-Studenta. Co ciekawe, dane te wykazują statystycznie istotny wzrost globalnej syntezy RNA w czasie, gdy komórki U2OS są poddawane hipoksji (w czasie przekraczającym 1 hr 30 min. *p < 0.01; **p < 0.05 oraz ***p < 0.001 i n > 30). Dane te wskazują, że po dłuższych okresach traktowania hipoksją komórka koncentruje swoje zasoby na produkcji RNA, nawet w tym nieprzyjaznym środowisku hipoksycznym. Traktowanie aktynomycyną D całkowicie znosi intensywność fluorescencji, zgodnie z oczekiwaniami.

Rycina 1. A. System HIF reaguje na zmiany poziomu tlenu w komórkach. Na tym uproszczonym schemacie hipoksja stabilizuje heterodimer HIF, zapobiegając hydroksylacji (-OH) HIF-α przez enzymy prolylowe hydroksylazy (PHDs) oraz jego późniejszej poliubikwitynacji przez białko von-Hippel Lindau (vHL). Stabilizacja HIF prowadzi do aktywacji licznych genów, które pomagają komórce odpowiedzieć na hipoksję komórkową. B. Syntezę RNA można wykryć za pomocą testu Click-IT; komórki są znakowane EU, a po przeprowadzeniu zabiegu reakcja Click wykrywa syntezę RNA, którą można ilościowo określić za pomocą intensywności fluorescencji i mikroskopii świetlnej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2. A. Zrzut ekranu z programu OMERO przedstawiający typowy wynik mikroskopowy po znakowaniu RNA. To oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych pozwala na szybkie wyodrębnienie danych o intensywności na poziomie pojedynczej komórki przy użyciu wbudowanego makra ROI. Zrzut ekranu z wyniku tego polecenia przedstawiono w części B. Ogólną syntezę RNA można wywnioskować z intensywności pojedynczych komórek, której zakres widoczny jest na wykresie rozrzutu C. Formalną reprezentację tych zagregowanych danych przedstawiono w części D. *p < 0.01; **p < 0.05 oraz ***p < 0.001 i n > 30. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.

Odczynniki do hodowli komórkowych

Bufor fosforanowo-solny (PBS) pH 7,2–7,6

pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco (DMEM)

Sterylizowana przez filtrowanie płodowa surowica cielęca (FCS)

Penicylina/streptomycyna

L-glutamina

0,05% trypsyna-EDTA (1%)

70% etanol

Aktynomycyna D (1 μg/μl roztwór zapasowy)

Wyposażenie do hodowli komórek

Sterylne pipety Pasteura

Gama wyrobów z tworzyw sztucznych traktowanych do hodowli komórkowych, odpowiednich do utrzymywania i traktowania komórek w kulturze

Kąpiel wodna ustawiona na 37 °C

Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza

Inkubator ustawiony na 37 °C, 5% CO22

Stacja robocza do badań nad hipoksją ustawiona na 37 °C, 5% CO22, 1% O22

Szkiełka nakrywkowe

pinceta precyzyjna

Komora odliczająca (hemocytometr)

Tabela 1. Odczynniki i sprzęt wymagane do hodowli komórek U2OS.

Składniki reakcji	Liczba szkiełek podstawowych
	1	2	4	5	6	10
Bufor reakcyjny Click-iT RNA (Component C)	428 μl	856 μl	1.7 ml	2.1 ml	2.58 ml	4.3 ml
CuSO4 (Component D)	20 μl	40 μl	80 μl	100 μl	120 μl	200 μl
Azydek Alexa Fluor (przygotowany w kroku 2.3)	1.8 μl	3.7 μl	7.4 μl	9.3 μl	11.28 μl	18.8 μl
Dodatek do buforu reakcyjnego Click-iT (przygotowany w kroku 2.3)	50 μl	100 μl	200 μl	250 μl	300 μl	500 μl
Przybliżona objętość całkowita	500 μl	1 ml	2 ml	2.5 ml	1.5 ml	5 ml

Tabela 2. Koktajle reakcyjne zestawu do obrazowania RNA: Tabela referencyjna szczegółowo określająca stosunek składników master mixu dla reakcji z użyciem zestawu do obrazowania RNA w zależności od liczby szkiełek podstawowych przeznaczonych do barwienia.

Fluorofor	Wzbudzenie (nm)	Emisja (nm)
Alexa Fluor 488	495	519
Hoechst 33342 związany z DNA	350	461

Tabela 3. Maksima emisji/wzbudzenia fluorescencji: Przybliżone maksima emisji/wzbudzenia fluorescencji dla barwnika Alexa Fluor oraz Hoechst 33342 związanego z DNA.

Dyskusja

Opisaliśmy nasze użycie zestawu do obrazowania RNA do zbadania wpływu niedotlenienia na syntezę RNA w komórkach kostniakomięsaka (U2OS). Ta technika jest stosunkowo prosta i dostarcza danych o globalnej transkrypcji na poziomie pojedynczej komórki. Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny protokół dla tego zestawu, aby uwzględnić etykietowanie w komorze hipoksji. Według naszej wiedzy jest to pierwsze doniesienie o zastosowaniu tej techniki do pomiaru zmian w syntezie RNA w hipoksji. Użyty przez nas zestaw do obrazowania RNA nadaje się do eksperymentów w hipoksji, ponieważ nie wymaga izotopów promieniotwórczych i jest technicznie kompatybilny z ograniczeniami pracy w kontrolowanej atmosferze. Typowe problemy związane z tą techniką dotyczą skutecznego utrwalania i etykietowania próbki. Niezwykle ważne jest, aby PFA używany do utrwalania próbki był świeży, a etapy mycia, które następują po reakcji "kliknięcia", były wykonywane zgodnie z opisem, aby zapewnić niskie zabarwienie tła próbki. Jeśli fluorescencja tła staje się problemem, zaleca się ponowne przemycie 1 ml zestawu do obrazowania RNA buforem do płukania reakcji po kroku 2.7.4.

Wspomniany tutaj zestaw do obrazowania RNA stanowi znaczący postęp w technologii obrazowania RNA pod względem łatwości użycia oraz swoistości i szybkości reakcji. Technika ta jest przede wszystkim ograniczona czasem potrzebnym na oznaczenie próbki. Zestaw do obrazowania RNA wymaga 1-godzinnego okresu znakowania, co zapobiega badaniu szybkich zmian w globalnym RNA, które zwykle wystąpiłyby w tym czasie. Z tego powodu nasz pierwszy punkt czasowy jest ograniczony do 1 godziny i 15 minut. Technika ta wiąże się z kilkoma innymi ograniczeniami, które w dużej mierze odnoszą się do kompatybilności odczynników z innymi markerami fluorescencyjnymi, na przykład ten zestaw do obrazowania RNA nie jest kompatybilny z barwieniem falloidyną.

Wszystkie istniejące podejścia do badania syntezy RNA w komórkach opierają się na włączaniu zmodyfikowanych nukleozydów do powstającego RNA i wykrywaniu włączonych znaczników za pomocą różnych środków. Pionierskie podejście opierało się na wykorzystaniu znakowanych radioaktywnie prekursorów RNA, a następnie detekcji za pomocą autoradiografii. Metoda ta doprowadziła do odkrycia etapów cyklu komórkowego i innych ważnych odkryć; Ma jednak wiele wad, takich jak uciążliwy charakter pracy radioaktywnej, długie czasy naświetlania i obrazy autoradiografii o niskiej rozdzielczości⁶. Kolejny postęp w tej dziedzinie wykorzystywał środki immunochemiczne w celu wyeliminowania konieczności radioaktywności. RNA znakowano przez włączenie BrU, a następnie detekcję immunochemiczną. Jednak skuteczne wiązanie przeciwciał wymagało denaturacji kwasów nukleinowych w celu poprawy dostępu do DNA lub RNA, co powodowało utratę morfologii komórek i uszkadzało epitopy wielu białek, uniemożliwiając ich dalsze wykrywanie za pomocą przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie¹³. Wprowadzenie technologii "chemii kliknięć" uprościło etap wykrywania i procedurę w porównaniu z autoradiografią i immunochemią. Technologia opiera się na reakcji cykloaddycji azydkowo-alkinowej Huisgen, w której końcowy alkin 5-etynilurydyny wiąże się z azydkiem sprzężonym z fluoroforem w obecności Cu(I). Reakcja jest specyficzna, szybka, nie wymaga żadnych dodatkowych kroków i jest łatwo kompatybilna z immunochemicznym wykrywaniem innych składników komórek.

Korzystając z tej technologii obrazowania RNA, wykazaliśmy, że komórki w tej samej populacji jednowarstwowej mają różne poziomy syntezy RNA w odpowiedzi na niedotlenienie. Ograniczyliśmy nasz eksperyment tylko do zbadania wpływu produkcji RNA; jednak dzięki temu zestawowi do obrazowania RNA możliwe jest wykonywanie zmodyfikowanych, dodatkowych reakcji multipleksowych, które pozwalają na bardziej złożoną analizę produkcji RNA. Na przykład możliwe jest wtórne barwienie przy użyciu przeciwciała specyficznego dla markerów aktywnej transkrypcji, takich jak poziomy fosforylowanej polimerazy RNA II, a nawet składników maszynerii translacyjnej, aby wskazać ilość tego nowo wytworzonego RNA, który jest przekształcany w białko. Dodatkowe białka, takie jak aktyna, białko, które nie powinno się znacząco zmieniać wraz z niedotlenieniem, mogą być testowane jako dodatkowa kontrola. Co więcej, można testować różne typy komórek, ponieważ jest bardzo prawdopodobne, że różne komórki będą miały różne tempo syntezy RNA, a nawet różne reakcje na niedotlenienie.

Korzystanie z tego zestawu do obrazowania RNA jest dość proste, pod warunkiem, że kroki są wykonywane zgodnie z opisem. Krytyczne kroki w protokole obejmują posiewanie komórek, utrwalanie i barwienie komórek oraz pozyskiwanie obrazu. Ważne jest, aby pokryć komórki o opisanej gęstości, aby zapobiec nadmiernej lub niedostatecznej konfluencji podczas eksperymentów, co znacząco wpłynie na wynik. Ważne jest również, aby używać świeżego utrwalacza, zapewniając wykonanie najlepszej "migawki" komórki i zachować ostrożność podczas mycia komórek po barwieniu, aby zredukować tło do poziomu, który jest akceptowalny dla efektywnej analizy. Wreszcie, metoda pozyskiwania obrazów jest niezwykle ważna, aby uzyskać obrazy o wystarczająco dobrej jakości, aby można je było później analizować. Zalecamy użycie najlepszego dostępnego mikroskopu świetlnego do optycznego badania próbek, takiego jak mikroskop używany w tym protokole, który jest dostępny w większości ośrodków intensywnie prowadzących badania na całym świecie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
U2OS Primary Cells	Europejska kolekcja kultur komórkowych	92022711
PBS	Gibco	14190094
DMEM	Gibco	41966029
FCS	Gibco	10270106
Penicylina/streptomycyna	Lonza	DE17-603E
L-Glutamina	Lonza	BE17-605E
0,05% Trypsyna-EDTA (1%)	Gibco	25300062
Komora hipoksji	Ruskinn	InVivo2 300
Zestaw testowy Click-iT	Invitrogen	C-10329/C10330
pFA	Sigma	76240
Triton X-100	Sigma	X-100
10 M NaOH	Sigma	72068
37% HCl	VWR	20252.335
VectaShield Medium montażowe	Vector Laboratories	H-1400
Actinomycin D	Sigma	A9415
Deltavision Core Microscope	Applied Precision	N/A
softWoRx	Applied Precision	N/A	Określany w tekście jako oprogramowanie do przetwarzania obrazu.
Kamera CCD CoolSnap HQ2	Fotometria	Nie dotyczy
Otwarte środowisko mikroskopowe dla odległych obiektów (OMERO)	OME	N/A	Określane w tekście jako oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazów mikroskopowych.
SigmaPlot v12.0	Systat Software Inc.	Nie dotyczy	Określane w tekście jako oprogramowanie do tworzenia wykresów danych.